细胞外信号调节激酶1/2在抗纤维化短肽AcSDKP调节大鼠心脏成纤维细胞增殖和胶原表达中的作用

目的 探讨AcSDKP是否通过阻断细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)途径调节血小板源性生长因子(PDGF)诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖和胶原蛋白表达. 方法 CCK-8法检测心脏成纤维细胞代谢活性.流式细胞仪法检测细胞周期.免疫细胞化学法、Western blot法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达.Western blot法检测ERK1/2及磷酸化-ERK1/2蛋白表达. 结果 10-9mol/L AcSDKP能够抑制PDGF诱导的大鼠心脏成纤维细胞代谢活性,减少了细胞由G1期向S期的转化,细胞增殖指数下降.抑制了Ⅰ、Ⅲ型胶原及磷酸化-ERK1/2蛋白的表达,而ERK1/2蛋白表达无明显改变. 结论 AcSDKP能够通过阻断PDGF介导的ERK1/2通路的激活进而抑制大鼠心脏成纤维细胞增殖和胶原蛋白表达.     

瑞舒伐他汀对TGF-β1诱导的新生大鼠心脏成纤维细胞增殖及其胶原合成与分泌的作用和机制

目的 探讨瑞舒伐他汀对转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导的新生大鼠心脏成纤维细胞增殖及其胶原合成与分泌的作用和可能机制.方法 分离、培养新生SD大鼠的心脏成纤维细胞,采用CCK-8比色法测定细胞数目.用RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达,用ELISA测定Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白含量,用Western blot检测心脏成纤维细胞Akt的蛋白表达.结果 CCK-8比色法显示,瑞舒伐他汀能抑制TGF-β1引起的心脏成纤维细胞增殖;RT-PCR结果显示,瑞舒伐他汀能抑制TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达;ELISA结果显示,瑞舒伐他汀能抑制TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白分泌;Westernblot结果显示,瑞舒伐他汀能抑制TGF-β1诱导的Akt蛋白表达.结论 瑞舒伐他汀可能通过抑制TGF-β1诱导的新生大鼠心脏成纤维细胞增殖、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成与分泌来抑制TGF-β1诱导的心脏纤维化,其分子机制可能与抑制Akt信号通路有关.     

替米沙坦联合氨氯地平对乳鼠转化生长因子-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

目的探讨替米沙坦联合氨氯地平对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖及细胞中转化生长因子(TGF)-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响。方法对Wistar乳鼠心肌成纤维细胞行体外原代及传代培养,将培养好的细胞分为5组:对照组(加入15%小牛血清DEME培养液)、AngⅡ组(15%小牛血清DEME培养液+1×10~(-6)mol/L AngⅡ),替米沙坦组(TE组,在AngⅡ组基础上加入10μmol/L替米沙坦),氨氯地平组(AM组,AngⅡ组基础上加入1μmol/L氨氯地平)及替米沙坦+氨氯地平组(TE+AM组),在AngⅡ组基础上加入10μmol/L替米沙坦+1μmol/L氨氯地平),每组3份。观察各组细胞不同时期增殖情况及TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、p27蛋白表达情况。结果与对照组相比,AngⅡ组心肌成纤维细胞在S期时增殖率较高,而在G_0/G_1期、G_2/M期时增殖率下降(P0.05),TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、p27蛋白表达水平显著升高(P0.05)。与AngⅡ组相比,TE组、AM组及TE+AM组心肌成纤维细胞在S期时增殖率显著下降,而在G_0/G_1期、G_2/M期时增殖率升高(P0.05),TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、p27蛋白表达水平下降(P0.05),其中TE+AM组心肌成纤维细胞在G_0/G_1期、G_2/M期增殖较TE组、AM组显著,而TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、p27蛋白表达水平低于TE组、AM组。结论替米沙坦联合氨氯地平能有效抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖,其可能机制与抑制TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及p27蛋白过度表达有关。     

N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸对大鼠心脏成纤维细胞c-Jun氨基末端激酶通路活化的影响

目的 探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对血小板源生长因子诱导的大鼠心脏戍纤维细胞增殖及胶原合成以及c-Jun氨基末端激酶表达的影响.方法 选用新生Wistar大鼠心脏成纤维细胞作为实验研究材料,MTT法检测心脏成纤维细胞代谢活性的改变,免疫细胞化学法检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达的改变,Western Blotting检测大鼠心脏成纤维细胞中磷酸化JNK(p-JNK)和JNK蛋白及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达.结果 10μg/L血小板源生长因子刺激下,代表大鼠心脏成纤维细胞代谢活性的OD值增加,Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达增强,表明血小板源生长因子刺激了心脏成纤维细胞增殖,促进了胶原的合成.同时p-JNK蛋白表达增高,而JNK蛋白表达无明显改变.10-9mol/L AcSDKP能够抑制血小板源生长因子诱导的大鼠心脏成纤维细胞代谢活性,同时抑制了Ⅰ型、皿型胶原及p-JNK蛋白的表达,而JNK蛋白表达无明显改变.结论 AcSDKP能够通过阻断血小板源生长因子介导的JNK通路激活进而抑制大鼠心脏成纤维细胞增殖和胶原蛋白表达.     

抗纤维化短肽N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸对大鼠心脏成纤维细胞胶原合成与降解的调节作用

目的探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸（AcSDKP）对血小板源性生长因子（PDGF）诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖、胶原合成和降解代谢的调节作用。方法分离培养新生大鼠心脏成纤维细胞。采用^3H-TdR和。H-脯氨酸掺入法分别检测心脏成纤维细胞增殖与胶原蛋白合成。Western blot法检测心脏成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达和基质金属蛋白酶（MMP）-1蛋白的表达。明胶酶谱法检测心脏成纤维细胞MMP-2和MMP-9活性的表达。结果PDGF促进心脏成纤维细胞增殖、胶原合成,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达,以及MMP-2、MMP-9活性和MMP-1表达。AcSDKP对PDGF介导的心脏成纤维细胞增殖、胶原合成均有抑制作用。AcSDKP上调由PDGF介导的心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9活性和MMP-1的表达。结论AcSDKP抑制PDGF介导的心脏成纤维细胞增殖和胶原的合成,上调MMPs活性或表达,促进胶原的降解,这些可能与AcSDKP抗心脏纤维化作用相关。     

RhoA激酶信号通路介导的自噬障碍在2型糖尿病大鼠心肌纤维化中的作用

目的探索RhoA激酶信号通路介导的自噬障碍在2型糖尿病大鼠(T2DM)心肌纤维化中的作用。方法将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、法舒地尔组(10 mg/kg/d)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(15 mg/kg/d)和法舒地尔+3-MA组各12只。除对照组的所有大鼠均采用高脂饮食法联合小剂量链脲佐菌素诱导T2DM大鼠模型,均给予相应药物干预4周。RT-PCR检测心肌组织ROCK1、ROCK2、PCⅠ、PCⅢmRNA的表达;Western Blot检测心肌组织肌球蛋白磷酸酶靶向蛋白1(MYPT1)、p-MYPT1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62、UNC-51样激酶1(ULK1)、p-ULK1的表达;MTT法检测心肌成纤维细胞的增殖;ELISA和RT-PCR检测成纤维细胞培养液和细胞内PCⅠ和PCⅢ水平。结果与模型组相比,法舒地尔组大鼠成纤维细胞的增殖活性明显降低(P0.05),ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢmRNA的表达均明显上调(P0.05),p-MYPT1/MYPT1和p62的表达明显下调(P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1和p-ULK1/ULK1的表达明显上调(P0.05),成纤维细胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明显下降(P0.05);与法舒地尔组相比,法舒地尔+3-MA组大鼠成纤维细胞的增殖活性明显增加(P0.05),ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢmRNA的表达均明显下调(P0.05),p-MYPT1/MYPT1和p62的表达均明显上调(P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1和p-ULK1/ULK1的表达均明显下调(P0.05),成纤维细胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明显升高(P0.05)。结论 RhoA激酶信号通路介导的自噬障碍可以诱导T2DM大鼠的心肌组织纤维化。     

吡非尼酮抑制转化生长因子β1诱导肺成纤维细胞胶原合成的实验研究

目的:探讨吡非尼酮对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞胶原合成的影响及机制。方法 :以人胚胎肺成纤维MRC-5细胞为研究对象,用p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号抑制剂SB203580和吡非尼酮处理TGF-β1诱导的肺成纤维细胞,MTT检测细胞增殖, Western blot检测细胞中Ⅲ型胶原酶(ColⅢ)、I型胶原酶(ColⅠ)蛋白表达和p38MAPK磷酸化水平。结果:TGF-β1诱导处理后的肺成纤维细胞增殖能力升高,细胞中ColⅢ、ColⅠ和p38MAPK磷酸化水平升高。吡非尼酮处理可以降低TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖能力,减少细胞中ColⅢ、ColⅠ和p38MAPK磷酸化蛋白表达。p38MAPK信号抑制剂SB203580处理具有协同吡非尼酮降低TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖和表达蛋白ColⅢ、ColⅠ及p38MAPK磷酸化水平的作用。结论:吡非尼酮通过抑制p38MAPK信号,从而抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞胶原合成。     

心肌营养素1对心肌成纤维细胞增殖的作用机制

目的 探讨在高静水压条件下心肌营养素1(CT-1)对成纤维细胞增殖作用机制.方法 3～4代心肌成纤维细胞用于实验,分为对照组、助溶剂(二甲亚砜,DMSO)组、CT-1反义寡核苷酸组(ASODN)、正义寡核苷酸组(SODN)、MEK-EPK阻断剂PD98059组、JAK-STAT3阻断剂AG490组、PI3K阻断剂LY294002.利用自制压力培养装置,将各组细胞置于160 mm Hg压力下培养8 h. STAT3、ERK1/2和PI3-K的活性通过Western blot分析测定;MTT测定心肌成纤维细胞增殖.结果 高静水压明显促进心肌成纤维细胞增殖,CT-1表达上调,CT-1ASODN干预后,CT-1ASODN能抑制高静水压所致的细胞增殖,吸光度值(A值)为(0.132±0.013 vs 0.154±0.011,P＜0.05),STAT3(2.09±0.25 vs 2.47±0.28, P＜0.05)、ERK1/2(1.13±0.19 vs 1.61±0.22, P＜0.05)和PI3-K(1.25±0.23 vs 1.71±0.25,P＜0.05),蛋白表达水平明显低于对照组.AG490组明显减弱高静水压的促增殖作用(0.118±0.018 vs 0.155±0.010,P＜0.05);PD98059增强高静水压的促增殖(0.185±0.011 vs 0.155±0.010,P＜0.05),PI3-K阻断剂LY294002干预后对高静水压的促增殖作用无影响(0.157±0.015 vs 0.155±0.010,P＞0.05);SODN与对照组相比对心肌成纤维细胞增殖无明显影响.结论 高静水压下,可以激活STAT3、ERK1/2、PI3-K信号通路,心肌成纤维细胞增殖主要通过STAT3通路;ERK1/2通路起负向调节作用;PI3-K 与细胞增殖关系不是很密切.     

罗格列酮对糖基化终产物诱导鼠心肌成纤维细胞氧化应激和胶原代谢影响的研究

目的观察AGE诱导心肌成纤维细胞对氧化应激(OS)和胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成分泌的影响及罗格列酮(RGZ)的干预作用。方法不同浓度AGE与心肌成纤维细胞孵育,予RGZ干预48h,收集培养上清液,分别应用超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒检测SOD活性和MDA含量,采用ELISA检测胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量。结果 RGZ与200mg/L AGE共同孵育心肌成纤维细胞48h,随RGZ浓度增高(0.1、1、10μmol/L),心肌成纤维细胞培养上清液中SOD活性逐渐增高[(21.564±1.614),(22.323±1.260),(23.661±1.562)vs(19.320±0.896)nU/ml,P0.05或P0.01];与200mg/L AGE组比较,MDA含量逐渐降低[(1.325±0.048),(1.279±0.032),(1.229±0.045)vs(1.629±0.043)nmol/ml,P0.01];与200mg/L AGE组比较,胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ含量均呈递减趋势[(79.17±3.25),(60.42±3.58),(42.71±5.11)vs(85.54±2.28)ng/ml,P0.01;(37.52±3.43),(27.09±4.75),(20.81±3.26)vs(40.75±2.70)ng/ml,P0.01]。结论 AGE诱导心肌成纤维细胞OS,增加胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成分泌;RGZ能抑制AGE诱导的心肌成纤维细胞OS,抑制AGE诱导的胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成分泌,对糖尿病心肌纤维化的防治有重要意义。     

替米沙坦改善高糖高胰岛素诱导的心肌成纤维细胞增殖及其机制

目的 研究替米沙坦对高糖高胰岛素共同诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响及其机制。方法培养Spargue Dawley(SD)大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,随机分为对照组（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖高胰岛素组（25 mmol/L葡萄糖+1×10-7 mol/L胰岛素）、细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂组（高糖高胰岛素+10 μmol/L PD98059）和替米沙坦组（高糖高胰岛素+10 μmol/L替米沙坦）,培养48 h后,CCK8法检测细胞增殖;结晶紫染色法测定细胞数量;［3H］thymidine标记法测定细胞DNA合成;流式细胞仪分析细胞周期;ELISA试剂盒测定上清液中血管紧张素(Ang)Ⅱ、醛固酮（ALD）含量;Western blot测定磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达量。结果与对照组相比,高糖高胰岛素组细胞增殖(1.43±0.12 vs. 0.50±0.10)、细胞计数(1.64±0.03 vs. 1.06±0.02)、DNA合成量(26135.47±324.86 vs. 14528.26±267.18)、S+G2+M百分比〔(19.33±0.12)% vs.(8.56±0.07)%〕、AngⅡ〔(30.58±7.26) pg/ml vs.(18.26±2.64) pg/ml〕与ALD含量〔(19.62±1.25) pg/ml vs.(12.83±1.29) pg/ml〕及p-ERK1/2蛋白表达量明显升高（P<0.05）;与高糖高胰岛素组相比,ERK抑制剂组细胞增殖(0.72±0.06 vs. 1.33±0.12)、细胞计数(1.35±0.01 vs. 1.64±0.03)、DNA合成量(18643.76±192.52 vs. 26135.47±324.86)、S+G2+M百分比〔(12.84±0.36)% vs.(19.33±0.12)%〕、AngⅡ〔(23.17±5.31) pg/ml vs.(30.58±7.26) pg/ml〕与ALD〔(15.27±1.13) pg/ml vs.(19.62±1.25) pg/ml〕含量及p-ERK1/2蛋白表达量明显降低（P<0.05）;与高糖高胰岛素组相比,替米沙坦组细胞增殖(0.94±0.05 vs. 1.33±0.12)、细胞计数(1.49±0.02 vs. 1.64±0.03 )、DNA合成量(21829.35±154.73 vs. 26135.47±324.86)、S+G2+M百分比〔(15.13±0.42)% vs.(19.33±0.12)%、AngⅡ〔(26.84±4.36) pg/ml vs.(30.58±7.26) pg/ml〕与ALD〔(17.81±1.53) pg/ml vs.(19.62±1.25) pg/ml〕含量及p-ERK1/2蛋白表达量明显降低（P<0.05）;ERK抑制剂组与替米沙坦组各指标间没有统计学差异。结论血管紧张素1型受体AT1R阻滞剂替米沙坦通过部分抑制ERK1/2信号通路改善高糖高胰岛素共同诱导的心肌成纤维细胞增殖。     

MAPK信号通路在转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞趋化运动中的作用

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导心肌成纤维细胞趋化运动中可能的作用机制。方法 培养新生SD大鼠的心肌成纤维细胞,将细胞随机分为空白对照组、TGF-β1组、c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制因子(SP600125,10 μmol/L)组、P38MAPK抑制因子(SB203580,10 μmol/L)组、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)抑制因子(U0126,10 μmol/L)组,除空白对照组外,其余组均给与10 μg/L TGF-β1及对应抑制因子处理。MTT比色法测定心肌成纤维细胞增殖活性,Transwell小室检测心肌成纤维细胞运动能力,羟脯氨酸试剂盒检测胶原含量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌成纤维细胞中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)水平,Western blot检测成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col-1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达水平。结果 TGF-β1可明显促进心肌成纤维细胞增殖活性、趋化运动能力及胶原含量,MAPK信号途径抑制因子干预后能够抑制这种增殖及趋化运动,并降低胶原含量(P＜0.05);ELISA结果显示,MAPK信号途径抑制因子能够显著降低TGF-β1处理后导致的MCP-1、PAI-1水平升高(P＜0.05);Western blot结果显示,MAPK信号途径抑制因子能够显著降低TGF-β1处理后导致的α-SMA、Col-1、MMP-9蛋白表达升高(P＜0.05)。结论 TGF-β可能通过激活MAPK信号通路促进心肌成纤维细胞的趋化运动,通过使用MAPK抑制剂能够一定程度的抑制心肌纤维化。     

罗格列酮抑制糖基化终产物诱导心肌成纤维细胞增殖和结缔组织生长因子及Smad的表达

目的 探讨糖基化终产物(AGE)对培养乳鼠心肌成纤维细胞增殖、结缔组织生长因子(CTGF)和Smad2、Smad4蛋白表达的影响及罗格列酮的干预作用.方法 采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取心肌成纤维细胞,应用MTT法、流式细胞仪法分别观察不同浓度AGE及罗格列酮对心肌成纤维细胞的细胞增殖、细胞周期的影响,ELISA方法 检测细胞培养上清中TGF-β1水平,Westem印迹技术检测CTGF及Smad2、Smad4蛋白质表达.结果 在一定浓度范围内,AGE干预心肌成纤维细胞,随浓度的增加,细胞增殖更加显著,TGF-β1分泌增加,CTGF蛋白表达增加.罗格列酮(0.1、1、10μmoVL)干预后,随浓度的增加,抑制心肌成纤维细胞增殖(分别为0.823±0.072、0.785±0.060、0.601±0.081对0.981±0.049,P<0.05)、抑制心肌成纤维细胞分泌TGF-β1(分别为257.77±9.09、230.29±6.56、200.84±10.26对300,68±8.56,P<0.01)、抑制CTGF蛋白表达的作用都更加显著(分别为0.769±O.108、0.590±0.095、0.534±0.115对1.021±0.113,P<0.01).罗格列酮(1和10μmol/L)干预后可显著减少AGE诱导的Smad2的蛋白表达(分别为0.424±0.059对0.572±0.073,P<0.05;0.396±0.080对0.572±0.073,P<0.01),同时可显著减少AGE诱导的Smad4的蛋白表达(分别为0.580±0.063对0.672±0.059,P<0.05;0.556±0.051对0.672±0.059,P<0.01).结论 AGE刺激心肌成纤维细胞增殖及分泌TGF-β1,同时诱导CTGF、Smad2及Smad4蛋白表达,罗格列酮在一定程度上抑制AGE上述作用,表明罗格列酮抑制心肌成纤维细胞增殖的效应与CTGF/Smad通路密切相关.     

结核性气道狭窄中SIRT1对气管成纤维细胞增殖速度及分化的影响研究

目的观察沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)在结核性气道狭窄气道增生肉芽组织中的表达及对气管成纤维细胞增殖速度与分化的影响。方法免疫组化染色检测气道增生肉芽组织与正常组织中SIRT1与肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达水平。CCK-8法和流式细胞术分别检测细胞增殖活性与周期分布,免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)表达,蛋白质印迹法(Western blot)检测增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen I,CoL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ,CoL-Ⅲ)蛋白表达水平,qRT-PCR检测CoL-Ⅰ、CoL-ⅢmRNA表达水平。结果结核性气道狭窄组中SIRT1与TNF-α阳性表达率较正常对照组升高(P<0.05)。与TGF-β1组比较,siRNA-SIRT1+TGF-β1组气管成纤维细胞增殖水平下降(P<0.05),G0/G1期细胞比例减少而S期细胞比例增加(P<0.05),α-SMA阳性染色减弱,PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表达均下降(P<0.05), CoL-Ⅰ、CoL-ⅢmRNA表达也下降(P<0.05)。结论 SIRT1在结核性气道狭窄患者的气道增生肉芽组织中表达增加,沉默SIRT1可抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞的增殖速度与分化,并阻滞细胞周期。     

糖原合酶激酶-3β及DVL-1在大鼠心肌重塑中的表达

目的观察大鼠心肌重塑过程中心肌成纤维细胞DVL-1蛋白及糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)蛋白表达变化.方法采用颈静脉输注去甲肾上腺素(NE)方法复制大鼠心肌重塑病理模型,用超声检测心脏结构和收缩功能.应用Western blot技术检测大鼠心肌成纤维细胞GSK-3β及DVL-1蛋白质的表达水平.结果与对照组比较,实验组大鼠左心室心肌Ⅰ/Ⅲ胶原蛋白比值(6.2±1.5 vs 2.3±0.7)明显升高(P＜0.01);实验组左心室成纤维细胞GSK-3β蛋白表达水平(0.48±0.03,1.4±0.2)显著降低(P＜0.01);实验组DVL-1蛋白质的表达水平(4.3±0.3 vs 1.2±0.2),显著升高(P＜0.01).结论 NE致大鼠心肌重塑过程中GSK-3β蛋白表达显著降低,DVL-1蛋白表达显著升高,可能与心肌纤维化有关.     

促红细胞生成素对高糖环境诱导下体外培养心脏成纤维细胞的影响

目的探讨促红细胞生成素(EPO)对高糖环境诱导过程中体外培养的乳鼠心脏成纤维细胞(CF)增殖及其表型转化的影响。方法用乳鼠原代细胞培养CF,在促进CF细胞表型转化的过程中,选用高糖培养基进行诱导,添加EPO进行干预。将同一批CF细胞随机分为3组:对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、高糖+EPO组(25 mmol/L葡萄糖,20 k U/L EPO)。采用免疫组织化学法鉴定CF,酶联免疫吸附法检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量,Western blot检测纤维化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果免疫组织化学染色结果为纤维连接蛋白、波形蛋白阳性,α-肌动蛋白阴性,证实培养的细胞为心脏成纤维细胞。与对照组比较,高糖组Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达量都明显增加(P0.01),而高糖+EPO组Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达量都显著低于高糖组(P0.01)。高糖组α-SMA表达较对照组明显增高(P0.05),而高糖+EPO组α-SMA表达较高糖组明显降低(P0.05)。结论高糖环境下能有效的诱导CF发生表型转化,而EPO能够逆转在高糖环境作用下诱导发生的心肌纤维化。     

激活素A和卵泡抑素对大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原沉积的影响

目的探讨激活素A(Activin A)和卵泡抑素(FS)对体外培养的原代大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原沉积的影响。方法取出生24 h内Wistar乳鼠心肌成纤维细胞进行体外培养,分别向培养液中加入Activin A或FS+Activin A。应用MTT法检测细胞增殖情况,应用化学比色法检测培养液上清羟脯氨酸含量,RT-PCR法检测培养细胞Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)和Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)mRNA表达。结果与对照组相比,不同浓度Ac-tivin A组心肌成纤维细胞的OD值及羟脯氨酸含量明显增高(P<0.05～0.01),Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA表达水平明显升高。不同浓度FS组可降低心肌成纤维细胞的OD值及羟脯氨酸含量(P<0.05～0.01),下调Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA表达水平。结论 Activin A能够促进心肌成纤维细胞增殖及胶原沉积,提示Activin A可能在心肌间质纤维化的发生发展中起重要作用,FS能够拮抗Activin A诱导的心肌间质纤维化。     

敲低Tribbles同源蛋白3抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖

目的研究敲低Tribbles同源蛋白(TRIB)3对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响。方法用AngⅡ处理心肌成纤维细胞,实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western印迹法检测细胞中TRIB3表达情况。心肌成纤维细胞转染TRIB3 siRNA慢病毒载体,经AngⅡ处理后,qRT-PCR和Western印迹检测干扰效率。噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,羟脯氨酸法检测胶原合成,Western印迹法检测细胞中Ⅰ型胶原(COLL)Ⅰ、COLLⅡ和基质金属蛋白酶(MMP)-2蛋白表达,硝酸还原法检测培养液中一氧化氮(NO)含量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养液中诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)活性。结果 AngⅡ处理后的心肌成纤维细胞中的TRIB3表达水平升高(P0.01)。TRIB3 siRNA慢病毒载体可明显下调AngⅡ条件下心肌成纤维细胞中TRIB3的表达水平(P0.05)。AngⅡ处理后的心肌成纤维细胞增殖能力升高(P0.05),细胞胶原合成增多(P0.05),细胞中COLLⅠ、COLLⅡ蛋白水平升高(P0.05),MMP-2水平降低(P0.05),培养液中NO含量降低(P0.05),iNOS活性降低(P0.05)。下调TRIB3能够降低AngⅡ条件下心肌成纤维细胞增殖能力(P0.05),减少细胞胶原合成(P0.05),降低细胞中COLLⅠ、COLLⅡ蛋白表达(P0.05),促进细胞中MMP-2蛋白表达(P0.05),促进细胞分泌NO(P0.05),提高细胞iNOS活性(P0.05)。结论敲低TRIB3能够抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖,减少胶原合成,促进细胞分泌NO。     

上调PTEN表达对血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维化细胞增殖迁移的影响

目的探讨上调PTEN表达对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌成纤维化细胞增殖迁移的影响。方法将心肌成纤维化细胞随机分为空白对照组(未处理)、AngⅡ组(加AngⅡ处理)、AngⅡ+NC组(转染pcDNA3.1后,给予AngⅡ处理)和AngⅡ+PTEN组(转染pcDNA3,1-PTEN后,给予AngⅡ处理),采用脂质体2000转染细胞,并经AngⅡ处理后,Western blot检测各组细胞中PTEN蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞的周期变化,Transwell小室实验检测细胞的迁移能力;ELISA检测胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ含量。结果与空白对照组相比,AngⅡ组、AngⅡ+NC组和AngⅡ+PTEN组细胞中PTEN蛋白表达和G0/G1期细胞比例降低,而S期和G2/M期细胞比例、细胞增殖和迁移能力以及胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ含量升高;与AngⅡ组相比,AngⅡ+PTEN组细胞中PTEN蛋白表达和G0/G1期细胞比例升高,而S期和G2/M期细胞比例、细胞增殖和迁移能力以及胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ含量均降低;AngⅡ组与AngⅡ+NC组间差异无统计学意义。结论 PTEN在AngⅡ诱导心肌成纤维化细胞中表达下降,上调其表达可抑制AngⅡ诱导心肌成纤维化细胞增殖迁移和胶原蛋白的合成。     

哺乳类雷帕霉素靶蛋白信号通路对柯萨奇病毒B3诱导的心肌成纤维细胞Smad 3蛋白和Ⅰ型胶原表达调控的实验研究

目的 探讨哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对柯萨奇病毒B 3(CVB 3)诱导的心肌成纤维细胞Smad 3蛋白(Smad 3)和Ⅰ型胶原表达的调控作用.方法 CVB 3感染原代培养的SD鼠心肌成纤维细胞,用mTOR的抑制剂-雷帕霉素阻断mTOR信号通路,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测细胞Smad 3和Ⅰ型胶原表达.结果 (1)雷帕霉素干预心肌成纤维细胞48 h,RT-PCR检测mTOR/β-肌动蛋白(actin)光密度值分别为1 nmol/L组0.381±0.022、10 nmol/L组0.282±0.014、100 nmol/L组0.263±0.012,均低于对照组1.45±0.04,10 nmol/L组和100 nmol/L组低于1nmol/L组,差异均有统计学意义(P均＜0.05).10 nmol/L雷帕霉素干预心肌成纤维细胞0 h(对照组)、24 h、48 h、72 h,其mTOR/β-actin光密度值分别为0.341±0.022、0.203±0.021、0.163±0.022、0.144±0.013,光密度值随雷帕霉素干预时间的延长而降低(P＜0.05).(2)RT-PCR和Western blot测得对照组、CVB 3组、CVB 3+雷帕霉素组心肌成纤维细胞Smad 3/β-actin光密度值分别为0.63±0.06、1.18±0.03、0.77±0.08,Smad 3/β-actin灰度值分别为0.89±0.07、2.27±0.13、0.131±0.013.RT-PCR测得上述各组Ⅰ型胶原/β-actin光密度值分别为1.13±0.06、1.303±0.012、0.82±0.03.以上结果显示CVB 3组光密度值/灰度值高于对照组,CVB 3+雷帕霉素组低于CVB 3组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 雷帕霉素抑制CVB 3诱导的心肌成纤维细胞Smad 3和Ⅰ型胶原表达,提示mTOR信号通路可能通过调控Smad及Ⅰ型胶原表达,在CVB.3诱导的心肌纤维化过程中起重要作用.     

松弛素对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠血管外膜成纤维细胞胶原水平的影响

目的:探讨松弛素(RLX)对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的大鼠血管外膜成纤维细胞胶原水平的影响及机制。方法:体外培养大鼠主动脉外膜成纤维细胞,随机分为对照组、AngⅡ组(10-6 mmol/L),RLX组(100μg/L)及AngⅡ+RLX组。采用波形蛋白染色法鉴定血管外膜成纤维细胞,用RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达,用Western blot印迹法检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及转化生长因子(TGF)-β1蛋白的表达。结果:AngⅡ可显著增加培养液上清中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量及TGF-β1蛋白表达,而RLX明显抑制AngⅡ的上述作用;AngⅡ可显著下调细胞内MMP-2和MMP-9的蛋白表达,而RLX明显抑制AngⅡ的上述作用(均P<0.05)。结论:AngⅡ可刺激血管外膜成纤维细胞胶原合成增加,而RLX通过上调MMP-2、MMP-9表达和下调TGF-β1表达,抑制AngⅡ刺激的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白生成,从而发挥抗血管纤维化作用。