霉菌平板上生长细菌应如何判断

霉菌平板上生长细菌应如何判断济南市药品检验所（２５０００１）江腊梅，季永成卫生部颁发的《药品卫生检验方法》￣［１］中规定，须注意细菌菌落与霉菌菌落的区别。而《药品微生物学及检验技术》￣［２］一书中指出：霉菌平板上生长细菌一般不计数。在实际工作中，霉菌...     

检测糖(蜜)浆制剂中酵母菌的一点体会

口服液体制剂在生产和贮藏中常易污染酵母菌,污染严重时会引起冲盖爆瓶,直至发生伤人事故。酵母菌的检测按部颁规定用虎红琼脂培养基,以该培养基上霉菌和酵母菌生长总数判断制剂是否符合卫生标准。总的来说,笔者认为虎红琼脂培养基对检测口服液体制剂霉菌总数不失为是较好的培养基,但我们在抽验中也发现某些糖(蜜)浆制剂同一批号中有明显产气爆瓶现象的,在虎红培养基上却不易检出酵母菌,经用浙江省药检所(84)浙药检发字第70号文规定“酵母菌检验方法”中     

酵母菌的计数

<正> 部颁药品卫生标准规定,口服液体制剂霉菌和酵母菌总数:每毫升不超过100个。其法取1:10供试品稀释液1毫升,加于灭菌平皿内,以倾注法浇成虎红平板,待凝后,于25°-28℃培养72小时后计数。酵母菌在该板上的典型菌落为边缘整齐、表面光滑湿润的奶油色(极少数呈粉色或红色)圆形菌落(极少数呈多角形)。但有的腐生性细菌(革兰氏阳性杆菌)在此板上生长的菌落与酵母菌菌落酷似,肉眼难以鉴别,因此必须作显微检查才可判别。其法:以白金耳挑取该菌落少许于洁净的载玻片上,滴加蒸馏水一滴,研匀,加盖玻片,先在低倍镜后在高倍镜下检查有否酵母细胞。是芽殖还是裂殖。如果是芽殖那就看它是一端芽殖、二端芽殖、三端芽殖或是多边芽殖。根据我们六年来的检查,发     

芦荟在细菌培养基中的作用探讨

目的 在实验基础上了解细菌在用芦荟替代蛋白陈、牛肉膏、血液成分制备培养基上的生长情况。分析芦荟在细菌培养中的作用和应用性价值。方法 用常规方法制备普通营养琼脂培养基和血平板，再用一定量的芦荟源液替代普通营养琼脂中的蛋白胨、牛肉膏和血平板中的血液成分制备培养基，将一定量的细菌接种于含不同营养成分的培养基中培养，然后进行结果比较，结果 致病性金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，大肠埃希氏菌均可在用芦荟替代蛋白胨，牛肉膏，血液成分的培养基中生长，且在一定时间内菌落直径均比普通营养琼脂中的菌落大。结论 一定量的芦荟成分可替代蛋白胨、牛肉膏或血液成分制备培养基，进行体外细菌培养。     

淡豆豉炮制至“黄衣上遍”过程中微生物菌群动态变化的初步研究

目的:初步研究淡豆豉发酵炮制至"黄衣上遍"过程中微生物菌群种类和数量的动态变化,为探讨淡豆豉炮制机制奠定基础。方法:参照2010年版《中国药典》按本实验室优化的炮制工艺制备淡豆豉(制备工艺见文章中)。取发酵炮制至"黄衣上遍"过程中不同时间点的样品,分别用细菌、霉菌和酵母菌选择性培养基培养并分离纯化,进行菌落计数;同时对分离纯化的微生物用肉眼和镜检观察进行菌种的初步鉴定。结果:淡豆豉炮制至"黄衣上遍"过程中,随着炮制时间的延长,细菌、酵母菌、霉菌数量呈现上升趋势,各菌群在发酵前4 d均有明显上升,细菌菌落数量由1×103.2CFU/mL增长到1×1010.6CFU/mL,霉菌菌落数量由1×102.1CFU/mL增长到1×109.8CFU/mL,酵母菌菌落数量由0增长到1×108.8CFU/mL;发酵4 d以后,各菌群的数量变化平缓;发酵过程中细菌数量明显高于霉菌和酵母菌,优势细菌主要为革兰阳性杆菌、霉菌主要为曲霉和毛霉、酵母菌主要为子囊菌酵母。结论:淡豆豉炮制是多菌种混合发酵的过程,其种类、数量随着发酵时间不同发生了明显变化。     

影响金铁锁毛状根生长及皂苷积累的因素

目的优化金铁锁毛状根液体培养基、碳源、激素和培养条件,促进毛状根生长及皂苷的积累。方法将毛状根置于添加了碳源和植物生长调节剂的液体培养基中培养,观察其形态、色泽变化,测定其生物量和皂苷含量。结果金铁锁毛状根在含有30 g.L-1蔗糖的12MS中生长最快;6-BA、2,4-D均能促进皂苷的合成,但对毛状根的生长有抑制作用;添加少量的NAA、IAA、IBA都能促进毛状根的生长和皂苷产量的提高,当分别添加0.5 mg.L-1NAA、IAA、IBA时,皂苷产量较对照品提高53.42%,25.55%,79.60%。结论通过液体培养基、碳源、激素等因素的改变,可以提高金铁锁毛状根的生长速度和皂苷的含量。     

类星形念珠菌致腹腔炎1例

患者，男，2岁，因间断性腹痛，3月余，发热体温高至38．5C伴有腹泻，最初怀疑为肠炎，口服氟哌酸2周，同时静脉点滴氧哌嗪青霉素2周效果不佳。于今年2月17日入院，入院后改用先锋必，环丙沙星1周没有明显效果，2月25日在全麻下行剖腹探查术，术中取引流液培养，有霉菌生长。停用抗生素，术后2天再次送引流液培养出霉菌，在治疗中改用达复康，1周后症状明显好转，于3月17日痊愈出院。细菌分离鉴定：取引流液接种沙保弱液体培养基，增菌28C72小时后呈混浊生长，转种血琼脂平板上经28C48小时培养，生长出奶油色样，呈星形，边缘呈放射形，湿…     

牛大力毛状根生长及培养液中碳源、氮源与磷源利用研究

目的探讨牛大力毛状根的生长曲线研究,研究不同培养基对其生物量积累的影响,以及在其生长过程中对培养液中碳源(蔗糖)、氮源(NH_4~+与NO_3~-)与磷源(PO_4~(3-))的吸收利用情况。方法在1/2 MS培养基中,每5 d取样称量鲜重与干重考察毛状根的生长曲线。使用5种培养基(MS、1/2MS、1/4 MS、B_5、WPM)培养毛状根,30 d后统计生物量。利用离子色谱分析方法检测培养液中蔗糖、NH_4~+、NO_3~-与PO_4~(3-)含量。结果毛状根的生长表现为"慢-快-慢"的趋势,呈"S"型曲线,生长30d进入稳定期。不同培养基对牛大力毛状根生物量的积累具有显著差异,1/2 MS培养基的营养成分及比例最有利于毛状根生物量的积累。在毛状根生长过程中,1/2 MS培养基中的碳源、氮源与磷源均被毛状根充分吸收利用,呈"快-慢"或"慢-快-慢"规律。当毛状根进入稳定期时,蔗糖、NO_3~-与PO_4~(3-)均被全部消耗殆尽,仅检测到少量的葡萄糖、果糖与NH_4~+。结论牛大力毛状根的生长周期为30 d,在1/2 MS培养基中最有利于生物量积累,能充分吸收代谢培养液中的蔗糖、氮源与磷源等营养成分。     

植物激素对丹参毛状根生长和丹参酮生物合成的影响

目的:研究植物激素对固体培养丹参毛状根生长和丹参酮ⅡA生物合成的影响。方法:组织培养法诱导毛状根、超声法提取丹参酮、高效液相色谱法测定丹参酮。结果:在1/2 MS培养基中添加一定浓度GA3与6-BA的组合激素对丹参毛状根生长有抑制作用,最高抑制作用达到100%(毛状根死亡),而添加1.0 mg/L KT与1.0mg/L IBA的组合激素则可以明显促进丹参毛状根的生长,生长量是对照的3.251倍;添加0.2 mg/L NAA和3.0mg/L 6-BA与3.0 mg/L NAA的组合激素时丹参毛状根体内丹参酮ⅡA的总含量最高;添加2.0 mg/L 6-BA则对丹参酮ⅡA的生物合成有显著促进作用,丹参酮ⅡA浓度是对照的3.012倍。结论:在丹参毛状根培养基中加入不同的植物激素及其组合激素对毛状根的生长和丹参酮ⅡA的生物合成有显著的影响。     

金铁锁毛状根生长形态对生物量积累的影响

目的研究碳源、氮源和IAA等对金铁锁毛状根的侧根发生频率、空间排布和平均长度的影响,揭示毛状根空间构型和生长的关系。方法在悬浮培养条件下,通过改变培养基中碳源、氮源和IAA浓度,观察和分析金铁锁毛状根空间形态和生物量的变化。结果当培养基中添加30g/L蔗糖、NO_3~-/NH_4~+为28∶2(氮总浓度为60mmol/L)和0.5mg/L IAA时,单位长度侧根生长数、根的生长点数量、根的生长级数等参数均达到最佳,毛状根的长势较好,生物量最大。结论通过改变培养基中碳源、氮源和生长素浓度,获得有利于金铁锁毛状根生长的空间构型,促进毛状根生物量积累。     

RiT-DNA对四倍体菘蓝的遗传转化及其植株再生

目的：建立一套利用发根农杆菌转化四倍体菘蓝的有效方法。方法：利用发根农杆菌R1601,ASTCC15834和A4感染四倍体菘蓝的子叶外植体诱导出毛状根,再将毛状根置于含不同激素的培养基上诱导再生植株。结果：3种农杆菌具有不同的诱导能力,毛状根在不含激素的MS固体培养基上快速生长并表现出典型的毛根性状：多分枝、多根毛且无向地性,经冠瘿碱分析证明确已被转化。毛状根在无激素的MS增养基中悬浮培养两周后其生物量增加近35倍,在含BA的MS固体培养基上不经愈伤组织阶段直接分化出不定芽,所有不定芽都可在生根培养基上生根长成再生植株。冠瘿碱检测表明Ri质粒的T-DNA部分已转化到再生植株基因组中。结论：发根农杆菌可以诱导四倍体菘蓝长出毛状根,经诱导出的毛状根具有再生完整植株的能力。     

肉豆蔻饮片微生物计数检查方法研究及其在霉变过程中菌落总数的测定

目的：研究肉豆蔻饮片微生物限度检查的方法,分析不同霉变程度肉豆蔻饮片需氧菌、霉菌及酵母菌菌落总数的变化趋势。方法：参照2015年版《中国药典》四部“通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”进行方法的建立和验证,采用建立的方法对霉变过程中的肉豆蔻饮片进行微生物计数。结果：肉豆蔻饮片对方法适应性验证的5种菌均有抑制作用,需采用培养基稀释法进行检验。随着霉变程度加大,肉豆蔻饮片需氧菌、霉菌、酵母菌菌落总数均呈升高趋势,且加速0-6天时增长缓慢,6-9天呈爆发式增长,9-39天匀速增长。结论：该方法可用于肉豆蔻饮片的微生物计数。建议对易霉变药材肉豆蔻增设需氧菌、霉菌、酵母菌总数限值,以保障用药安全。     

诱导子对颠茄毛状根有效成分及代谢关键酶基因表达的影响

目的提高药用植物颠茄Atropa belladonna有效成分的产量,为颠茄在实际生产中提供经济高效的处理方法,为相关药用植物次生代谢的机制研究提供基础性参考。方法通过向培养基中添加4种不同诱导子,包括茉莉酸甲酯(MJ)、硝酸银(AgNO_3)、水杨酸(SA)、酵母提取物(YE),研究诱导子对颠茄毛状根有效成分的积累及代谢途径中的关键酶基因1,4-丁二氨-氮-甲基转移酶(putrescine N-methyl transferase,pmt)基因、托品酮还原酶-I(tropinone reductase-I,tr I)基因和莨菪碱6-β-羟化酶(hyoscyamine-6-β-hydroxylase,h6h)基因表达的影响。实验将0.5 g新鲜颠茄毛状根接种于盛有B5液体培养基的三角瓶中,暗培养12 d后,将培养基更换为含有诱导子的4种新培养基,相同条件下再培养2 d后采集毛状根样品,测定每瓶毛状根的鲜质量、干质量、部分生理指标、托品烷类生物碱的量及3种关键酶基因的表达量。结果 MJ抑制了颠茄毛状根的生长及托品烷类生物碱的产生,pmt、trI基因的表达量与对照组相比也有所下降;AgNO_3虽然抑制了毛状根的生长,但却显著提高了托品烷类生物碱的含量,同时pmt、trI、h6h基因的表达量均升高;SA对颠茄毛状根的生长影响不显著,但使东莨菪碱的含量提高;YE对颠茄毛状根的生长及托品烷类生物碱的含量均有促进作用,pmt、trI、h6h基因的表达量也相应升高。结论 AgNO_3是提高颠茄毛状根中托品烷类生物碱含量的最佳诱导子,YE在促进颠茄毛状根生长的同时也可促进其次生代谢。推断诱导子通过调控某种或某几种关键酶基因的表达来影响生物碱的代谢合成,为生产中提高颠茄毛状根药用成分含量提供了可参考的方法。     

短葶飞蓬毛状根的诱导及黄酮类成分测定

目的通过诱导培养短葶飞蓬毛状根产生有用次生代谢产物。方法利用发根农杆菌C58C1感染短葶飞蓬无菌苗叶盘诱导毛状根,小量提取脱农杆菌完全的毛状根DNA用于rol基因的PCR检测,经PCR检测阳性的毛状根采用4种不同液体培养基振荡扩大培养,对于获得的毛状根系测定其中总黄酮和灯盏花素的量。结果发根农杆菌感染10min共培养2d可取得较好的转化效果,继代培养约两个月后可脱菌完全,获得的毛状根PCR检测阳性率为52.9%,4种液体培养基中B5培养基更适合于毛状根的生长,毛状根中总黄酮量要明显高于正常根中的量,但灯盏乙素的量明显低于正常根中的量。结论通过短葶飞蓬毛状根大量培养可获取灯盏黄酮类药用成分。     

应用显色培养基检测沙门氏菌的初步研究

目的：利用特异性酶法鉴定致病的特点,建立一种用来检测食物中毒和肠道腹泻中沙门氏菌的显色快速检测方法。方法：将带菌标本增菌后接种沙门氏菌显色培养基（简称“CAS”）。结果：沙门氏菌在CAS平板上呈现特定型的红色菌落,非沙门氏菌呈现无色菌落或蓝色菌落。结论：用CAS选择性平板分离沙门氏菌较易鉴别,不需通过任何仪器,仅通过观察菌落颜色既在24h用肉眼对沙门氏菌进行鉴定,缩短了检验周期,使用方便,提高了检出率。     

冬虫夏草菌的动态产孢量及抗异能力

目的：研究冬虫夏草菌的生长速度和动态产孢量，揭示产孢规律和条件，探索人工繁殖的可能及评估其在对虫害生物防治中的应用潜力；测定它的抗异活性和抗菌谱，为对其活性产物的性质研究打下基础。方法：测量虫草菌株在真菌培养基生长时的菌落直径变化，用孢子计数法跟踪测定普通培养基和水琼脂上单菌落的动态产孢量并与相近虫草菌进行对比分析，用琼脂块法测定培养菌丝对致敏菌的抗异活性，测量比较抗菌圈大小和总结抗菌谱。结果：在PDA等3种常规真菌培养基上，CY－8202的菌落扩展与进时间呈线性关系。动态产孢量的测定表明，该菌株在适宜培养基上的单菌落产孢量可达10^7以上，并随着时间的延长而增长，大约200h后增长趋于平缓。对22个致敏菌株的抗菌实验显示，CY－8202培养菌丝对革兰氏阳性的枯草杆菌、四联球菌、白色葡萄球菌以及革兰氏阴性的普通变形杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌和沙门氏菌等7株细菌有较强的抑制能力，对3株霉菌和1株放线菌有轻微抑制，对酵母菌未见抑制影响。结论：虫草菌丝的生长和产孢力是有效侵染寄主的两个重要因素，但菌丝生长速度不宜作为生长力强弱的唯一判断指标，菌丝的穿透力更加重要；具有超量产孢能力是虫草菌株强侵染力的一个重要标志。抗异活性表明冬虫夏草菌具有分泌比虫草菌素更广谱的抗生素的能力。     

决明毛状根诱导及激素与诱导子对毛状根生长和蒽醌类化合物合成的影响

目的研究激素与诱导子对决明毛状根生长和蒽醌类化合物合成的影响。方法用发根农杆菌LBA9402感染决明Gassia obtusifolia外植体，建立决明毛状根培养系统。结果NAA为决明毛状根培养的最适外源激素，培养基中添加0．05％NAA可使毛状根中5种蒽醌类化合物总和提高4倍。黑曲霉诱导子对毛状根生长影响不大，却明显促进蒽醌类化合物的形成，其中每50mL培养基加入2．0mL诱导子可使蒽醌类化合物总量增加2倍多。茉莉酸(JA)对决明毛状根中蒽醌类化合物合成具有明显的促进作用．其中10μmol/L作用最强，蒽醌类化合物总量比对照提高73％，JA对毛状根生长有抑制作用，但不太显著。结论为进一步筛选适宜的决明毛状根培养系统并调控次生代谢产物的研究奠定了基础。     

菘蓝高效遗传转化系统的建立

目的:建立一套发根农杆菌高频转化菘蓝植物的有效方法。方法:采用ATCC15834和RI1601两种发根农杆菌并通过超声波处理对草本植物菘蓝的下胚轴、子叶、带子叶下胚轴进行遗传转化,比较了共培养与否对毛状根诱导的影响,并进行了不同抗生素浓度的抑菌效果筛选和毛状根增殖培养基的筛选。结果:浸染后的外植体在不经过共培养阶段的情况下,诱导后的外植体成活率高,毛状根发根时间早,发根率高;经超声波处理后的外植体其毛状根诱导率比未处理高一倍多;同时,筛选出抗生素浓度为400 mg/L时为毛状根生长的最佳抑菌浓度;毛状根在液体培养基中的增殖速度是固体培养基的2～3倍,是普通根的37倍。结论:利用新的方法成功建立了菘蓝的毛状根诱导体系。     

甘草Ri质粒转化及不同理化因子对甘草毛状根生长的影响

目的:研究甘草毛状根的诱导及外界因子对其生长的影响。方法:用发根农杆菌Agrobacterium rhizo-genesLBA9402和R1601感染甘草Glycyrrhiza uralensis外植体。结果:2种发根农杆菌均能诱导甘草产生毛状根,LBA9402比R1601表现出较强的对甘草的感染能力,下胚轴的转化率高于子叶。在WP培养基上毛状根生长最快。光照对毛状根生长有抑制作用。毛状根中5种黄酮类化合物的总量比愈伤组织中高1.5倍,其中甘草查耳酮含量是愈伤组织中的15.5倍。结论:本实验所建立的甘草毛状根培养系统,为研究甘草毛状根大量培养生产黄酮类化合物奠定了基础。     

竹节参毛状根培养体系的建立及人参皂苷Re的合成

目的:建立竹节参毛状根的诱导方法和培养体系,并对其生长特性和所合成的人参皂苷Re的含量进行分析。方法:用卸甲型根癌农杆菌C58C1菌株感染竹节参预培养的地上茎,诱导毛状根产生,在1/2MS培养基上扩大培养并测定其生长特性;用PCR检测竹节参转化毛状根的T-DNA及HPLC测定人参皂苷Re含量。结果:C58C1菌株能诱导竹节参地上茎产生毛状根,在浸染25min时,诱导率最高,为90%;经PCR检测,C58C1菌株Ri质粒上的rolB基因已经整合到竹节参毛状根基因组中;HPLC检测发现,竹节参毛状根均能合成人参皂苷Re,其中含量最大的是1/2MS液体培养的单克隆PJ8,其值高达60.26 mg.g-1。结论:初步建立了竹节参毛状根的诱导和培养方法,为大规模培养竹节参毛状根以生产高含量的人参皂苷Re奠定了实验基础。