脂多糖对人近曲肾小管上皮细胞表面活性蛋白D及肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的:探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)表面活性蛋白D(suffactant protein D,SP-D)及肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的影响.方法:将体外培养HK-2细胞分为5组,分别给与0、0.1…1、5、10μg/mL LPS刺激8 h.免疫印迹和RT-PCR观察SP-D蛋白及mRNA表达变化,ELISA和RT-PCR观察TNF-α蛋白和mRNA表达变化.结果:1、5、10μg/mL LPS刺激8 h可引起HK-2细胞SP-D蛋白及mRNA表达显著降低(P<0.05),1、5、10μg/mL LPS刺激8 h可引起HK-2细胞TNF-α蛋白及mRNA表达显著增加(P<0.05).SP-D与TNF-α的表达呈负相关.结论:LPS刺激下TNF-α表达增加与SP-D的表达降低有关.SP-D可能在肾脏炎症反应中发挥重要作用.     

肿瘤坏死因子-α对内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响

目的:观察肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达TF及TFPI的影响.方法:设不同时间组,TNF-α 10 ng/mL分别培养0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h,另设不同溶度组,TNF-α 0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL分别培养6 h;ELISA法测定TF及,TFPI抗原的表达;RT-PCR检测TF及TFPI基因的表达.结果:各浓度的TNF-α对HUVECs的细胞活力无明显影响;TNF-α促进TF抗原的表达,并呈剂量和时间依赖关系,在TNF-α 10 ng/mL作用6 h时最明显(P＜0.01);TNF-α促进TF mRNA的表达,并呈剂量和时间依赖关系,在3 h时达到高峰(P＜0.01);TNF-α对HUVECs表达TFPI抗原及TFPI mRNA无明显影响.结论:TNF-α可以诱导HUVECs细胞表达TF:TNF-α对HUVECs细胞TFPI的表达无明显影响.     

海水干预下人肺泡上皮细胞低氧诱导因子1α与TNF-α、IL-6表达的变化

目的:探讨海水干预对人肺泡上皮细胞低氧诱导因子1α蛋白及TNF-α、IL-6表达的影响.方法:肺泡上皮细胞来源的A549细胞系,分为正常对照组(C)和海水处理组(S).C组用新鲜培养基常规培养,S组经灭菌配方海水孵育0.5、1、2、4、8、16h,蛋白免疫印记法(western blot)检测各组细胞HIF-1α蛋白的表达,放射免疫法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6的含量.结果:(1)HIF-1α在海水干预1h后开始升高,4h达高峰(P＜0.01),此后下降,但仍显著高于对照组(P＜0.01).(2)TNF-α与IL-6在海水干预1h后开始升高,2h达高峰(P＜0.01),4h及8h组较对照组无统计学差异.结论:海水干预可诱导肺泡上皮细胞HIF-1α蛋白及炎性因子TNF-α、IL-6的表达;HIF-1α在海水干预致肺泡上皮细胞炎症反应过程中可能起重要作用.     

高迁移率族蛋白B1对大鼠脾脏树突状细胞细胞因子表达的影响

目的 观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对树突状细胞(dendritic cells,DC)细胞因子蛋白合成和基因表达的影响.方法 分离正常Wistar大鼠脾脏DC后置于96孔培养板(1×105/孔),给予重组HMGB1刺激,研究HMGB1刺激与TNF-α,IL-12蛋白合成和基因表达的时间-效应关系,24孔细胞随机分为6组:正常对照24 h组(4孔/组)、正常对照48 h组(4孔/组)、正常对照72 h组(4孔/组)、HMGB1 24 h组(4孔/组)、HMGB1 48 h组(4孔/组)和HMGB1 72 h组(4孔/组),后3组分别以1 μg/mLHMGB1 刺激.刺激相应时间检测TNF-α,IL-12 mRNA的表达和蛋白水平.研究HMGB1刺激与TNF-α,IL-12蛋白合成和基因表达的剂量-效应关系,16孔细胞随机分为4组:正常对照组(4孔/组)、0.1μg/mL组(4孔/组)、1 μg/mL组(4孔/组)和10 μg/mL组(4孔/组),分别以相应剂量HMGB1刺激.刺激后48 h后检测TNF-α、IL-12 mRNA的表达和蛋白水平.应用Promega公司mRNA提取试剂盒裂解收集的DC,提取细胞mRNA.采用SYBR Green real-time(实时荧光定量)PCR技术检测TNF-α mRNA,IL-12mRNA表达水平.以三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)作为内参对照.扩增产物经Fast 7500 real-time PCR仪处理,作相对定量(RQ)分析.以ELISA试剂盒检测各组上清中IL-12,TNF-α蛋白水平.数据进行单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 1 μg/mL HMGB1 刺激后,脾脏DC IL-12,TNF-α蛋白合成和基因表达均分别于24～72 h明显上调(P<0.05或P<0.01),其中以作用48 h后其表达上调尤为显著(P<0.01);0.1/.μg/mL,1 tcVmL,10μg/mL HMGB1刺激48 h均可诱导DC IL-12、TNF-α蛋白合成和基因表达增强(P<0.01),其中HMGB1浓度在1 μg/mL时,DC IL-12和TNF-α蛋白合成和基因表达表达最明显(P<0.01).结论 HMGB1诱导DC成熟分化过程中能促进DC合成、释放IL-12和TNF-α,从而发挥其免疫调节作用.     

核因子-κB对胰腺AR42J细胞肿瘤坏死因子-α表达的调控

目的 探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对胰腺腺泡AR42J细胞细胞因子表达的影响及其可能机制,进一步阐明急性胰腺炎的发病机制.方法 用不同质量浓度的LPS(0.001,0.01,0.1,1,10,100 mg/L)刺激AR42J细胞18 h,同时用10mg/L的LPS刺激AR42J细胞不同时间(2,6,12,18,24h),RT-PCR检测核因子-κB(NF-κB)P65和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达的变化,放射免疫法(RIA)检测培养液上清TNF-α蛋白浓度的改变.对NF-κB(P65)mRNA的表达与TNF-α mRNA的表达进行相关和回归分析.结果 RT-PCR结果表明0.001 mg/L的LPS处理AR42J细胞时即可出现TNF-α及NF-κB(P65)mRNA表达的明显上调,且呈量效关系;用10 mg/L的IPS处理后,在2 h后即可出现TNF-α及NF-κB(P65)mRNA表达的明显上调,并且呈时效关系.RIA结果表明用0.01 mg/L的LPS处理AR42J细胞后即可出现TNF-α蛋白表达的明显上调,且呈量效关系;用10mg/L的LPS处理后,在6 h后即可出现TNF-α蛋白表达的明显上调,并且呈时效关系.TNF-α mRNA的表达与P65 mRNA的表达呈正相关.结论 LPS可以以时间剂量依赖方式地刺激AR42J细胞NF-κB(P65)和TNF-α的表达,NF-κB(P65)mRNA的表达与TNF-αmRNA的表达呈正相关.针对NF-κB靶点,抑制其活性,可为包括AP的治疗提供一条新的途径.     

缺血后处理对脑缺血再灌注大鼠TNF-α和IL-1β表达影响

目的探讨缺血后处理（IP）对局灶性脑缺血再灌注（I／R）大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β （IL-1β）表达的影响。方法将110只成年健康雄性SD大鼠随机分为假手术组（sham组）10只、I／R组和IP组各50只,后两组根据再灌注时间每组又分为6、12、24、48、72h等5个亚组。采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑I／R模型,后处理方法为大脑中动脉阻闭2h后,再灌注15 s-缺血15S,反复3次。对各组进行神经行为学评分,TTC染色测定脑梗死体积,免疫组化法检测脑组织TNF-α和IL-1β蛋白表达,原位杂交法检测TNF-α和IL-1β mRNA的表达。结果I／R组大鼠可见神经行为学的缺失及缺血侧大脑半球的梗死,与之相比,IP组大鼠脑梗死体积明显减小、神经行为学评分改善（t=2．683～5．657,P〈0．05）。TNF-α、IL-1β蛋白及mRNA在sham组额顶叶有微弱表达,其在I／R组和IP组的表达于再灌注6h时开始升高,24h达高峰。与I／R0．05）。结论IP可显著下调TNF—α和IL-1β的表达,缩小I／R大鼠的脑梗死体积,提示IP可抑制I／R的炎性反应,从而发挥神经保护作用。     

辛伐他汀对脂多糖诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞钠通道α亚基的影响

目的 通过体外给药的方式观察辛伐他汀对脂多糖(LPS)诱导的原代培养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)钠通道α亚基(α-ENaC)mRNA表达的影响.方法 ATⅡ细胞原代培养,分为空白对照组、LPS损伤组(终浓度1 mg/L)、辛伐他汀低和高剂量组(20μmol/L、30μmol/L)、溶剂对照组.分别于培养1、12、24 h用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-1 β(IL-1β)的浓度,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中α-ENaC mRNA表达.结果 LPS损伤后1、12、24 h时TNF-α、IL-1β浓度均较空白对照组显著升高.辛伐他汀低剂量组1、12、24h TNF-α(ng/L)和IL-1β(ng/L)均较LPS损伤组明显下降(TNF-α 1h:1178.80±127.43比2336.00±170.04,12 h:1003.60±59.61比2479.80±210.41,24 h:695.80±25.24比1167.60±132.72;IL-1β 1 h:285.00±42.60比429.60±27.39,12 h:238.60±24.12比822.20±12.74,24 h:213.40±17.87比637.60±22.96,均P＜0.05),高剂量组较低剂量组下降更明显(TNF-α1h:965.60±24.45比1178.80±127.43,12 h:522.80±16.89比1003.60±59.61,24 h:252.40±17.64比695.80 ±25.24;IL-1β 1 h:225.60±34.44比285.00 ±42.60,12 h:190.60 ±17.64比238.60±24.12,24 h:152.80±14.70比213.40±17.87,均P＜0.05),但仍较空白对照组明显上升.在培养1h时各组α-ENaC mRNA表达差异均无统计学意义.培养12h、24 h时,LPS损伤组α-ENaC mRNA表达(A值)明显低于空白对照组(12 h:0.211±0.021比0.496±0.027,24 h:0.253±0.030比0.482±0.030,均P＜0.05);辛伐他汀低剂量组α-ENaC mRNA表达均较LPS损伤组明显上升(12 h:0.363 ±0.030比0.211±0.021,24 h:0.309±0.024比0.253±0.030,均P＜0.05),高剂量组较低剂量组升高更明显(12h:0.413±0.034比0.363±0.030,24h:0.346±0.024比0.309±0.024,均P＜0.05),但仍较空白对照组明显下降.空白对照组与溶剂对照组各指标差异无统计学意义.结论 大剂量辛伐他汀可上调LPS诱导的大鼠ATⅡ细胞α-ENaC mRNA表达,其机制可能与调节TNF-α、IL-β的分泌有关.     

高渗盐水抑制肿瘤坏死因子-α表达与减轻脑水肿的相关性

目的:探讨10％高渗盐水减轻缺血再灌注损伤大鼠脑水肿与抑制小胶质细胞分泌TNF-α是否相关.方法:取72只雄性清洁级SD大鼠,随机分为假手术组、梗死组、10％高渗盐水(Hypertonic saline HS)组,MCAO法建立脑缺血再灌注动物模型,于再灌注开始时分别给予生理盐水或10％HS.相应时间点处死大鼠,检测脑含水量;治疗12h组分别用Western Blot、RT-RCR法检测TNF-α蛋白与mRNA的表达量;治疗24 h组用免疫荧光双标法检测缺血灶周围TNF-α与小胶质细胞的表达.用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析.结果:与假手术组相比,脑梗死组脑含水量显著增加,12h亚组TNF-α蛋白以及mRNA表达亦显著增加(P＜0.05),而10％HS组脑含水量较脑梗死组减少,TNF-α蛋白以及mRNA表达亦显著下降(P＜0.05);免疫荧光双标结果显示,与假手术组相比,脑梗死组24 h亚组TNF-α表达升高,而10％HS组较梗死组TNF-α表达下降,各组TNF-α与小胶质细胞不同程度共定位表达.结论:10％HS可以通过抑制小胶质细胞释放TNF-α减轻缺血再灌注损伤所致脑水肿.     

创伤性休克大鼠多脏器TNF-α表达的变化及意义

目的 研究TNF-α在创伤性休克大鼠多脏器中的表达变化,探讨TNF-α在创伤性休克发生发展过程中的意义.方法 取健康成年SD大鼠56 只,体质量200～300 g,雌雄各半,随机分为对照组,复苏组和休克1、2、4、8、24 h组,每组8只,观察各组的死亡率,分别采用RT-PCR法及免疫组化法测定各组肝、脑组织的TNF-α mRNA和肝、脑、肺、肾组织的TNF-α蛋白表达水平.结果 对照组和复苏组大鼠均无死亡,休克1 h组死亡率为1/8,2 h和4 h组死亡率为2/8,8 h组死亡率为4/8,24 h组死亡率为5/8;TNF-α mRNA表达在休克后2 h明显升高,肝组织TNF-α mRNA表达水平高于脑组织(P<0.05);肺、肝、肾组织的TNF-α蛋白表达在休克1 h后即开始升高(P<0.05),脑组织TNF-α蛋白表达水平较低,趋势不明显,但复苏组的肝、脑组织的TNF-α mRNA和蛋白表达较对照组无明显升高(P>0.05).结论 创伤性休克早期以低血容量表现为主,主要不是由TNF-α介导的;而后期则与TNF-α水平升高相关.     

肿瘤坏死因子-α和血浆纤溶酶原激活抑制物-1与动脉粥硬化相关性研究

目的探讨脂肪组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血浆纤溶酶原激活抑制物-1(PAI-1)mRNA转录量和蛋白表达量与动脉粥样硬化的相关性,从而揭示脂肪组织中TNF-α、PAI-1用于动脉粥样硬化分型的临床价值。方法选取60例动脉粥样硬化患者,按照病灶类型分为A组(I型病灶)、B组(Ⅱ型病灶)、C组(Ⅲ型病灶)、D组(Ⅳ型病灶)、E组(V型病灶)和F组(Ⅵ型病灶)。使用RT-PCR检测6组患者脂肪组织中TNF-α、PAI-1mRNA转录量(以β-actin为内参),使用Western Blot检测6组脂肪组织中TNF-α、PAI-1蛋白表达量(以β-actin为内参)。分析TNF-α、PAI-1mRNA转录量和蛋白表达量之间的相关性。结果随着动脉粥样硬化病灶严重程度的增加,TNF-α、PAI-1mRNA转录和蛋白表达水平均显著增加(P均<0.05),且TNF-α、PAI-1mRNA转录和蛋白表达水平具有显著正相关性(r=0.9488,P<0.01;r=0.9659,P<0.01)。结论脂肪组织TNF-α、PAI-1mRNA转录水平和蛋白表达水平与动脉粥样硬化病灶分型具有正相关性,且TNF-α和PAI-1呈正相关性。脂肪组织TNF-α、PAI-1检测对动脉粥样硬化病灶分型具有诊断价值。。     

补阳还五汤对大鼠脑缺血后白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的 探讨补阳还五汤对脑缺血后大鼠脑组织白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响.方法 按随机数字表法将SD大鼠分为正常对照组、假手术组、模型组、补阳还五汤组,后3组再按给药后1、3和7 d分为亚组,每组5只.采用大脑中动脉闭塞法(MCAO)建立右侧局灶性脑缺血大鼠模型;补阳还五汤组于术后2 h起灌服补阳还五汤10 ml/kg(14.2 g/kg)、每日1次.分别于相应时间点处死大鼠后取脑组织,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定IL-1β和TNF-α的蛋白及mRNA表达.结果 正常对照组和假手术组有低水平的IL-1β和TNF-α蛋白及mRNA表达.模型组IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA表达于给药后1 d开始升高,IL-1β蛋白及mRNA表达在3 d时达高峰后开始下降,TNF-α蛋白及mRNA表达于7 d达高峰.与模型组比较,补阳还五汤组给药后1、3和7 d脑组织中IL-1β和TNF-α蛋白及mRNA表达均明显下降[IL-1β蛋白(ng/L),1 d:90.290±8.693比102.556±13.934,3 d:129.632±11.050比150.117±8.552,7 d:66.185±9.020比91.362±9.901;TNF-α蛋白(ng/L),1 d:210.341±19.247比236.887±20.137,3 d:267.503±21.006比322.659±15.068,7 d:299.637±17.717比386.678±16.297;IL-1β mRNA,1 d:0.54±0.09比0.64±0.11,3 d:0.80±0.06比0.89±0.07,7 d:0.70±0.09比0.78±0.08;TNF-α mRNA,1 d:0.64±0.09比0.73±0.11,3 d:0.74±0.13比0.85±0.07,7 d:0.82±0.07比0.93±0.08],差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 补阳还五汤可能通过下调缺血脑组织IL-1β和TNF-α的蛋白及mRNA表达来调控炎症因子的释放,从而起到脑保护作用.     

多发创伤患者血清α-黑色素细胞刺激素的变化

目的 通过监测多发创伤患者血清α-MSH和TNF-α的动态变化,探讨其与创伤患者病情的关系.方法 山西医科大学第一医院急诊科收治的50例多发创伤患者根据ISS评分分两组,中重型(ISS 16～25分)30例,特重型(＞25分)20例,健康对照组15例.分别于伤后1、3、5、7d抽取静脉血,分离血清后采用酶联免疫吸附双抗体夹心(ELISA)方法测定血清α-MSH和TNF-α的含量.采用SPSS 13.0统计软件处理,多组均数间比较进行方差齐性检验和重复测量方差分析(Repetitive measure ANOVA),以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 两组创伤患者伤后24h内、3d、5d、7d血清α-MSH含量均显著低于健康对照组(P＜0.01),特重型组比中重组更加明显(P＜0.01);两组患者伤后24 h内、3d、5d、7d血清TNF-α含量均显著高于健康对照组(P＜0.01),特重型组比中重组更加明显(P＜0.01);伤后24 h、5d、7d血清α-MSH和TNF-α呈负相关.结论 创伤后血清α-MSH含量下降且创伤越重下降越明显,血清TNF-α含量上升且创伤越重上升越明显,二者总体呈负相关.     

TNF-α诱导宫颈癌细胞增殖、转移和耐药相关基因表达的时效分析

目的探讨肿瘤坏死因子（TNF-α）对宫颈癌Hela细胞增殖、转移和化疗耐药相关基因表达的影响。方法以外源性TNF-α作用于宫颈癌Hela细胞。作用不同时间点（0—24h）取样分析细胞周期蛋白cyclinD1,锌指蛋白A20,钙调神经磷酸酶CaN,基质金属蛋白酶（MMP-1,MMP-9）,金属硫蛋白（MT-1,MT-2）等表达的时间一效应。结果TNF-α作用宫颈癌Hela细胞不同时间段（20min,1h,6h,24h）,cvclinD1、A20、CaN、MMP-1、MMP-9、MT-1、MT-2 mRNA的表达都有不同程度改变。RT—PCR检测宫颈癌Hela细胞经TNF-α作用后cyclinD1、MMP-1、MT-2 mRNA的表达6小时达高峰24小时回落,A20、CaN、MMP-9、MT-1 mRNA表达1小时达高峰24小时回落。结论TNF-α诱导宫颈癌Hela细胞cyclin D1、A20、CaN、MMP-1、MMP-9、MT-1、MT-2 mRNA的表达具有时效性。TNF-α可能促进宫颈癌Hela细胞增殖、转移及耐药。     

缺氧诱导因子-1α对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其信号转导

目的 观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对大鼠心肌缺血/再灌注损伤(IRI)的保护作用及蛋白激酶C(PKC)信号转导作用.方法 采用结扎冠状动脉左前降支30 min、再灌注180 min的方法建立IRI动物模型.将32只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为假手术组、IRI组、缺血预处理(IPC)组、IPC加PKC抑制剂组(IPC+Ⅰ组,IPC前静脉注射PKC抑制剂白屈菜季铵碱5 mg/kg),每组8只.再灌注180 min后取出心脏,测定HIF-1α、血红素氧合酶1(HO-1)的mRNA和蛋白以及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白的表达;心内取血测定白细胞介素-8(IL-8)和髓过氧化物酶(MPO)水平.结果 与假手术组比较,IRI组心肌HIF-1α、HO-1的mRNA和蛋白及caspase-3蛋白表达均明显增多(HIF-1α mRNA:0.849±0.032比0.356±0.022,HIF-1α蛋白:0.762±0.042比0.324±0.016,HO-1 mRNA:0.862±0.045比0.332±0.012,HO-1蛋白:0.792±0.044比0.335±0.031,caspase-3蛋白:0.371±0.015比0.061±0.012,均P＜0.01),血IL-8、MPO显著升高[IL-8:(812±26)ng/L比(72±13)ng/L,MPO:(78.7±2.9)kU/L比(13.3±1.5)kU/L,均P＜0.01].与IRI组比较,IPC组HIF-1α、HO-1的mRNA和蛋白表达(HIF-1α mRNA,1.412±0.039,HIF-1α蛋白:1.362±0.045,HO-1 mRNA:1.523±0.038,HO-1蛋白:1.420±0.041)明显增多,caspase-3蛋白表达(0.129±0.019)明显降低(均P＜0.01),血IL-8[(432±59)ng/L]和MPO水平[(43.2±5.9)kU/L)明显降低(均P＜0.01).IPC+Ⅰ组各指标与IRI组无明显差异.结论 HIF-1α对心肌IRI具有重要保护作用,HIF-1α的表达是依赖PKC激活的,PKC是HIF-1α表达的重要信号转导通路.     

B16F10黑素瘤细胞培养上清液对脂多糖刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α和一氧化氮的影响

目的 探讨B16F10黑素瘤细胞培养上清液对脂多糖(LPS)刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和一氧化氮(NO)的影响.方法 体外培养同基因小鼠腹腔巨噬细胞,分为实验组和空白对照组.实验组加入B16F10黑素瘤细胞培养上清液,空白对照组加入RPMI 1640完全培养基,分别用LPS刺激后继续培养24 h,采用免疫细胞化学染色法及L929细胞抑制实验[四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法]检测巨噬细胞TNF-α的表达及活性,Griess法检测NO的含量.结果 实验组TNF-α阳性表达较空白对照组明显减少,TNF-α活性较空白对照组明显降低[吸光度(A值):0.746±0.049比0.387±0.030,P＜0.01];巨噬细胞释放NO的水平明显低于空白对照组(μmol/L:4.830± 1.384比11.455±0.175,P＜0.01).结论 B16F10黑素瘤细胞培养上清液对LPS诱导的同基因小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α、NO具有抑制作用.     

TNF-α诱导宫颈癌细胞增殖、转移和耐药相关基因表达的时效分析

目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF-α)对宫颈癌Hela细胞增殖、转移和化疗耐药相关基因表达的影响.方法 以外源性TNF-α作用于宫颈癌Hela细胞,作用不同时间点(0-24h)取样分析细胞周期蛋白cyclinD1,锌指蛋白A20,钙调神经磷酸酶CaN,基质金属蛋白酶(MMP-1,MMP-9),金属硫蛋白(MT-1,MT-2)等表达的时间-效应.结果 TNF-α作用宫颈癌Hela细胞不同时间段(20min,1h,6h,24h),cyclinD1、A20、CaN、MMP-1、MMP-9、MT-1、MT-2 mRNA的表达都有不同程度改变.RT-PCR检测宫颈癌Hela细胞经TNF-α作用后cyclinD1、MMP-1、MT-2 mRNA的表达6小时达高峰24小时回落,A20、CaN、MMP-9、MT-1mRNA表达1小时达高峰24小时回落.结论 TNF-α诱导官颈癌Hela细胞cyclinD1、A20、CaN、MMP-1、MMP-9、MT-1、MT-2 mRNA的表达具有时效性.TNF-α可能促进宫颈癌Hela细胞增殖、转移及耐药.     

乙酰胆碱酯酶在脂多糖诱导肺泡巨噬细胞中的变化

目的 观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激大鼠肺泡巨噬细胞NR8383后乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ACHE)的表达变化,为研究胆碱能抗炎通路的调控提供新的实验依据.方法 将体外去致热源培养的NR8383细胞分为对照组及LPS(1μg/mL)刺激组,于刺激后3、6、12、24 h各时间点分别离心收集上清液及细胞沉淀,采用酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)测定上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的变化,实时定量PCR检测细胞中AChE mRNA的表达改变,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测细胞中AChE蛋白的表达变化,乙酰胆碱酯酶T-CHE测试盒检测上清液中AChE活性的变化.组间多重比较采用单因素方差分析,进一步采用LSD-t检验进行两两比较,P＜0.05为差异具有统计学意义.结果 与对照组相比,TNF-α的含量在LPS刺激NR8383细胞后3h开始显著上升(P＜0.05),12 h达高峰,24 h下降但仍明显高于对照组水平(P＜0.05).与对照组相比,AChE mRNA于刺激后3h开始上升,升高(3.19±0.44)倍(P＜0.05),6h后达高水平并维持于此水平,6、12、24 h分别上调[(5.65±0.63)、(5.40±0.71)、(5.35±0.77)[倍(与对照组相比,均P＜0.05);AChE蛋白的表达及上清液中AChE的活性在LPS刺激后12 h与各自对照组相比均上升[AChE蛋白:(1.37±0.01) vs.(1.05±0.02),P＜0.05; AChE活性:(6.14±1.13) U/mLvs.(2.64±0.85) U/mL,P＜0.05],随后呈下降趋势,于LPS作用24 h时均低于各自对照组[AChE蛋白:0.65±0.05,P＜0.05,AChE活性:(0.56±0.19)U/mL,P＜0.05].结论 LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞后,AChE的表达增加,提示其可能参与肺泡巨噬细胞炎症反应的调控;LPS刺激后24 h,AChE mRNA仍处于高表达水平,AChE蛋白及活性却下降,提示在肺泡巨噬细胞炎症反应中可能存在AChE转录后水平的调控.     

脂多糖诱导大鼠主动脉内皮细胞表达血管性血友病因子裂解酶的研究

目的 从剂量-效应和时间-效应关系探讨脂多糖(LPS)对大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS-13)mRNA和蛋白表达的影响.方法 采用组织贴块法培养Wistar大鼠的RAECs,1周后按1∶3传代至第4～5代,将细胞分为空白对照组和0.01、0.1、1、5 μg/ml LPS刺激组,分别于12、24、48、72 h用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定内皮细胞ADAMTS-13 mRNA表达;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液内ADAMTS-13蛋白水平.结果 空白对照组有一定量的ADAMTS-13mRNA和蛋白表达.随着LPS刺激浓度增加和刺激时间延长,ADAMTS-13 mRNA和蛋白表达逐渐下降.与空白对照组(25.22±1.41)比较,0.01μg/ml LPS刺激48 h时ADAMTS-13 mRNA表达(18.78±0.86)即明显下降(P＜0.01);0.1μg/ml和1μg/ml LPS刺激24 h时ADAMTS-13 mRNA表达(23.43±0.63、22.41±0.76)即明显下降(P＜0.05和P＜0.01);5μg/ml LPS刺激12 h时ADAMTS-13 mRNA表达(20.01±2.47)即明显下降(P＜0.01).与空白对照组[(115.76±2.36)ng/ml]比较,0.01 μg/ml LPS刺激12 h时ADAMTS-13蛋白表达[(113.43±1.07)ng/ml]即明显下降(P＜0.05);至5 μg/ml LPS刺激72 h时ADAMTS-13蛋白表达[(7.63±2.64)ng/ml]降至最低(P＜0.01).结论 RAECs有一定量的ADAMTS-13mRNA和蛋白表达;不同浓度LPS刺激内皮细胞不同时间后ADAMTS-13 mRNA和蛋白表达降低,具有剂量依赖性和时间依赖性.     

胰岛素对烧伤血清致心肌细胞凋亡的保护作用

目的 探讨胰岛素对烧伤血清致心肌细胞凋亡的保护作用及机制.方法 通过烧伤血清作用的心肌细胞模型,用胰岛素及其信号通路抑制剂SB203580、LY294002进行干预.蛋白质免疫印迹法检测心肌细胞内活化型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase-3)、Bax和磷酸化核转录因子-κB抑制因子α(p-IκBα)的表达;定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达;Hoechst 33258核染色法检测心肌细胞凋亡.同时通过阻断实验,初步研究胰岛素保护心肌细胞作用的信号通路.结果 胰岛素能够明显降低烧伤血清作用的心肌细胞cleaved-caspase-3(2.22±0.30比4.84±0.74,P＜0.01)、Bax(1.33±0.35比3.74±0.65,P＜0.01)和p-IκBα( 1.43±0.62比3.62±0.74,P＜0.01)的表达;显著抑制TNF-α表达(0.72±0.27比2.02±0.63,P＜0.01);降低心肌细胞的凋亡率[(9.4±3.4)％比(19.1±5.6)％,P＜0.01].阻断实验结果显示,胰岛素活化磷酯酰肌醇-3-激酶/蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K/Akt)通路的抑制剂LY294002能够抵消胰岛素的保护作用;而p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)通路活化抑制剂SB203580则能够抑制烧伤血清引起的心肌细胞损害,与胰岛素作用相当.结论 在烧伤血清作用的心肌细胞模型,胰岛素可能通过对PI3K/Akt和p38MAPK通路的调控发挥其对心肌细胞的抗炎、抗凋亡作用.     

脂多糖对AR42J细胞核因子-κB、肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的 探讨NF-κB在急性胰腺炎(AP)发病过程中对TNF-α基因的转录调节作用,以便有助于从基因转录调节的水平寻找AP治疗的新靶点.方法 以10 mg/L脂多糖刺激AR42J细胞构建急性胰腺炎的体外模型,设2 h、6 h、12 h、18 h和24 h共5个时间点,每时间点设3个复孔.逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)半定量法观察肿瘤坏死因子(TNF-α)/p65亚单位mRNA表达的变化;ELISA法检测TNF-α在细胞上清中质量浓度的变化;链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(SABC)检测p65蛋白在AR42J细胞中的表达.人工碘比色法观察培养液上清中淀粉酶的活性改变.结果 脂多糖刺激后,AR42J细胞以时间依赖方式上调TNF-α和p65 mRNA的表达,并伴随TNF-α蛋白的表达增加;TNF-α与p65表达具有直线相关性(P＜0.01).p65蛋白亦呈时间依赖方式表达增强,24 h表达最强.各组间淀粉酶无明显改变(P＞0.05).结论 在脂多糖诱导的胰腺腺泡细胞AR42J炎性效应中,NF-κB表达且活性增强,调控着致炎细胞因子TNF-α的表达.