携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

表达mFasL的新型双顺反子逆转录病毒基因转移体系的建立

为建立表达小鼠 Fas配体 (m Fas L)的内部核糖体进入位点 (IRES)串联的双顺反子新型逆转录病毒基因转移体系 ,用基因重组技术将 m Fas L c DNA基因构建到 IRES双顺反子逆转录病毒载体 (PL XIN)中 ,脂质体法将此重组质粒 PL FIN和空载体 PL XIN分别转染包装细胞 (PA317) ,经 G418筛选出抗性包装细胞克隆 ,基因组 DNA PCR测定基因整合情况。并将抗性 PA317克隆培养上清感染小鼠成纤维细胞系 (NIH3T3) ,筛选出高滴度的 PA317细胞系 ;用流式细胞术测定筛选的 NIH3T3细胞目的基因表达状况 ;以抗性 NIH3T3和 Fas+Yac- 1细胞共培养法检测目的基因的生物学活性。筛选出 12个 PL FIN转染的 PA317细胞克隆中 ,最高产毒效价为 8.5× 10 5CFU(colony- form ing- unit) ;经此上清感染、筛选出的 NIH3T3细胞 ,高表达 m Fas L (阳性率高于对照组 5 2 .5 4% ) ;且能显著诱导 Fas+Yac- 1细胞凋亡 (凋亡率高于对照组 49% )。说明成功建立了表达 m Fas L 的双顺反子逆转录病毒基因转移体系     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的构建及鉴定

目的构建葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础.方法质粒pCMV4-GKZ1经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX-GK,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染PLX-GK至包装细胞PA317,检测培养上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定.结果构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX-GK,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;建立了稳定产毒细胞系PA317/GK,其培养上清平均病毒滴度为6.8×105cfu/ml,最高为1.8×106cfu/ml,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA317/GK细胞基因组并有GK的表达.结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系.     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

携HBx基因逆转录病毒载体的构建

【目的】构建携HBx基因的逆转录病毒载体 ,为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因 ;将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX ,构建质粒 pLNSHBx ,磷酸钙 DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317,检测培养上清病毒滴度。【结果】应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因 ,并经序列分析证实 ;建立了产病毒细胞株PA317/HBx ,检测其培养上清病毒滴度为 8.9× 10 4 CFU ,PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。     

TH基因逆转录病毒表达载体的构建及产病毒细胞系的建立

目的　构建含有鼠酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH,建立 PA317产病毒细胞系。方法　将质粒 p GEM- 2上酶切下的 THc DNA片段与线性化的逆转录病毒表达载体 N2 A连接 ,克隆出重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH。把 p N2 ATH质粒转入 PA317包装细胞 ,通过 G4 18抗性筛选 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,得到高滴度产毒 PA317/p N2 ATH细胞株 ,免疫组化测定细胞 TH表达。结果　重组质粒 p N2 ATH经酶切鉴定证明 THc DNA正向插入 N2 A表达载体中 ,PA317/p N2 ATH产毒细胞高效表达 TH。结论　成功地构建了重组逆转录病毒表达载体p N2 ATH,建立了 PA317/p N2 A产毒细胞株     

mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

目的：构建 mIL-12重组逆转录病毒载体。方法：将 mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果：重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论：包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。     

含绿色荧光蛋白和PLCZ的逆转录病毒载体的构建及其在SHG44细胞中的表达

目的构建含有PLC-γ1分子Z区(PLCZ)和绿色荧光蛋白基因的双顺反子逆转录病毒载体,并将其导入SHG44胶质瘤细胞中,以探索PLC-γ1分子对胶质瘤细胞侵袭作用的影响. 方法 PCR法扩增PLCz基因,测序后克隆入pIRES-EGFP荧光蛋白表达载体中,酶切鉴定重组体. 将PLCz-IRES-EGFP片段克隆入逆转录病毒载体pLXSN的相应位点,构建含有PLCz和EGFP基因的逆转录病毒载体,脂质体介导下转染包装细胞PA317,G418筛选并检测病毒滴度后挑选细胞克隆. 病毒上清感染人脑胶质瘤SHG44细胞,G418筛选获得稳定转染细胞,PCR检测外源基因的整合,Northern blot检测外源基因的转录,Western blot和荧光显微镜分别检测PLCz分子和EGFP的表达. 结果 PCR扩增得到大小约650 bp的特异性条带,序列测定结果与发表序列一致. 构建得到含有PLCz和EGFP基因的双顺反子逆转录病毒载体,转染人脑胶质瘤细胞SHG44,得到稳定转染的细胞株SHG44-PIE. PCR扩增显示目的片段已整合入细胞基因组. Northern blot分析显示为单一的转录本. Western blot可见大小约50×103的特异性条带,荧光显微镜检测显示EGFP获得良好表达. 结论成功构建含有PLCz和绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体,并获得稳定转染该载体的SHG44胶质瘤细胞株.     

新抑癌基因PIGl1高表达HepG2细胞株的建立

目的构建人PIGll逆转录病毒载体，建立高表达PIGll基因的HepG2细胞，为进一步研究PIGll基因在肝癌细胞中的功能提供一个理想的试验平台。方法将已有的peDNA3，1／NT—GFP—PIGll质粒用PCR法扩增出PIGll片段，构建含人PIGllcDNA的重组质粒pLXSN—PIGll。重组载体经PcR鉴定和DNA测序分析。将该重组质粒用lipofeetamine^TM 2000转染包装细胞PA317，获得DLXSN—PIGll逆转录病毒。用病毒感染HepG2细胞，获得PIGll高表达的HepG2细胞株。结果获得384bp人PIGll基因，测序证明PIGlleDNA编码序列与Genbank中报道的一致，转染PA317细胞后用病毒上清感染HepG2细胞，经RT—PcR检测发现HepG2细胞中PIGllmRNA表达明显升高。结论成功构建了高表达PIGll基因的HepG2细胞株，为进一步研究其生物学行为奠定了基础。     

CTLA4Ig表达质粒的基因枪转染皮肤及细胞的实验研究

目的 利用基因枪技术提高CTLA4Ig的cDNA的转染效率。方法 设基因枪局部转染组，注射器局部注射组和肌肉注射组，并构建pCTLA4Ig-IRES2-EGFP表达载体，将质粒注射入皮肤，观察三种方法转移CTLA4Ig目的DNA的存留时间。同时，体外培养ECV，293细胞，用基因枪或逆转录病毒载体转染上述质粒，观察质粒的转染及表达情况。结果 基因枪转移基因至细胞，皮肤的效率明显好于其他方法，但对细胞，基因枪的初始压力不能太高，否则，细胞容易死亡。结论 基因枪转染CTLA4Ig质粒效率较高。     

Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体.方法利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES-EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1-IRES-EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP E86和PA317,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;"乒乓球"法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT-PCR法分别检测细胞荧光和Delta1 mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能.结果酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1-IRES-EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9.7×105 CFU/ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT-PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化.结论逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达.     

野生型p53基因对白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:建立携野生型p53基因的K562细胞株,研究该细胞内野生型p53基因的表达并观察其生物学特性。方法:构建重组人p53逆转录病毒载体,导入PA317细胞中进行包装,经过病毒滴度测定,筛选高滴度的产病毒细胞克隆。收集培养上清液中的重组人p53逆转录病毒颗粒,感染K562靶细胞,建立携野生型p53基因的K562细胞株。观察该细胞株的生长方式、形态学和生长速度。SP免疫组化染色法检测p53蛋白表达。进一步用流式细胞仪检测p53蛋白表达率和细胞周期变化;双层软琼脂培养实验检测细胞的增殖潜能改变。以pBabe空载体同时实验,作为各阶段的对照。结果:成功地构建了重组逆转录病毒载体pBabe/p53;获得逆转录病毒生产PA317/p53细胞系,最高病毒滴度为4.64×105CFU/m l;获稳定表达p53基因的K562/p53靶细胞,免疫组化结果证实该细胞内有野生型P53蛋白表达,流式细胞仪检测到野生型P53蛋白表达率为1.32%;与对照K562/pBabe细胞比较,K562/p53靶细胞的生长速度下降;软琼脂集落生成的下降率为27.14±4.49%(P<0.05);增殖指数下降,S期比例下降(P均<0.01)。结论:制备了携p53基因的高滴度逆转录病毒,建立携野生型p53基因的K562/p53细胞株,证实表达的野生型p53蛋白对该细胞有抑制作用。     

Bioactivities of culture supernatants from retroviral packaging cells carrying the mouse Fas ligand gene

CD95 ( Fas) ,type transmembrane protein ofTNF and TGF receptor family,is expressed on hu-man multi- organ and some tumor cells besides acti-vated mature T cells and lymphocytes transfected byHTLV- 1 ,HIV and EBV. Fas L is a typical type transmembrane protein,belonging to TNF family.Cells expressing Fas L are limited to activated T cells,cornea and testiculartissues.Fas L is a specific ligandfor Fas antigen.Cross- linking of Fas by Fas L in-duces Fas cellsto undergo apoptosis[1,2 …     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。     

白细胞介素12基因的体外抗结肠癌效应

目的　构建共表达P35、P4 0二个亚基的逆转录病毒载体 (Rv mIL12 )、建立PA317 mIL12包装细胞系并评估其IL12的生物学活性及经PA317 mIL12作用后淋巴细胞对结肠癌细胞 (C2 6 )的体外杀伤作用。方法　将经PCR扩增mIL12 p35、p4 0获取的 p35和 p4 0双亚基cDNA片段与经NotI及SalI酶切的逆转录病毒载体 (PL P35 P P4 0 SN)DNA在T4噬菌体DNA连接酶作用下进行粘端连接反应。然后将构建的 pGCXEXPN mIL12经电穿孔法转录单嗜性逆转录病毒包装细胞系 (PE5 0 1) ,再以其病毒上清加Polybrene感染PA317,筛选出病毒滴度最高的携有mIL12逆转录病毒载体的包装细胞系 :PA317 mIL12。采用脾淋巴细胞增殖法检测PA317 mIL12的生物学活性。另外 ,将PA317 mIL12、淋巴细胞以及人结肠癌细胞 (LOVO)按不同浓度比体外共同培养 ,采用MTT法检测经PA317 mIL12作用后的淋巴细胞对LOVO的杀伤率。结果　经筛选的携有mIL12逆转录病毒载体包装细胞系PA317 mIL12的上清mIL12浓度达 2 7ng/ ( 10 6cells·4 8h) ,其促脾淋巴细胞增殖的生物学活性也与mIL12标准品活性相近 ,经PA317 mIL12作用后的淋巴细胞体外杀伤试验结果则显示 :随着PA317 mIL12浓度的增高 ,其淋巴细胞对结肠癌细胞杀伤作用也逐渐增强 ,与对照组相比统计学有显著性差异 (P