胶质细胞源性神经营养因子对大鼠海马神经元N-甲基-D-天冬氨酸诱发电流的保护作用

目的：研究N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparate，NMDA)在大鼠海马神经元上诱发电流的特性以及胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)对大鼠海马神经元NMDA诱发电流(INMDA)的影响。方法：实验于2002-10／2003-02在解放军第二军医大学膜片钳研究室进行，运用常规全细胞膜片钳技术，在原代培养第七八天的大鼠海马神经元上记录INMDA，以及GDNF对INMDA的影响，由Clampex 8．0软件采样系统获得的图形，直接进入Clampfit8．0软件处理数据。结果：NMDA可在海马神经细胞上诱发出大的内向离子流。当钳制电压为-60mV时，细胞外单独给予GDNF(0．1，1．0，10．0μg／L)对静息膜电导及电压门控离子通道无影响。但细胞外同时给予NMDA(100μmol／L)和GDNF(10μg／L)时，INMDA的峰值为(-578．238&;#177;100.493)pA，INDMA的峰值被抑制( t=-7．248，P&;lt;0．01)，峰值受抑制率为(21．502&;#177;7．898)％。洗去GDNF后，抑制作用消失。结论：NMDA诱发的电流呈现出明显的内向整流特性，GDNF能抑制海马神经元NMDA通道的兴奋性，从而发挥神经保护作用。     

急性缺氧对大鼠海马神经元N-甲基-D-天门冬氨酸诱发电流的影响

目的:研究N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-asparate,NMDA)在大鼠海马神经元上诱发电流的特性以及急性缺氧对大鼠海马神经元NMDA诱发电流(INMDA)的影响。方法:运用常规全细胞膜片钳技术,在原代培养第七八天的大鼠海马神经元上记录INMDA,并建立神经细胞体外急性缺氧模型,由Clampex8.0软件采样系统获得的图形,直接进入Clampfit8.0软件处理数据。结果:①在钳制电压为-60mV时,100μmol/LNMDA可在海马神经元上诱发出一大的内向电流,INMDA的峰值为(-745.461±123.731)pA。I-V曲线显示在钳制电压为正值时INMDA呈外向电流,而钳制电压为负值时则为内向电流。给予NMDA后,海马神经元上即刻诱发出内向电流,随后尽管持续给药20s,但INMDA开始发生衰减。②在钳制电压为-60mV时,海马神经元急性缺氧2min后,细胞外给予100μmol/LNM-DA可诱发一大而增强的INMDA,峰值为(-1670.49±202.09)pA,峰值显著增大(t=12.572,P<0.01),峰值增加率为130%。结论:NMDA诱发的电流呈现明显的内向整流性和失敏特性,急性缺氧能提高海马神经元NMDA通道的兴奋性,NMDA受体参与了兴奋毒性的产生。     

急性缺氧对大鼠海马神经元N-甲基-D-天门冬氨酸诱发电流的影响

目的：研究N-甲基-D-天门冬氨酸(N—methyl—D—asparate，NMDA)在大鼠海马神经元上诱发电流的特性以及急性缺氧对大鼠海马神经元NMDA诱发电流(INMDA)的影响。方法：运用常规全细胞膜片钳技术，在原代培养第七八天的大鼠海马神经元上记录INMDA。并建立神经细胞体外急性缺氧模型，由Clampex 8．0软件采样系统获得的图形，直接进入Clampfit 8．0软件处理数据。结果：①在钳制电压为-60mV时，100μmol／L NMDA可在海马神经元上诱发出一大的内向电流，INMDA的峰值为(-745．461&;#177;123．731)pA。I—V曲线显示在钳制电压为正值时INMDA呈外向电流，而钳制电压为负值时则为内向电流。给予NMDA后，海马神经元上即刻诱发出内向电流，随后尽管持续给药20s，但INMDA开始发生衰减。②在钳制电压为-60mV时，海马神经元急性缺氧2min后，细胞外给予100μmol／L NMDA可诱发一大而增强的INMDA峰值为(-1670．49&;#177;202．09)pA，峰值显著增大(t=12．572，P&;lt;0．01)，峰值增加率为130％。结论：NMDA诱发的电流呈现明显的内向整流性和失敏特性，急性缺氧能提高海马神经元NMDA通道的兴奋性，NMDA受体参与了兴奋毒性的产生。     

大鼠海马神经元模拟缺血时谷氨酸诱发电流改变

目的:观察大鼠海马神经元模拟缺血时谷氨酸诱发电流的改变,探讨脑缺血神经元损伤的兴奋毒性机制,为中枢神经损伤的康复提供理论依据。方法:以原代培养的大鼠海马神经元为标本,采用全细胞膜片钳方法观察原代培养大鼠海马神经元模拟缺血时谷氨酸诱发电流改变。结果:当钳制电压为-60mV时,100μmol/L的N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)、α-氨基-3羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)分别诱发一内向电流(INMDA,IAMPA),模拟缺血处理后的神经元INMDA、IAMPA明显增大。结论:升高的兴奋性氨基酸激活突触后膜的兴奋性氨基酸受体后引起神经细胞损伤。     

大鼠海马神经元模拟缺血时谷氨酸诱发电流改变

目的：观察大鼠海马神经元模拟缺血时谷氨酸诱发电流的改变，探讨脑缺血神经元损伤的兴奋毒性机制，为中枢神经损伤的康复提供理论依据。方法：以原代培养的大鼠海马神经元为标本，采用全细胞膜片钳方法观察原代培养大鼠海马神经元模拟缺血时谷氨酸诱发电流改变。结果：当钳制电压为-60mV时，100μmol／L的N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)、α-氨基-3羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)分别诱发一内向电流(INMDA、IAMPA)，模拟缺血处理后的神经元INMDA，IAMPA明显增大。结论：升高的兴奋性氨基酸激活突触后膜的兴奋性氨基酸受体后引起神经细胞损伤。     

新生大鼠海马神经元的急性分离与膜片钳技术

目的:获得适用于膜片钳技术的单个海马神经元。方法:实验于2005-09/11在新乡医学院机能学研究室完成。应用酶消化及机械分离法,急性分离出生3～6d的SD大鼠海马神经元,在倒置显微镜下,选取已贴壁直径约10～15μm的锥体形神经元观察其急性分离效果和细胞活性状态。电生理学的鉴定采用全细胞膜片钳的模式记录电流反应,首先在大鼠海马CA1区锥体神经元诱发出内向离子流。在大鼠海马CA1锥体神经元诱发出内向离子流后,通过程控灌流系统在细胞外液中加1μmol/L的钠通道阻断剂河豚毒素灌流同一神经元,记录内向离子流的变化。结果:①该法可获得形态良好的单个海马神经元,海马锥体细胞具有锥形胞体穴10～20μm雪和厚墩的顶树突特征。活性较好的海马神经元熏胞体呈三角形或椭圆形,表面光亮,细胞膜完整、清晰的,立体感较强。一般有1个较长的顶树突和2个以上较短的基树突。②利用膜片钳技术内向电流被诱发,用1μmol/L河豚毒素完全阻断该电流,说明该内向电流为钠电流。结论:该法可获得形态和生理特性良好的单个海马神经元,证实该方法适用于海马神经元膜片钳研究,对深入探讨药物和毒物对海马离子通道及信号转导机制的作用有重要价值。     

海马脑片锥体神经元钙离子通道动力学特性的盲法膜片钳研究

目的观察大鼠海马脑片盲法全细胞记录技术研究CA1区锥体神经元电压门控性Ca2+通道的动力学特征,为在海马脑片上进行神经科新药开发提供依据。方法选用出生20～30d的Wistar雄性大鼠20只,断头取脑,将海马切为厚400μm的薄片,解剖镜下选CA1区锥体神经元细胞线行盲法全细胞记录。结果大鼠海马脑片CA1区锥体神经元电压门控性Ca2+通道电流具有如下特点:①激活的阈电位偏低,为(-49±9)mV,范围为-65～-30mV(n=23)。②衰减时间常数τ值较大,且变化范围大(100～700ms)(n=12),并且衰减具有Ca2+电流幅值的依赖性。③稳态失活呈现电压依赖性,半失活电压为(-55±10)mV,斜率因子为(5.3±0.9)(n=10)。④当细胞外Ca2+浓度为2.5mmol/L时,Ca2+通道的反转电位为(55±13)mV(n=10)。⑤尾电流成分较为单一,不表现电压依赖性。另外,Ca2+电流对戊脉胺及双氢吡啶类化合物硝苯地平均不敏感。结论海马脑片CA1区锥体神经元上的Ca2+通道主要以N型为主。     

新生大鼠海马神经元的急性分离与膜片钳技术

目的：获得适用于膜片钳技术的单个海马神经元。 方法：实验于2005-09／11在新乡医学院机能学研究室完成。应用酶消化及机械分离法，急性分离出生3～6d的SD大鼠海马神经元，在倒置显微镜下，选取已贴壁直径约10～15μm的锥体形神经元观察其急性分离效果和细胞活性状态。电生理学的鉴定采用全细胞膜片钳的模式记录电流反应，首先在大鼠海马CA1区锥体神经元诱发出内向离子流。在大鼠海马CA1锥体神经元诱发出内向离子流后，通过程控灌流系统在细胞外液中加1μmol／L的钠通道阻断剂河豚毒素灌流同一神经元，记录内向离子流的变化。 结果：①该法可获得形态良好的单个海马神经元，海马锥体细胞具有锥形胞体（10～20μm）和厚墩的顶树突特征。活性较好的海马神经元，胞体呈三角形或椭圆形，表面光亮，细胞膜完整、清晰的，立体感较强。一般有1个较长的顶树突和2个以上较短的基树突。②利用膜片钳技术内向电流被诱发，用1μmol／L河豚毒素完全阻断该电流，说明该内向电流为钠电流。 结论：该法可获得形态和生理特性良好的单个海马神经元，证实该方法适用于海马神经元膜片钳研究，对深入探讨药物和毒物对海马离子通道及信号转导机制的作用有重要价值。     

氟哌利多对大鼠脑缺血海马CA1区锥体细胞持续钠通道电流的影响

背景脑缺血后离子通道通透性的异常和神经细胞内外离子平衡的紊乱是缺血性脑损伤的重要因素,钠通道激活引起的去极化是脑缺血损伤的始动环节.目的采用膜片钳技术测定氟哌利多对脑缺血海马CA1区锥体细胞持续性钠通道电流的影响,分析氟哌利多是否对脑缺血损伤产生保护?设计随机对照动物实验.单位上海交通大学附属第六人民医院麻醉科,上海交通大学附属第一人民医院麻醉科.材料实验于2002-04/2003-04在上海交通大学附属第一人民医院麻醉实验室完成.选择出生10～14 d未断乳的SD大鼠14只,每只鼠各选择2个海马CA1区细胞,共28个细胞,随机分为4组缺血对照组、氟哌利多3 μmol/L组、氟哌利多10 μmol/L组、氟哌利多30μmol/L组,7个/组. 方法酶消化法急性分离全部大鼠脑海马CA1区锥体细胞,通过低氧和无糖法制备神经元缺血模型.选择贴壁良好、呈三角形或星形、胞体较亮,折光性良好、突起明显、胞浆均匀一致、核仁明显的细胞用于实验.采用"Y-tube"系统快速给药,氟哌利多3,10,30 μmol/L组各自给予氟哌利多3,10,30μmol/L,缺血对照组不给药.全细胞膜片钳技术记录各组持续钠电流的基础值以及缺血3 min和5 min时钠通道电流的变化.主要观察指标①脑海马CA1区神经元正常持续钠电流的记录.②脑缺血时海马CA1区神经元持续性钠电流的记录.③不同浓度氟哌利多对脑缺血时持续性钠电流的影响.结果实验选用14只大鼠脑海马CA1区的28个细胞,全部进入结果分析.①脑海马CA1区神经元正常持续钠电流的记录使用钙通道阻滞剂CdCl2 0.5 mmol/L及钾通道阻滞剂TEA 20 mmol/L,在钳制电压-105 mV、刺激电压-30 mV下给予长为400 ms的方波刺激,可记录到一个较小的、激活较晚且持续时间较长的内向电流,经河豚毒素阻断证实为持续性钠电流.②脑缺血时海马CA1区神经元持续性钠电流的记录缺血对照组缺血3 min时持续钠电流增加为正常情况的(1.60±0.21)倍,缺血5 min时持续钠电流增加为正常情况的(2.87±0.45)倍,差异显著(P＜0.05).③不同浓度氟哌利多对脑缺血时持续性钠电流的影响缺血对照组、氟哌利多3,10,30 μmol/L组持续钠电流的基础值分别是(77.42±15.17)pA,(87.44±21.56)pA,(84.13±20.06)pA,(80.22±19.30)pA,组间比较差异无显著性意义.缺血5min后氟哌利多3,10,30μmol/L组持续性钠电流分别为(105.36±17.16)pA,(94.74±18.88)pA,(84.88±13.94)pA,明显低于缺血对照组(218.31±29.34)pA.结论在钳制电压-105mV、刺激电压-30mV条件下,脑缺血损伤时持续性钠电流增加,氟哌利多可能通过抑制持续性钠电流的增强而发挥神经元保护作用.     

睫状神经营养因子对NMDA引起海马神经元损伤的作用

目的：以Glu离子型受体激动剂L-NMDA诱发海马神经元损伤为细胞损伤模型，用JAK/STATs阻断剂PTPi-2阻断睫状神经营养因子（CNTF）已知的经典信号转导途径，观察CNTF非经典信号转导途径的神经保护功能，并探讨其可能机制。方法：用无血清培养液（B27）法行新生24b内大鼠海马神经元原代培养，以培龄13d的细胞为实验标本，分对照组、L—NMDA组、CNTF＋L—NMDA组、PTPi-2＋CNTF＋L—NMDA组，观察活细胞连续照相的形态变化和细胞存活率。结果：L-NMDA可引起海马神经元毒性反应，这一损伤反应在作用时间处于1-2hr之间时呈时间依赖性．在L—NMDA作用浓度介于0-500μmol／L之间时呈剂量依赖性；CNTF可有效抑制L—NMDA对神经元的毒性作用：使用PTPi-2阻断已知的CNTF经典信号转导途径中JAK／STATs后，CNTF保护海马神经元抵抗L—NMDA的损伤作用仍然存在。结论：提示CNTF对海马神经元的保护作用可能通过未知的非基因组途径来完成。