大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良

目的探讨一种简单易行的大鼠胰岛细胞培养方法,获取尽可能多的高质量胰岛,并寻找进行体外实验研究的最佳时间和条件。方法运用胶原酶原位灌注法分离胰腺,Ficoll400纯化胰岛细胞,双硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛,运用倒置显微镜观察细胞生活状态,放免法检测胰岛素分泌考察胰岛功能。结果每只大鼠可分离438±27个胰岛/胰腺,细胞存活率为92.3±2.3%,GSIS实验中胰岛素释放指数SI为3.25±0.26。结论本分离纯化方法可获得数量多,质量高的胰岛细胞,为原代胰岛细胞的体外研究提供实验条件。     

体外培养大鼠胰岛细胞的观察

目的：对大鼠胰岛细胞培养方法进行改进并对胰岛细胞进行体外观察。方法：选用 ３～４ 周龄 Ｗ ｉｓｔａｒ 大鼠胰腺,用 ２００ Ｕ／ｍ ｌ的 Ｖ 型胶原酶消化,１０８ μｍ 孔径尼龙筛网滤过消化产物后,得到大小较一致的细胞团,加入含有１１１ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ 葡萄糖的 Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ１６４０ 培养液内,进行体外培养。利用倒置相差显微镜、透射电镜、免疫组织化学技术对胰岛 β细胞形态和结构进行观察;应用放射免疫技术对胰岛素进行检测和分析。结果：胰岛细胞可以在体外培养 １７ ｄ。培养初期,细胞形态及分泌功能较稳定;随培养时间延长,细胞逐渐破碎死亡,上清液内胰岛素水平也持续下降。结论：改进后的胰岛细胞培养方法简单可靠,细胞培养至 ４８～７２ ｈ 时,可用于实验研究。     

大鼠胰岛β细胞分离与原代培养方法探讨

目的 探索胰岛B细胞分离纯化方法和适宜的原代培养条件.方法 正常Wistar大鼠,胶原酶消化及网筛过滤初步纯化胰岛,双硫腙染色及葡萄糖刺激实验鉴定胰岛及其活性.胰岛以胰蛋白酶和DNA酶消化成单细胞悬液,在2.8 mmol/L葡萄糖条件下,用荧光激活流式细胞分选(FACS)β细胞.免疫组化法及葡萄糖刺激实验鉴定分选的β细胞及其活性,所分选β细胞置于不同浓度葡萄糖和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)50μmol/L浓度的Ham's F-10培养基中培养24 h,观察不同浓度葡萄糖及IBMX对β细胞活性的影响.结果 可获(550±95)个胰岛/只大鼠,活性良好.FACS后,可得约5688个β细胞/只大鼠,回收率(93.69±1.26)%,纯度(85.5±1.24)%.原代培养24 h后,10.0 mmol/L及16.0 mmol/L葡萄糖中β细胞活性较高,死亡和凋亡也较少.结论 胰岛的单细胞悬液,在外界葡萄糖浓度为2.8 mmol/L时可以FACS对β细胞进行分选纯化;原代培养24 h后,在外界葡萄糖浓度10.0～16.0 mmol/L时,β细胞有较高存活率和活性.     

SD大鼠乳鼠胰岛细胞体外培养方法探讨

目的 探讨一种获得足量、纯度高和功能良好的大鼠胰岛细胞的体外培养方法。方法采用胶原酶对胰腺组织进行分次短时间消化；细胞接种18h时，倒置显微镜下观察细胞生长情况；将细胞转入新的培养板培养，定期收集培养液上清。分别检测胰岛素、淀粉酶含量及葡萄糖刺激下的胰岛素分泌水平。结果 SD大鼠乳鼠原代培养的胰岛细胞中成纤维细胞明显减少，双硫腙可染率85％-90％，锥虫兰染色细胞活力90％以上，培养7～11d的细胞分泌功能正常。结论 用胶原酶反复短时间消化胰腺组织，细胞接种后及时转板的方法可获得纯度较高、生长良好、适合实验研究的胰岛单层细胞。     

SD大鼠乳鼠胰岛细胞体外培养方法探讨

目的探讨一种获得足量、纯度高和功能良好的大鼠胰岛细胞的体外培养方法。方法采用胶原酶对胰腺组织进行分次短时间消化;细胞接种18 h时,倒置显微镜下观察细胞生长情况;将细胞转入新的培养板培养,定期收集培养液上清。分别检测胰岛素、淀粉酶含量及葡萄糖刺激下的胰岛素分泌水平。结果SD大鼠乳鼠原代培养的胰岛细胞中成纤维细胞明显减少,双硫腙可染率85%~90%,锥虫兰染色细胞活力90%以上,培养7~11 d的细胞分泌功能正常。结论用胶原酶反复短时间消化胰腺组织,细胞接种后及时转板的方法可获得纯度较高、生长良好、适合实验研究的胰岛单层细胞。     

改良的新生猪胰岛细胞体外培养

介绍一种通过细胞分离及体外培养获得大量新生猪胰岛细胞团的方法，新生猪胰腺经0．5－1mg.ml^-1的V型胶原酶消化8－12min，再经体外培养7d，可获大量纯化的胰岛细胞团，同时，新生猪胰岛内的B细胞不仅胰岛素分泌功能良好，而且其超微结构正常，提示新生猪胰岛细胞可作为异种移植治疗1型糖尿病重要的供体来源。     

改良大鼠血管平滑肌细胞的原代培养

目的探讨提高大鼠血管平滑肌细胞原代培养效率的方法。方法采取组织块贴壁法进行原代培养,高糖DMEM培养基中加入血小板源性生长因子-B(platelet-derived growth factor-b,PDGF-B),用细胞形态学及免疫组织化学法对血管平滑肌细胞鉴定。结果原代培养,4～6天可见细胞长出,2周可以传代;传代培养,1周可以传代1次。镜下可见细胞以梭形为主,呈"峰-谷"状生长,免疫组化染色可见细胞浆内有大量染成棕黄色的肌丝。结论在采用组织块贴壁法进行培养时,加入PDGF-B培养,可获得纯度高、活性好的血管平滑肌细胞,并缩短了培养周期。     

一种改良的大鼠原代肝细胞培养方法

离体培养的大鼠肝细胞在药物代谢,药物毒理学,致癌作用,肝病机理等方面的研究非常普遍[1].体外培养大鼠肝细胞的方法很多,大致分为非酶法和酶法.     

改良静脉糖耐量试验对Ⅱ型糖尿病胰岛β细胞功能的研究

为研究Ⅱ型糖尿病（Ｎｏｎ－Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｉｂｅｔｅｓｍｅｕｉｔｕｓ，ＮＩＤＤＭ）者胰岛β细胞功能，采用改进的多样本静脉糖耐量试验（ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙｓａｍｐｌｅｄｉｎｔｅｒａｖｅｎｏｕｓｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ＦＳＩＧＴ），对正常人、ＮＩＤＤＭ者进行分析。结果表明，与正常人相比，ＮＦＤＤＭ者胰岛β细胞胰岛素分泌Ⅰ相糖尿病曲线下面积（ａｒｅａｕｎｄｅｒｃｕｒｖｅｏｆ     

老龄SD大鼠胰岛β细胞形态功能研究

目的观察3组不同月龄SD大鼠糖脂代谢指标变化,了解在基础及葡萄糖刺激下胰岛β细胞胰岛素分泌、结构变化与老龄糖耐量减退的关系,探讨老龄糖耐量受损的机制。方法采用免疫组化、细胞体视学、透视电镜等方法观察5~6、11~12、20~24月龄SD大鼠胰岛及胰岛β细胞形态及胰岛素分泌水平;将胰岛β细胞分离后与两种不同质量浓度的葡萄糖培养,观察葡萄糖刺激下老龄大鼠β细胞胰岛素分泌水平。结果20~24月龄大鼠体质量、空腹血糖及血脂水平有增高;11~12、20~24月龄大鼠血清中游离脂肪酸(FFA)水平显著增高;对葡萄糖刺激出现峰值降低、达峰时间延迟;胰岛β细胞体积增大和细胞内胰岛素分泌量减少。老龄胰岛β细胞内线粒体和内质网肿胀,空泡变性。从11~12月龄大鼠开始,胰腺中平均胰岛面积随着年龄的增加而减少;但每个胰岛中平均胰岛β细胞的面积比例却有增加。结论老龄鼠在空腹血糖正常时即已具备胰岛素抵抗的某些特征;老龄大鼠胰岛β细胞虽然有面积比例增大,但β细胞基础和葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能减低。提示一旦糖代谢受损出现糖尿病,应尽早考虑胰岛素治疗同时改善胰岛素抵抗。     

老龄SD大鼠胰岛β细胞形态功能研究

目的观察3组不同月龄SD大鼠糖脂代谢指标变化，了解在基础及葡萄糖刺激下胰岛β细胞胰岛素分泌、结构变化与老龄糖耐量减退的关系，探讨老龄糖耐量受损的机制。方法采用免疫组化、细胞体视学、透视电镜等方法观察5～6、11～12、20～24月龄SD大鼠胰岛及胰岛β细胞形态及胰岛素分泌水平；将胰岛β细胞分离后与两种不同质量浓度的葡萄糖培养，观察葡萄糖刺激下老龄大鼠β细胞胰岛素分泌水平。结果20～24月龄大鼠体质量、空腹血糖及血脂水平有增高；11～12、20～24月龄大鼠血清中游离脂肪酸（FFA）水平显著增高；对葡萄糖刺激出现峰值降低、达峰时间延迟；胰岛β细胞体积增大和细胞内胰岛素分泌量减少。老龄胰岛β细胞内线粒体和内质网肿胀，空泡变性。从11～12月龄大鼠开始，胰腺中平均胰岛面积随着年龄的增加而减少；但每个胰岛中平均胰岛β细胞的面积比例却有增加。结论老龄鼠在空腹血糖正常时即已具备胰岛素抵抗的某些特征；老龄大鼠胰岛β细胞虽然有面积比例增大，但β细胞基础和葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能减低。提示一旦糖代谢受损出现糖尿病，应尽早考虑胰岛素治疗同时改善胰岛素抵抗。     

一种改良的大鼠胰岛分离方法

目的 寻找并建立一种改良的、实用可靠的大鼠胰岛制备和培养方法。方法 采用胰管内顺行灌注胶原酶溶液，静态消化，Ficoll不连续密度梯度离心纯化胰岛，手挑法捡出全部胰岛。分离后胰岛在37℃、体积浓度95％O2和5％CO2下培养1周，通过测量培养液的胰岛素含量观察胰岛功能变化。结果 355～875个胰岛／胰腺，捡出后胰岛纯度可达：100％，活率≥95％。本方法制备胰岛体外培养后可以测出功能良好。结论 本法胰岛制备技术已趋于完善，效果满意，获得的胰岛体外培养后实验证明其功能良好。     

大鼠胰岛α细胞及其分泌物对β细胞功能的影响

目的：探讨大鼠胰岛α细胞和胰高血糖素样肽1（GLP-1）对β细胞（INS-1细胞,即胰岛素瘤细胞）功能的影响,阐明α细胞与INS-1细胞混合移植对降糖效果影响的可能机制。方法：采用MTT法分析10%、20%和30%胰岛α细胞条件培养基和0.03、0.30、3.00和30.0 mg·L^-1 GLP-1作用下INS-1细胞的增殖能力;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测10%、20%和30%胰岛α细胞、胰岛α细胞条件培养基和不同浓度GLP-1作用下INS-1细胞胰岛素释放水平;采用激光共聚焦显微镜分析高糖和GLP-1作用下INS-1细胞内Ca²⁺浓度;采用Western blotting法分析不同浓度的胰岛α细胞条件培养基和不同浓度GLP-1作用下胰岛素蛋白表达水平;将INS-1细胞、INS-1细胞与α细胞的混合物移植至糖尿病裸鼠左肾包膜下,监测血糖,观察肾脏形态,采用免疫组织化学法检测移植部位细胞中胰岛素和胰高血糖素水平。结果：与对照组比较,胰岛α细胞条件培养基和GLP-1均可促进INS-1细胞增殖和胰岛素释放（P < 0.05）。激光共聚焦显微镜分析,GLP-1可刺激INS-1细胞内Ca²⁺浓度升高（P < 0.05）。Western blotting法检测,与对照组比较,胰岛α细胞条件培养基和GLP-1作用下INS-1细胞中胰岛素蛋白表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）。与移植前比较,糖尿病裸鼠肾包膜下移植INS-1细胞35d时血糖明显下降（P < 0.05）,甚至出现低血糖,移植部位明显肿胀;移植INS-1和α细胞混合物的糖尿病裸鼠血糖无明显变化（P > 0.05）,移植部位未见明显肿胀。免疫组织化学染色,移植INS-1细胞部位的组织既表达胰岛素又表达胰高血糖素。结论：胰岛α细胞及其分泌物可促进INS-1细胞增殖和胰岛素释放,但α细胞与INS-1细胞混合移植给糖尿病裸鼠可降低INS-1细胞移植的降糖效果,其机制可能与INS-1细胞既表达胰岛素基因又表达胰高血糖素基因有关。     

改良的新生猪胰岛细胞体外培养

介绍一种通过细胞分离及体外培养获得大量新生猪胰岛细胞团的方法。新生猪胰腺经 0 .5～ 1mg .ml- 1的V型胶原酶消化 8～ 1 2min ,再经体外培养 7d ,可获大量纯化的胰岛细胞团。同时 ,新生猪胰岛内的B细胞不仅胰岛素分泌功能良好 ,而且其超微结构正常。提示新生猪胰岛细胞可作为异种移植治疗 1型糖尿病重要的供体来源。     

软脂酸对体外原代培养大鼠胰岛细胞凋亡作用的实验研究

目的 观察软脂酸诱导体外原代培养胰岛细胞的凋亡，初步探讨软脂酸在2型糖尿病发病中的机制。方法 应用分离的体外单层培养SD大鼠胰岛细胞，与不同浓度软脂酸(分别为0、0．125、0．250、0．500mmol／L)共同孵育48h，用放免法测定培养液中胰岛素含量，PI／Hoechst33342双染法荧光显微镜观察胰岛细胞凋亡的形态变化。结果 0．250、0．5mmol／L软脂酸可抑制高糖刺激下的胰岛素分泌，促进胰岛细胞的凋亡。结论 软脂酸可诱导胰岛细胞凋亡，凋亡程度与游离软脂酸浓度有关。     

瘦素对大鼠体外胰岛β细胞胰岛素合成与分泌的抑制作用

目的了解不同浓度瘦素对体外培养大鼠胰岛β细胞胰岛素合成与分泌的影响。方法用含11.1 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养液体外培养大鼠胰岛β细胞系胰岛素-1(insulin-1,INS-1)细胞,实验分为5组,培养液瘦素浓度分别为0、5、10、20μg/L和50μg/L。培养24 h后分别以荧光定量PCR和ELISA方法检测胰岛β细胞前胰岛素原mRNA的表达及上清液胰岛素浓度。结果在葡萄糖浓度11.1 mmol/L、瘦素作用24 h情况下,胰岛β细胞前胰岛素原mRNA表达随培养液瘦素浓度的升高而逐渐下降,上清液胰岛素浓度随培养液瘦素浓度的升高而逐渐下降,瘦素可抑制胰岛β细胞胰岛素的合成与分泌。结论重组瘦素对体外培养大鼠胰岛β细胞(葡萄糖浓度11.1 mmol/L,瘦素作用24 h)胰岛素的合成与分泌具有抑制作用,随瘦素浓度的增加,抑制作用越明显。     

三种阿片肽对体外培养大鼠胰岛胰岛素释放的影响

目的：观察不同浓度的３种阿片肽对体外孵育胰岛分泌胰岛素的影响。方法：大鼠胰岛培养中分别加入１０＾－１５，１０＾－１２，１０＾－９，１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ４种浓度的β内啡肽（β－ＥＰ）、亮啡肽（Ｌ－ＥＫ）和强啡肽Ａ１－１３（ＤｙｎＡ１－１３）。结果：３种阿片肽都能刺激胰岛素分泌。高浓度（１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ）β－ＥＰ和ＤｙｎＡ１－１３相对于低浓度（１０＾－１５ｍｏｌ／Ｌ）胰岛素分泌反而减少，但仍高于正