睫状神经营养因子和丹参注射液体外诱导肌源性干细胞向神经元样细胞的分化

背景:在干细胞异体移植时神经细胞的低存活率成为异体细胞移植失败的主要诱因.核因子kB是细胞信号传导的主要转录因子之一,参与细胞的增殖和分化过程.目的:观察睫状神经营养因子和丹参注射液联合诱导肌源性干细胞向神经元样细胞的分化情况,以及分化过程中核因子kB的表达.设计、时间及地点:细胞学基因水平实验,于2008-03/05在辽宁医学院附属第二医院口腔科学实验室完成.材料:新生7 d龄SD乳鼠10只,由辽宁医学院实验动物中心提供.睫状神经营养因子为Sigma公司产品,丹参注射液购自正大青春宝药业有限公司.方法:体外分离培养鼠肌源性干细胞,差速贴壁法和酶消化法纯化后接种于6孔板内.诱导组用含睫状神经营养因子的DMEM预诱导24 h,更换培养液,洗涤3次,再加入含丹参注射液的无血清DMEM诱导5 h;对照组使用无血清DMEM培养基处理.主要观察指标:RT-PCR及Western blotting法检测神经丝蛋白、核因子kB抑制蛋白的表达.结果:诱导前肌源性干细胞未见神经丝蛋白表达,诱导后的神经元样细胞神经丝蛋白呈阳性表达.凝胶电泳及Westem blot检测结果显示,与诱导前比较,诱导后对照组核因子kB抑制蛋白的表达无明显变化,诱导组核因子kB抑制蛋白的表达明显下降.结论:睫状神经营养因子和丹参注射液可联合诱导肌源性干细胞分化为神经元样细胞,分化过程中核因子kB的活化被抑制.     

冲击波对成肌细胞增殖分化的影响

目的:探讨体外冲击波对成肌细胞增殖分化的影响,为进一步开展冲击波在体内骨骼肌损伤中的作用研究奠定基础,为临床应用冲击波治疗提供理论依据。方法:将原代分离培养好的成肌细胞,利用冲击波进行刺激,将实验对象分为空白组、实验组(冲击波刺激)、阳性对照组(成肌诱导剂)。形态学检测肌管形成情况;MTT法检测成肌细胞增殖;流式细胞仪检测成肌细胞凋亡;Western Blot检测肌调节标志物Pax7、MyoD、Myf5、Myf6和Myogenin蛋白;免疫荧光检测Desmin、Pax7、MyoD的表达。结果:(1)结果显示成肌细胞的活力对冲击波刺激呈现剂量依赖性,能流密度高于0.16 mJ/mm~2时细胞的存活率降低,凋亡率高于空白组(P0.05),能流密度为0.08 mJ/mm~2时,冲击次数为500时细胞最高活力。(2)免疫荧光结果显示冲击波可促进MyoD蛋白表达升高,降低Pax7的表达。(3)Western Blot结果显示冲击波可促进MyoD、Myf5、Myogenin、Myf6蛋白表达水平显著增高(P0.05),Pax7蛋白表达随着时间的延长呈递减趋势(P0.05)。MyoD蛋白在实验组和对照组随着时间延长蛋白表达水平都逐渐升高,且实验组的表达水平均高于对照组(P0.05)。(4)细胞形态学观察肌管融合结果显示,成肌细胞在冲击波刺激下呈现多核,实验组、对照组与空白组相比差异具有显著性意义(P0.05)。结论:本实验证实了体外冲击波对成肌细胞的生物学功能有影响,可提高成肌细胞的活力,促进其向肌分化。     

丹参注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探讨丹参注射液在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)向神经元样细胞分化的作用.方法:采用贴壁筛选法分离rMSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养.采用含丹参注射液的无血清Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F-12培养液诱导rMSCs分化为神经元样细胞,观察不同浓度丹参注射液对rMSCs诱导分化为神经元样细胞的影响.通过观察rMSCs经诱导后细胞的形态变化和采用免疫组化方法检测神经元特异性核蛋白(NeuN)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达来鉴定神经元样细胞.结果:经丹参注射液诱导后,rMSCs胞体收缩,突起伸出,形似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NeuN、NF-M表达阳性,GFAP阴性.丹参注射液在浓度为10 ml/L时的诱导作用最为显著.结论:丹参注射液可以在体外诱导rMSCs分化为神经元样细胞,其诱导分化率与丹参注射液的浓度有关.     

p38在甲硫氨酸限制抑制胃癌细胞生长中的作用

目的:探讨甲硫氨酸限制是否会激活胃癌细胞内p38蛋白信号传导通路.方法:观察甲硫氡酸限制环境中胃癌细胞形态的变化及增殖活性的变化:检测甲硫氨酸限制环境中胃癌细胞磷酸化p38的表达.结果:甲硫氨酸限制培养液中胃癌细胞增殖活性明显受到抑制(P<0.05);甲硫氨酸限制培养液中培养24 h后胃癌细胞中可检测到磷酸化p38蛋白的表达.结论:甲硫氨酸限制诱导的胃癌细胞周期阻滞和凋亡与p38蛋白信号通路激活有关.     

磷脂酰肌醇-3激酶在间充质干细胞成肌分化中的表达及肌损伤修复中的作用

目的 以 5-氮杂胞苷( 5-azacytidine, 5-Aza-CR)诱导间充质干细胞( mesenchymal stem cells,MSCs)成肌分化,探讨生肌调控因子 Myf5的表达情况及磷脂酰肌醇-3激酶( phosphoinositide-3 kinases, PI3K)在此分化全过程中的作用. 方法 分离、纯化及扩增 MSCs,以 5-Aza诱导其成肌分化, RT PCR测定 Myf 5的表达,免疫组化检测α-sarcomeric表达; Western blot检测 LY 294002抑制前后磷酸化 Akt蛋白水平的变化. 结果 LY294002作用后, Myf5表达延迟至诱导后 12 h;诱导后 10 d,部分 MSCs表达α-sarcomeric;磷酸化 Akt在 5-Aza诱导后蛋白水平逐渐增强, LY294002抑制明显下降. 结论 MSCs成肌分化过程中, PI3K是重要的正向信号转导通路.     

睫状神经营养因子对坐骨神经切断吻合后大鼠脊髓前角胶质纤维酸性蛋白表达的影响

背景:睫状神经营养因子具有多种生物活性,在神经系统发育、分化和损伤修复中具有重要意义.目的:观察睫状神经营养因子对坐骨神经切断吻合后大鼠相应脊髓节段前角星形胶质细胞的特异标记物胶质纤维酸性蛋白表达的影响.方法:将SD大鼠随机分为对照组、模型组、生理盐水组及药物组.除对照组外,对所有大鼠实施双侧坐骨神经切断吻合术,药物组手术区局部注射睫状神经营养因子100 ng/kg,1次/d,生理盐水组局部注射等量生理盐水.术后1,3,7,14,21,28 d取相应脊髓节段,免疫组织化学染色观察胶质纤维酸性蛋白的表达,苏木精伊红染色、TUNEL染色对脊髓前角神经元进行计数.结果与结论:大鼠坐骨神经切断吻合后相应脊髓节段星形胶质细胞胞体大,突起分枝多且粗大,神经元数目逐渐减少,凋亡神经元增多,胶质纤维酸性蛋白表达增高.与模型组和生理盐水组比较,药物组神经元存活数目增多,凋亡减少,胶质纤维酸性蛋白表达明显增加(P<0.05或P<0.01).同时,药物组大鼠的运动功能障碍较轻,恢复较快.说明睫状神经营养因子可以通过促进大鼠脊髓前角胶质纤维酸性蛋白的表达起到神经保护作用.     

miRNA-146a-5p对癫痫大鼠海马神经元NF-κB信号转导通路的影响

目的观察miRNA-146a-5p(miR-146a-5p)对癫痫大鼠海马神经元核因子κB(NF-κB)信号转导通路的影响。方法体外培养新生SD大鼠海马神经元,随后制备癫痫海马神经元模型,随机分为三组,空白对照组(control组):转染时添加等体积opti-MEM培养基;阴性对照组(NC组):转染80 n M浓度NC至癫痫大鼠海马神经元; miR-146a-5p组:转染80 n M浓度miR-146a-5p mimics至癫痫大鼠海马神经元。转染后培养24 h,再用200 ng/ml脂多糖(LPS)诱导6 h,采用免疫荧光双染法鉴定体外培养海马神经元,采用膜片钳技术检测正常大鼠海马神经元和癫痫大鼠海马神经元自发性放电频率,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测未经LPS诱导各组海马神经元miR-146a-5p表达水平及经LPS诱导后各组海马神经元核因子κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化IκBα(p IκBα)、NF-κB P65、IKB激酶-β(IKKβ) mRNA表达水平,采用Western blot法检测经LPS诱导后各组海马神经元IκBα、p IκBα、NF-κB P65、IKKβ蛋白表达水平,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测经LPS诱导后各组细胞培养液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达水平。结果体外培养7 d的癫痫大鼠海马神经元与正常大鼠海马神经元相比较形态未见明显异常;癫痫大鼠海马神经元自发性放电频率明显较正常大鼠海马神经元明显增加(P 0. 05); miR-146a-5p组海马神经元miR-146a-5p表达水平明显高于control组和NC组(P 0. 05);经LPS诱导后miR-146a-5p组海马神经元p IκBα、NF-κB P65、IKKβmRNA及蛋白表达水平明显低于control组和NC组(P 0. 05),而IκBαmRNA及蛋白表达水平明显高于control组和NC组(P 0. 05);经LPS诱导后miR-146a-5p组细胞培养液中TNF-α、IL-1、IL-6、ICAM-1表达水平明显低于control组和NC组(P 0. 05)。结论miR-146a-5p可抑制LPS诱导的癫痫大鼠海马神经元NF-κB信号转导通路中p IκBα、NF-κB P65、IKKβmRNA及蛋白表达,促进IκBαmRNA及蛋白表达,减少TNF-α、IL-1、IL-6、ICAM-1等炎症因子的释放。     

脑缺血后大鼠神经元和星形胶质细胞p15ink4b表达的差异研究

目的:比较研究大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p15ink4b在神经元和星形胶质细胞的表达。方法:建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,应用流式细胞术检测各组MCAO再灌注后不同时期神经元和星形胶质细胞中的p15ink4b的表达。结果:缺血侧皮质区星形胶质细胞中的p15ink4b的表达在再灌注3d后开始下调,14d显著下调,与假手术组比较有显著性差异(P<0.05);缺血侧皮质神经元中的p15ink4b在再灌注14d后表达下调,与假手术组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:局灶性脑缺血再灌注损伤后,缺血侧皮质区星形胶质细胞和神经元均有p15ink4b不同程度的表达下调,星形胶质细胞中的p15ink4b表达下调比神经元更为显著。     

香丹注射液诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

背景:选择一种高效、细胞损伤低的诱导人脐血间充质干细胞分化为神经细胞的方法是其应用于临床的前提.目的:拟采用传统中药香丹注射液联合生长因子诱导脐血间充质干细胞向神经细胞方向分化,并且与单纯生长因子的诱导作用进行比较.设计、时间及地点:免疫细胞化学水平的细胞观察实验,于2006-09/2008-04在潍坊医学院组织胚胎学教研室完成.材料:人脐血标本取自潍坊市妇幼保健院,香丹注射液的有效成分为丹参素.方法:采用密度梯度离心法分离人脐皿单个核细胞,贴壁法筛选出人脐血间充质干细胞,体外扩增,以免疫荧光方法检测表面抗原.分为2组进行诱导分化,香丹注射液联合生长因子诱导组采用30 g/L香丹注射液联合表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血间充质下细胞向神经细胞方向分化,并且与单纯生长因子诱导组进行比较.主要观察指标:采用免疫细胞化学方法和免疫荧光方法检测诱导前后神经元特异性标志(神经元核抗原、β-TubulinⅢ)和神经胶质纤维酸性蛋白的表达.结果:香丹注射液联合生长因子诱导法对脐血间充质干细胞损伤作用小,诱导效率高.脐血间充质干细胞经香丹沣射液诱导后出现类似神经细胞的形态改变,胞体呈椭圆形,伸出长突起.免疫组织化学和免疫荧光方法鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元核抗原和β-TubulinⅢ,而神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较少.香丹注射液联合生长因子诱导组的β-TubulinⅢ和神经元核抗原的阳性细胞率显著高于生长因子诱导组(P＜0.05),神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率明显低于生长因子诱导组(P＜0.05).结论:香丹注射液联合生长因子诱导对脐血间充质干细胞损伤作用小,诱导效率高,优于生长因子诱导法.且体外诱导后细胞丰要分化为神经元样细胞,而非星形胶质细胞.     

p53基因诱导白血病细胞凋亡的机制研究

目的：探讨p53基因诱导白血病细胞凋亡过程中内源性TGF-β1、TNF-α、端粒酶活性、Bcl-2表达的改变及其意义。方法：利用脂质体将温敏型p53基因[pN53cG(Val135)]导入p53基因缺失的白血病细胞系HL-60、K562细胞，经G418筛选，获得稳定表达p53蛋白的抗性克隆细胞HL-60pN53cG，K562-pN53cG细胞。采用缺口末端标记法、片段化DNA分析、RT-PCR、定量PCR、ELISA、PCR-ELISA、流式细胞术等方法检测外源性p53基因诱导白血病细胞凋亡过程中TGF-β1、TNF-α、bcl-2、端粒酶反转录酶(hTERT)mRNA表达变化、细胞上清TGF-β1水平和端粒酶活性及。TGF-β1、TNF-α反义PS-ODNS对白血病细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达的影响。结果:①外源性野生型p53基因诱导细胞凋亡过程中内源性。TGF-β1和TNF-α mRNA表达上调，bcl-2及hTERT mRNA表达下调，细胞培养上清TGF-β1蛋白水平明显升高，端粒酶活性水平下降；②TGF-β1、TNF-α反义PS-ODNS能够明显抑制野生型p53基因诱导细胞凋亡的发生，并使细胞bcl-2 mRNA及蛋白表达恢复到处理前的水平。结论：p53基因诱导白血病细胞凋亡可通过上调内源性TGF-β1和TNF-α水平，下调hTERT mRNA表达及端粒酶活性，抑制bcl-2基因表达而发挥作用。     

p53 alpha-Helix mimetics antagonize p53/MDM2 interaction and activate p53

Overexpression or hyperactivation of MDM2 contributes to functional inactivation of wild-type p53 in nearly 50% of tumors. Inhibition of p53 by MDM2 depends on binding between an NH(2)-terminal (residues 16-28) p53 alpha-helical peptide and a hydrophobic pocket on MDM2, presenting an attractive target for development of inhibitors against tumors expressing wild-type p53. Here we report that novel p53 alpha-helical peptide mimics based on a terphenyl scaffold can inhibit MDM2-p53 binding in vitro and activate p53 in vivo. Several active compounds have been identified that inhibit MDM2-p53 binding in an ELISA assay with IC(50) of 10 to 20 micromol/L and induce p53 accumulation and activation in cell culture at 15 to 40 micromol/L. These results suggest that p53 alpha-helical mimetics based on the terphenyl scaffold may be developed into potent p53 activators.     

淋巴组织肿瘤中p53、p73基因改变和表达及其意义

目的：探讨淋巴组织肿瘤中p53、p73基因改变和异常表达情况及其意义.方法：采用PCR-SCP法、RT-CR法、REP法、免疫组化法分别检测26例急性淋巴细胞白血病（ALL）、12例多发性骨髓瘤（MM）及12例淋巴瘤（MLs）标本中p53、p73基因改变及异常表达情况.结果：（1）26例ALL中仅有3例检测到p53基因点突变,12例MM标本中2例p53基因突变.未发现p73基因突变;（2）p73mRNA在淋巴组织肿瘤中总的阴性表达率为24%;（3）10例ALL和3例NHL在p73基因外显子1启动子区的CpG岛高甲基化,而正常对照组和12例MM标本均无甲基化存在;（4）对照组p53蛋白均为阴性.26例ALL中,p53蛋白阳性者20例;7例中高度恶性NHL中6例p53蛋白阳性.结论： p53基因在淋巴组织肿瘤中的突变率较低;MLs中p53蛋白表达和恶性程度、临床分期相关;p73mRNA在ALL/NHL中存在较高的阴性表达,,而在MM为阳性表达;p73基因转录失活与p73基因外显子1CpG岛高甲基化有关,不存在基因的突变和缺失;p73基因异常可能在MM的发生、发展中不是一个重要的分子事件.     

MiRNA-3p/5p在肿瘤中的研究进展

Pre-miRNA经Dicer酶剪切产生2个产物,分别是miRNA-3p和miRNA-5p,以往的研究多数都是以单一的miRNA-3p或者miRNA-5p为主,而miRNA-3p/5p成对调控肿瘤的发生发展却少有报道.本文就近年来miRNA-3p/5p与肿瘤的研究进展做一综述.     

p73、p63和p53蛋白在口腔鳞癌中的表达及其意义

目的　研究口腔鳞癌组织中p73，p63和p53蛋白表达以及与临床生物学特性和细胞增殖的关系。方法　采用免疫组化方法检测48例原发性口腔鳞癌组织及20例正常口腔黏膜组织中p73，p63和p53蛋白的表达水平。结果　p73，p63和p53蛋白在口腔鳞癌中阳性表达率显著高于正常口腔黏膜组织(P<0.05) ；p73、P63、p53蛋白在口腔鳞癌临床Ⅰ、Ⅱ期的过表达明显低于Ⅲ、Ⅳ期(P＜0.05) ；p73蛋白过表达与淋巴结转移有关(P＜0.05) ；p73蛋白与p53蛋白,p63蛋白与p53蛋白之间存在着正相关(r= 0.368,0.342,P＜0.05)。结论　在口腔鳞癌的发生发展过程中，p73，p63和p53的过表达三者可能单独或共同参与。p73和p63之间的交互作用，在口腔鳞癌的发生过程中起重要作用。     

利用组织芯片技术观察p53及其同系物p63在恶性肿瘤中的表达

目的探讨p53和p63在部分肿瘤发生中的作用,为其人群大规模筛查、早期诊断及预后评估提供依据。方法选取病理科档案材料中食管鳞癌、胃腺癌、大肠腺癌、膀胱移行细胞癌、肺癌、肝细胞性癌、乳腺浸润导管癌、肾透明细胞癌、卵巢腺样囊腺癌和胰腺癌石蜡包埋组织各6例及相应正常组织各3例。肿瘤标本先观察苏木精-伊红(HE)切片以确定肿瘤部位,采用组织芯片仪及手工法制作180点列阵组织芯片,进行p53和p63抗体免疫组化染色。光镜观察p53、p63阳性细胞在各组的分布,并进行对比分析。结果p53表达类型:(1)正常组织p53阳性细胞数很少;(2)3例食管癌、3例胃癌、2例大肠癌、1例肺癌、1例乳腺癌、2例卵巢癌的绝大多数肿瘤细胞呈强阳性核染色反应,癌旁组织细胞和间质细胞阴性,1例膀胱癌中有少量阳性肿瘤细胞散在分布于阴性肿瘤细胞中。p63表达类型:(1)正常食道复层扁平上皮基底层细胞呈核染色,p63阳性细胞散在分布于棘细胞层;(2)6例食道癌、6例膀胱癌和4例肺鳞癌均为强阳性反应,大多数肿瘤细胞呈强核染色,癌旁组织细胞和间质细胞p63阴性;两例肺腺癌p63阴性;(3)6例胃癌中的4例、6例大肠癌中的3例、6例乳腺浸润导管癌中的2例、6例肝细胞性癌中的1例可见较强的肿瘤细胞胞质染色。其中3例食管癌、3例胃癌、1例大肠癌、1例肺     

p57、p53和p63蛋白对葡萄胎和水肿性流产的鉴别诊断价值

目的:探讨p57、p53和p63蛋白在鉴别诊断水肿性流产(HA),部分性葡萄胎(PHM)和完全性葡萄胎(CHM)的价值。方法:采用免疫组织化学染色法检测HA(n=21)、PHM(n=28)和CHM(n=32)石蜡组织切片中p57、p53和p63的表达。结果:HA、PHM和CHM组织中,p57蛋白的阳性表达率分别为90.5%(19/21)、100%(28/28)和0.0%(0/32),PHM和CHM组间有明显差异(P0.01);p53蛋白的阳性表达率分别为28.3%(5/21)、71.4%(20/28)和87.5%(28/32),HA、PHM组相比也有明显差异(P0.01);p63蛋白的阳性表达率分别为81.0%(17/21)、89.3%(25/28)和87.5%(28/32),各组间均无统计学差异。结论 :以常规石蜡切片的病理形态特征为基础,结合免疫组化检测p57、p53和p63的结果,对鉴别水肿性流产和葡萄胎具有重要价值。     

p14ARF、p73和p53在宫颈癌中的表达及其临床意义

目的探讨宫颈癌组织p14ARF、p73和p53蛋白的表达及其临床意义.方法应用免疫组化方法检测p14ARF和p73、p53基因在41例宫颈癌及20例正常宫颈组织中的表达.结果p14ARF、p73、p53在宫颈癌中阳性率分别为85.4%(35/41)、73.2%(30/41)和39.0%(16/41),与正常宫颈组织相比,有显著差异.p14ARF和p73阳性率均随病理分级增高而增加,而与其它临床病理参数无关.p53表达与病理分级、临床分期和淋巴结转移有关(P＜0.05).在宫颈癌中,p14ARF与p73表达密切相关(P＜0.01),p14ARF与p53表达不相关(P＞0.05).结论p14ARF与p73在宫颈癌中同时高表达有一定诊断和预测价值,可能是宫颈癌新的肿瘤标志物.p53与宫颈癌的发生发展有关.     

p53、p73蛋白在甲状腺乳头状癌中表达的意义

目的:探讨甲状腺乳头状癌(PTC)中p53、p73蛋白的表达情况及其临床意义。方法:选取100例PTC病理标本和31例良性甲状腺病变病理标本,应用免疫组化SP法检测两者中p53和p73蛋白的表达情况,并分析p53、p73蛋白与临床病理特征间的关系及其相互关系。结果:PTC组织中p53的阳性表达率为72.0%,p73的阳性表达率为67.0%,较良性甲状腺病变组织(均为12.9%)中的阳性表达率高,差异均有统计学意义(P均<0.01)。p53在TNM分期Ⅰ和Ⅱ期患者中的表达率较Ⅲ和Ⅳ期患者低(P<0.05)。结论:PTC组织中p53、p73的高表达与肿瘤的发生、发展有一定相关性,可作为PTC发生、发展的客观指标。     

Compensatory mutations at the HIV cleavage sites p7/p1 and p1/p6-gag in therapy-naive and therapy-experienced patients

BACKGROUND: Mutations in the genome of HIV conferring drug resistance are a major reason for the failure of antiretroviral therapy, but they often compromise viral fitness. Protease (PR) cleavage site (CS) mutations could compensate for impaired replication capacity of drug-resistant viruses. PATIENTS AND METHODS: We analysed the cleavage sites p1/p7 and p1/p6-gag of 500 HIV-1 subtype B infected patients. The collective consists of 275 therapy-naive and 225 therapy-experienced patients with at least one primary PR mutation, from whom eight underwent therapy-interruption in different clinical settings. RESULTS: Multiple mutations within the CS p7/p1 and p1/p6-gag accumulated in therapy-experienced isolates (p7/p1: A431V-K436R-I437V and p1/p6-gag: L449F/V-P452S-P453L/A). Further rare CS mutations were totally absent in therapy-naive viruses. Sixty percent of all therapy-experienced viruses exhibited at least one therapy-associated CS mutation, but so did 10% of therapy-naive viruses. The analysis of CS and PR mutations in therapy-experienced viruses revealed several positive correlations--A431V with L24I-M46I/L-I54V-V82A; I437V with I54V-V82F/T/S; L449V with I54M/L/S/T/A; and L449F/R452S/P453L: with D30N-I84V--whereas P453L and V82A were negatively correlated. Mutagenetic trees constructed form this cross-sectional data showed an ordered accumulation of the most prominent CS mutations along two pathways L90M-I84V-P453L and I54-V82-A431V followed by either M46L or L24I. Furthermore, eight viruses with at least one therapy-associated mutation at each CS displayed an outstanding maintenance of major PR mutations during therapy interruption. CONCLUSIONS: These findings emphasize the relevance of CS mutations in the evolution of HIV resistance to PR inhibitors. Therefore, therapy-associated CS mutations should be considered in HIV resistance tests to estimate viral fitness in different clinical settings.