BrdU标记小鼠视网膜祖细胞的研究

为了探讨BrdU(5-Bromo-2′-deoxyuridine)体外标记视网膜祖细胞(RPCs)的适宜浓度,将不同浓度BrdU(0.2、1、5和10μmol/L)与小鼠孕龄(E)17.5dRPCs共培养48h后,进行增殖或分化培养。用免疫荧光检测BrdU标记百分率及细胞分化潜能,用细胞计数法检测其增殖能力,用乳酸脱氢酶(LDH)法检测其细胞毒性。结果发现,0.2μmol/L BrdU不能明显标记RPCs,而1、5和10μmol/L 3种浓度BrdU均可有效标记RPCs,且三者的标记率相近(P>0.05),1μmol/L BrdU无明显细胞毒性,对RPCs增殖、分化亦无明显影响,而5μmol/L和10μmol/L Br-dU均能抑制细胞增殖,并引起LDH释放增加,说明有明显的细胞毒性,10μmol/L BrdU还会阻碍RPCs向MAP2+神经元方向分化,但对其向GFAP+或glutamine synthetase+神经胶质细胞分化无明显影响。本研究表明,1μmol/L BrdU既能有效标记E17.5RPCs,又无显著毒副作用,是较适宜的浓度。     

GnRH-Ⅰ类似物对离体大鼠胃壁细胞三磷酸肌醇含量的影响

目的:探讨促性腺激素释放激素(GnRH)-Ⅰ类似物阿拉瑞林对离体大鼠胃壁细胞内三磷酸肌醇(IP3)含量的影响.方法:体外分离大鼠胃壁细胞并给予不同浓度的阿拉瑞林孵育,利用标记的[3H]-IP3,采用放射免疫分析法检测了壁细胞内IP3的含量.结果:当加入终浓度分别为0.001、0.01、0.1、1 μmol/L的阿拉瑞林时,大鼠胃壁细胞内IP3的含量逐渐增加,呈剂量依赖性,当阿拉瑞林为1 μmol/L时,IP3的含量达到高峰;同时随着药物作用时间的延长,IP3的含鼍也会增加,当阿拉瑞林作用5 min时,IP3的含量达到峰值,随后开始下降;磷酸二脂酶(PLC)抑制剂Compound 48/80温育细胞后,再加入阿拉瑞林孵育,可使IP3的含量轻度增加,但与PLC抑制剂组相比,无统计学意义(P0.05);IP3受体阻滞剂heparin温育细胞后,再加入阿拉瑞林孵育,壁细胞内IP3含量略有上升,与只加入Heparln组相比无统计学意义.结论:在体外GnRH-Ⅰ类似物可使大鼠胃壁细胞内IP3的含量明显增加,说明IP3参与了GnRH-Ⅰ类似物对大鼠胃壁细胞功能调控的信号转导过程.     

大鼠睾丸支持细胞的原代培养与鉴定

目的采用改良方法对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和原代培养,为得到更高纯度和稳定的支持细胞原代培养体系,并建立一种简单、易行的支持细胞鉴定方法。方法采用酶消化法分离大鼠睾丸支持细胞,用Tris-HCI处理后除去生精细胞,实现进一步纯化。并用Feulgen染色法鉴定支持细胞,对支持细胞进行形态学观察。结果培养的支持细胞纯度达到95％,每个睾丸可获取支持细胞约10^7个,Feulgen染色后明显可见支持细胞核内的双极小体。结论酶消化法分离和Feulgen染色法鉴定大鼠支持细胞简单易行,且细胞纯度较高。     

BrdU标记检测大鼠垂体前叶细胞的增殖功能

目的:为了观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞的增殖水平,建立一种快速、准确、灵敏、无同位素污染的检测垂体前叶细胞增殖的方法。方法:应用原代培养大鼠垂体前叶细胞,加入5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记细胞增殖,用抗BrdU抗体进行免疫细胞化学染色,观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力。结果:大鼠垂体前叶细胞可见Br-dU阳性标记内分泌细胞,其细胞核内可见棕褐色阳性颗粒,核浆比例增大,呈颗粒状,提示处于细胞增殖期。免疫细胞双重染色表明,体外培养垂体前叶的生长激素细胞、催乳素细胞、促肾上腺皮质激素细胞均具有一定的增殖能力。结论:BrdU标记是一种有效的标记垂体前叶细胞增殖的方法,为探究大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力提供了理论基础。     

睾丸支持细胞促进体外培养神经元生长的研究

目的　探讨睾丸支持细胞 (SC)对体外培养神经元生长发育的促进作用。　方法　将SCs制备成饲养层和SCs条件培养液 (SCM)后与神经元共培养 ,观察培养细胞的存活数和突起数 ,并应用图像分析仪观察细胞的面积。　结果　SCs饲养层及SCM培养神经元的存活数、突起数和胞体面积明显高于对照组 (P <0 0 1)。　结论SCs对体外培养的神经元具有显著的促生长作用。     

体外贴壁和微囊化生长睾丸支持细胞形态与其功能的相关性

背景：细胞体外培养一直是研究活细胞的主要方法,但体外培养细胞的形态和生长环境与体内环境有很大差异,因此,细胞的生物活性是否能准确反映体内该细胞的状态尚不清楚。 目的：观察体外培养细胞的形态与其生理功能间的相关性。 方法：体外培养不同生长状态的小鼠睾丸支持细胞,一种为贴壁生长状态,细胞呈扁平状;另一种为微囊化生长状态,细胞呈立体球状。分别取2种不同形态睾丸支持细胞的培养液,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,获取相应的蛋白质条带,通过蛋白质相对分子质量的计算来确认睾丸支持细胞分泌蛋白质的种类。 结果与结论：贴壁生长的扁平状的睾丸支持细胞培养液中可辨别出14个条带,蛋白质相对分子质量分布在(17~158)×10³之间;微囊化生长的立体球状睾丸支持细胞培养液中可辨别出10个条带,蛋白质相对分子质量分布在(17~58)×10³之间。提示不同形态的睾丸支持细胞在蛋白质分泌数量和种类上都存在着差异,细胞的形态与其生理功能之间存在着明显的相关性。     

焦油和尼古丁对人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:观察焦油和尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞间粘附分子-1(ICAM-1)在表达的影响.方法:体外分离培养HUVECs,分别与不同浓度焦油(终浓度分别为1mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L和不同浓度尼古丁终浓度分别为(10-9 mol/L、10-7 mol/L、10-5 mol/L、10...     

β-淀粉样蛋白对原代培养大鼠海马神经细胞Sorcin、RyR2mRNA基因表达的影响

目的 研究β-淀粉样蛋白(Aβ)对原代培养的大鼠脑海马神经细胞内钙稳态相关蛋白Sorcin、RyR2mRNA的影响.方法 新生1-3天的Wistar大鼠,取其海马组织,原代培养8d后,用已老化过的Aβ25-35对海马神经细胞进行1μmol/L,10μmol/L和20 μmol/L剂量的染毒,培养24和48 h后分别观察海马神经细胞形态、和海马神经细胞内钙调节相关蛋白Sorcin、RyR2mRNA的基因表达水平.结果 随着Aβ25-35剂量的增加和染毒时间的延长,可发现随着Aβ25-35剂量的增加和染毒时间的延长,海马细胞出现细胞凋亡的比例增加,其中Aβ25-35 20 μmol/L染毒48 h培养海马细胞中出现了大量早期凋亡细胞和少量中期凋亡细胞.实时定量PCR结果显示,10 μmol/L Aβ5-35在对原代细胞染毒24和48 h后Sorcin mRNA的相对表达量为(1.42±0.03)和(1.63±0.02),与对照组相比,表达增加(P＜0.05);20μmol/L Aβ25-35在对原代细胞染毒24h和48 h后Sorcin mRNA的相对表达量(2.11±0.05)和(2.23±0.05),与对照组相比,表达增加(P＜0.05);20 μmo]/L Aβ25-35在对原代细胞染毒24和48h后RyR2mRNA的相对表达量为(1.64±0.03)和(1.95±0.03),表达显著高于对照组相(P＜0.05).结论 Aβ具有神经毒性,可抑制海马神经细胞的生长,可通过作用于钙调节相关蛋白的表达,诱发阿尔茨海默氏病(AD)的发生.     

GnRH类似物对大鼠回肠组织胰高血糖素释放的影响

目的 :研究促性腺激素释放激素 (GnRH)类似物 (阿拉瑞林 )对大鼠回肠L细胞释放胰高血糖素的影响。方法 :应用放射免疫分析法对体内和体外大鼠回肠进行观察。结果 :大鼠回肠灌注GnRH类似物后 ,血中及肠液中胰高血糖素的含量较对照组明显升高 ;体外孵育大鼠回肠组织后 ,在一定浓度范围内 ,孵育液中胰高血糖素含量随GnRH类似物浓度升高而升高 ;当浓度高于一定范围时 ,则随浓度升高而降低。GnRH类似物浓度为 1 .0× 1 0 - 4mol/L时孵育液中胰高血糖素含量是升高的。结论 :GnRH可能对大鼠回肠L细胞分泌胰高血糖素呈现双向调节作用。但是GnRH类似物为 1 .0× 1 0 - 4mol/L ,不论是体内还是体外 ,都可能对肠道分泌胰高血糖素表现促进作用     

黄体生成素类似物对离体大鼠颌下腺细胞分泌神经生长因子的影响

目的:探讨黄体生成素(LH)类似物对离体大鼠颌下腺细胞分泌神经生长因子(NGF)的影响.方法:体外孵育大鼠颌下腺细胞并给予不同浓度的LH类似物,采用酶联免疫分析(ELISA)方法检测上清液中神经生长因子的含量.结果:当加入终浓度为10-6、10-4、10-2U/L的LH类似物孵育颌下腺细胞时,NGF的分泌量随着浓度的升高而逐渐增高;当LH类似物浓度为10-2、100、102 U/L时,NGF的分泌量随LH类似物浓度的递减而降低;同时随着时间的增加,NGF的分泌量也会增加,孵育8 h时达高峰,随后开始下降.结论:在体外LH类似物可双项调节大鼠颌下腺细胞分泌NGF的功能.     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养及缓激肽的作用靶细胞探讨

目的建立稳定的原代大鼠脑微血管内皮细胞培养方法,并在体外探讨不同剂量缓激肽的作用靶细胞,进一步阐释缓激肽开放血脑和血肿瘤屏障的机理。方法运用免疫荧光测定原代培养的脑血管内皮细胞、星形胶质细胞及C6胶质瘤细胞在不同剂量缓激肽作用前后的细胞内钙离子变化,根据给药前后的荧光改变来确定不同剂量缓激肽的作用靶点细胞。结果小剂量缓激肽(终浓度:1μmol/L)可以引起C6胶质瘤细胞内的钙离子水平升高,而只有大剂量(终浓度:10μmol/L~1mmol/L)缓激肽才能触发星形胶质细胞内的钙离子水平升高,脑微血管内皮细胞对大、小剂量缓激肽均无任何反应。结论缓激肽的直接作用靶点是胶质细胞及C6胶质瘤细胞,缓激肽调节脑血管内皮细胞通透性的作用可能需要某些细胞间信使的参与。     

小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法的建立

背景：组织块培养睾丸生殖细胞对污染不容易控制,胰蛋白酶消化接种培养睾丸生殖细胞可能损伤细胞。 目的：建立一种切实可行的小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法。 方法：小鼠睾丸间质细胞的分离采用胶原酶消化法,纯化采用Percoll等密度梯度离心法,活率鉴定采用锥虫蓝拒染法,纯度鉴定采用3β-羟基固醇脱氢酶染色方法。 结果与结论：小鼠睾丸间质细胞纯度达可达90%以上;体外培养的细胞形态完整、增殖速度快、贴壁生长状态良好。说明实验成功建立了小鼠睾丸间质细胞的体外原代培养模型。     

观察大鼠下丘脑NPY神经元的培养及瘦素对其mRNA表达的影响

目的观察大鼠下丘脑NPY神经元的培养及瘦素对其mRNA表达的影响。方法用无血清限定性培养基体外培养新生大鼠的下丘脑神经元,观察其生长状况;用NSE、NF、NPY抗血清检测神经元的鉴定和表达,并对三者阳性细胞的胞体和突起做统计学分析。给予Leptin10-10mol/L、10-8mol/L、10-6mol/L3个浓度,观察leptin对NPYm RNA表达的影响。结果培养的NSE和NF阳性细胞生长至第7天时均达高峰;NPY阳性神经元在培养7～10d时,亦处于一稳定时期。NPYmRNA的表达在给予Leptin10-10mol/L时,与对照组相比无显著性差异;10-8mol/L、10-6mol/L浓度时,表达增强,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论取材于新生大鼠的下丘脑亦可进行体外培养;培养一周时是研究单因素影响神经元的最佳实验时间;在离体环境下,高浓度的leptin(10-8mol/L、10-6mol/L)能促进NPYmRNA的表达,NPY可能表现为抑制GnRH分泌的作用。     

蜂胶水提液对体外培养的血管内皮细胞凋亡的影响

目的：探讨泰山蜂胶水提液对一定浓度的肿瘤坏死因子-α诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用。方法:用消化灌注法收集人脐静脉内皮细胞进行体外原代培养，用终浓度为50 μg/L的肿瘤坏死因子-α诱导其凋亡，培养液中分别加入终浓度为50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的蜂胶水提液干预，共同孵育24h，用流式细胞仪和缺口末端标记技术TUNEL检测细胞凋亡率。结果:模型组内皮细胞凋亡率均明显高于对照组，不同浓度蜂胶组内皮细胞凋亡率明显低于模型组（P＜0.01）。结论:泰山蜂胶水提液能抑制肿瘤坏死因子-α诱导的人脐静脉内皮细胞的凋亡，从而起到保护血管内皮细胞的作用。     

尾加压素Ⅱ对大鼠及人嗜铬细胞瘤细胞体外增殖的影响

目的 研究尾加压素Ⅱ(UⅡ)对大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞及体外培养的人原代嗜铬细胞瘤细胞增殖的影响.方法 以噻唑兰法(MTT法)观察UⅡ对PC12细胞及体外培养的人原代嗜铬细胞瘤细胞增殖的影响.结果 UⅡ对PC12细胞的增殖无明显影响.10-7、10-6mol/L浓度的UⅡ可促进体外培养的原代人嗜铬细胞瘤细胞增殖.结论 UⅡ可促进嗜铬细胞瘤细胞的生长,在嗜铬细胞瘤的发病机制中可能起一定作用.     

兔骨髓间充质干细胞体外BrdU标记最佳时间和标记浓度的筛选

背景:骨髓间充质干细胞是目前极具潜力的细胞和基因治疗的宿主细胞。体外标记是追踪其存活、"归巢"、生长、分化等一系列过程的前提。目的:探索5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记兔骨髓间充质干细胞的最佳时间和最佳浓度。方法:兔骨髓间充质干细胞取自纯种健康新西兰大耳白兔,通过形态学及流式细胞术鉴定分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。观察不同5-溴脱氧尿嘧啶核苷浓度标记及不同5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记时间对兔骨髓间充质干细胞的标记阳性率。结果与结论:流式细胞术检测培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞,生长曲线呈S形。5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞率随标记时间延长以及标记物浓度增加而逐渐增高,40μmol/L及72h标记阳性率达85%~95%。结果提示,应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记骨髓间充质干细胞是安全可靠的,体外标记最佳时间和最佳浓度分别为72h和40μmol/L。     

体外培养人睾丸组织睾酮分泌观察

睾丸各种细胞体外培养已成为研究睾丸功能活动的重要手段，目前已有大量报道。但单一细胞培养不足以反映多种细胞相互作用的整体功能变化，而皋丸组织体外培养则更接近睾丸生理状态，国外在这方面的文献寥寥无几，国内则尚来见类似研究报告。我们用4例取自人体的睾丸组织进行了为期2周的培养观察，并对其分泌的睾酮进行检测，现报告如下。     

尼古丁对大鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨尼古丁对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和凋亡的影响.方法用终浓度为100 μmol/L的尼古丁作用于体外培养的大鼠VSMCs 24h,不加尼古丁的细胞作为对照组,应用荧光显微镜和扫描电子显微镜观察各组细胞凋亡的形态,BrdU-ELISA和流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡率,进而确定尼古丁对VSM...     

褪黑激素对17—β—雌二醇诱致的大鼠垂体催乳素瘤细胞增殖的抑制作用

观察不同浓度的褪黑激素 (Melatonin ,MLT)对原代培养的大鼠垂体催乳素瘤细胞增殖的影响。用 80～10 0g体重的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠 ,皮下埋置雌二醇诱致垂体催乳素瘤 (prolactinoma)形成后 ,取出瘤体 ,经消化、过滤、离心 ,用SFFD培养基重悬细胞 ,得细胞悬液 ,浓度为 0 75× 10 6/mL ,转入 2 4孔培养板中并加入相应剂量的MLT使其终浓度 (mol/L)分别为 10 -5、10 -7、10 -9、10 -11和 10 -13 ,另设空白对照组 ,于 37℃、5 %CO2 条件下培养 1h ,再在每孔中加入 2 μCi [3H] TdR继续孵育 2 4h后测counts/min值。结果显示 ,在对照组和各剂量 (mol/L)MLT用药组 10 -5,10 -7,10 -9,10 -11和 10 -13 的 [3H]-TdR掺入率分别为 2 0 38 75± 186 84,142 1 75±6 4 49,12 38 2 5± 6 1 72 ,92 4 0 0± 6 4 44 ,10 33 2 5± 12 7 2 2和 110 3 2 5± 15 1 5 3counts/min。表明 10 -5～10 -13mol/L的MLT能有效抑制 [3H] TdR在原代培养的垂体催乳素瘤细胞中的掺入 ,P <0 0 0 1。其中 ,以 10 -9mol/L的MLT的抑制作用最强 ,达 5 4 6 8%。提示在培养条件下 ,10 -5～ 10 -13 mol/LMLT能有效地抑制E2 诱导的垂体催乳素瘤细胞的增殖。     

卵圆细胞体外扩增过程中分子标志物的变化及意义

目的 探讨体外大量扩增卵圆细胞并保持其干细胞生物学特征的细胞培养方法.方法用RPMI 1640加上15%的胎牛血清和终浓度为20μg/L表皮生长因子(EGF)培养卵圆细胞株OC3,每隔5代收细胞并用逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、酶细胞化学等方法检测OV-6、c-kit、γ-谷氨酰转肽酶、胎盘型谷胱甘肽硫转移酶、M2型丙酮酸激酶、L型丙酮酸激酶和白蛋白等分子标志物.结果卵圆细胞株OC3在体外大量扩增,不同程度表达OV-6、c-kit、γ-谷氨酰转肽酶、胎盘型谷胱甘肽硫转移酶、M2型丙酮酸激酶等幼稚肝细胞的生物标记,而不表达L型丙酮酸激酶和白蛋白这类成熟肝细胞的分子标记.结论用RPMI 1640加上15%的胎牛血清和终浓度为20μg/L的鼠源性EGF,在体外能大量扩增卵圆细胞株OC3,至第79代仍有很高的增殖活性,同时仍保留肝内干细胞的生物学特征.