实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌重组质粒标准的构建

[目的]构建蜡样芽胞杆菌16s-23s ITS重组质粒，为实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌提供质粒标准。[方法]选择蜡样芽胞杆菌16s-23s ITS特异基因作为目的靶序列，设计、合成引物和探针，采用普通PCR扩增特异靶序列，克隆到pGM—T载体后，转化感受态大肠埃希菌DH5α，经蓝白斑筛选，再分别用EcoRI酶切，普通PCR及测序3种方法证实目的片段已成功重组。建立荧光定量PCR检测蜡样芽胞杆菌的标准曲线。[结果]成功构建目的重组质粒，并以此为标准制作荧光定量PCR标准曲线，重组质粒标准具有较大的线性范围（10^2copies／ul～10^8 copies／ul）和灵敏度。[结论]该方法构建的16s-23s ITS基因重组质粒能满足实时荧光定量测定对参考标准的要求，为后续实时荧光PCR快速检测蜡样芽胞杆菌的推广应用提供了条件。     

TaqManTM实时荧光PCR快速检测沙门氏菌的初步研究

[目的]建立实时荧光TaqManTM检测沙门氏菌的快速检测方法,为食物中毒快速准确的定性检测及食品中沙门氏菌染菌的调查提供手段,也为建立实时荧光TaqManTM同时检测多种细菌性食物中毒目标菌奠定基础. [方法]通过分析沙门氏菌invA、hilA、fimA、hns、spy、hut基因和16S rDNA等目的基因,对比不同目的基因的优缺点,最终选择hut基因作为目的基因,在Genebank进行中查找多条hut基因序列,并利用DNAssist软件进行同源性分析,选取相对保守区段,用Beacon Designer软件自行设计引物和TaqManTM探针,并利用硅胶模型基因组DNA提取法制备基因组DNA,通过对TaqManTM实时荧光PCR缓冲液浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度和探针浓度等反应条件的优化,初步建立沙门氏菌的TaqManTM实时荧光PCR快速检测方法. [结果]选取的hut基因同源性达到99％以上,特异性好.通过对各实验条件的优化,得到沙门氏菌TaqManTM实时荧光PCR的最佳反应条件,初步建立TaqManTM实时荧光PCR检测沙门氏菌的快速检验方法,该方法能在1h内完成整个检测过程.[结论]TaqManTM实时荧光PCR检测不但灵敏度高、特异性好,而且检测周期短,能提高沙门氏菌的检出率和检测准确性,可望应用于沙门氏菌食品及食物中毒的快速定性检测.     

多重实时荧光PCR检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌

[目的]建立多重实时荧光PCR方法以检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌.[方法]通过设计引物和探针,优化反应条件,建立多重实时PCR,检测金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽胞杆菌16S rRNA保守区基因及其ces基因(编码致呕毒素cereulide).该多重实时荧光PCR方法检测23株金黄色葡萄球菌、4株蜡样芽胞杆菌菌株和6株乳杆菌,比较其与菌株鉴定结果及ces基因普通PCR检测结果.[结果]多重实时荧光PCR方法检测23株金黄色葡萄球菌、4株蜡样芽胞杆菌菌株和6株乳杆菌,与菌株鉴定结果的符合率为100%.蜡样芽胞杆菌的ces基因检测结果也与普通PCR结果相符.[结论]建立了同时检测金黄色葡萄球菌nuc、蜡样芽胞杆菌168保守区基因及ces基因多重实时PCR方法,可应用于金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌在种水平上的菌株鉴定、以及蜡样芽胞杆菌cereulide毒力菌株的鉴定.     

一株蜡样芽胞杆菌与疑似蜡样芽胞杆菌检验

目的讨论蜡样芽胞杆菌的检验方法。方法细菌培养鉴定法和实时荧光PCR技术。结果细菌培养鉴定法难以正确鉴定蜡样芽胞杆菌。结论细菌培养鉴定法和实时荧光PCR技术相结合,是细菌检验值得推广的做法。     

一起蜡样芽胞杆菌引起食物中毒的检测报告

20 0 0年 9月 2 0日 ,赤壁市蒲圻办事处数人因食用武汉市奶制品厂在赤壁市代销的塑料袋装鲜牛奶引起食物中毒。主要症状为恶心、呕吐。儿童 3例症状较轻 ,因食用时口感不好未食用。另 1例 6 0余岁男性患者症状较重 ,食用后不到 1小时即发生剧烈呕吐 ,无腹泻 ,送市人民医院治疗 ,诊断为急性胃肠炎。鲜牛奶经检验 ,活菌计数 1.8× 10 5个 / ml超过卫生标准。大肠菌群 43个 / 10 0 m l,通过分离培养 ,形态、培养特性、生化性状、生化分型、鉴别、动物试验证实是蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒。现将检测结果报告如下。1　材料与方法1.1　鲜牛奶来…     

一起蜡样芽胞杆菌食物中毒的病原学检测

[目的]查找引起食物中毒的病原菌及可疑食品,提出预防措施,防止类似事件发生。[方法]依照中华人民共和国国家标准《食品卫生微生物学检验》,无菌采样及检验。[结果]从不同来源的检样-剩余食品韭菜合子、饭店次日加工韭菜合子的原料生馅、末例患者粪便中均检出同型的蜡样芽胞杆菌,而且菌量很大。[结论]经查该次食物中毒的食品是个体饭店加工的韭菜合子,病原菌为生化10型的蜡样芽胞杆菌。夏季是食物中毒的高发季节,应加大卫生监督力度,搞好饭店的食品卫生工作,避免食物中毒的发生。     

一起蜡样芽胞杆菌食物中毒调查

<正> 蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒,国内外报导很多,以面类食物引起者较多,我市某校123人因食土豆粉条引起蜡样芽胞杆菌食物中毒,现将调查情况报告于下: 流行病学调查某校食堂于1992年5月14日午餐,以土豆90斤与粉条12斤做成炒菜。该批土豆、粉条该食堂已多次食用,平时加工较细致,清洗较认真,中毒当日因突然增加100多名外出实习返校的学生,临时增加30余斤土豆,来不及认真清洗,匆忙加工出售。中午售出三分之二,剩余部分,于铝盆中就地置于厨房至晚餐出售,存放时间长达6小时,当日气温20℃左右,厨房温度高达30℃左右,且厨房卫生条件较差。当晚9时起陆续出现头晕、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等病     

一起由蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒病原学检测

<正>2016年7月29日9时瑶海区疾控中心公卫科接合肥市第二人民医院(广德路院区)防保科报告:2016年7月28日18时07分,急诊科接诊了3例在家中就餐后出现疑似食源性疾病症状病人,疑似食品安全事故。我中心接到报告后立刻前往市二院(广德路院区)和事发地云河湾小区家中进行调查处置工作,并采集了病人的肛拭子、剩余食物。经实验室检测,结合流行病学调查,证实此事件为一     

凝结芽孢杆菌PCR快速检测方法研究

目的:建立一种特异、灵敏的凝结芽孢杆菌快速检测方法。方法:根据凝结芽孢杆菌寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因设计一对PCR引物,进行了引物的特异性和灵敏度试验。结果:PCR得到了较好的特异性扩增,其它干扰菌都无扩增,灵敏度达5×103cfu/ml。结论:该方法能够实现凝结芽孢杆菌的快速检测,具有灵敏度高、特异性好的特点。     

Real-time PCR测定食品中蜡样芽胞杆菌的数量

目的:采用Real-time PCR的定量方法对食品中所含蜡样芽胞杆菌的数量进行快速的检测。为食物中毒的快速检测提供有力依据。方法:采用蜡样芽胞杆菌的肠毒素基因(Genebank D17312)作为靶基因,建立PCR反应体系。用已定量的蜡样芽胞杆菌DNA提取液作为外部参照,建立标准曲线进行定量检测。准备模拟样品,把PCR定量方法和国家标准方法的结果进行比较。结果:该反应体系的灵敏度和特异性均能够达到要求。对国标法和PCR定量方法的结果采用T检验分析,t=0.38,v=33,P>0.05,其结果无显著性差异。结论:本实验所采用的Real-time PCR定量方法检测食品中的蜡样芽胞杆菌数量,比国标法操作简单,所需时间短,并有较好的灵敏度和特异性,可以运用到日常工作中。     

微生物菌剂中5种芽孢杆菌实时荧光PCR鉴定

目的:建立一种快速、准确鉴定环保微生物菌剂中常用5种芽孢杆菌的方法。方法:根据rpoB和gyrB基因序列分别设计扩增5种菌的特异性引物及Taqman探针,并进行反应条件优化。结果:5种芽孢杆菌均产生特异扩增信号,最低检出浓度为:枯草芽孢杆菌24 cfu/ml、地衣芽孢杆菌35 cfu/ml、巨大芽孢杆菌50 cfu/ml、短小芽孢杆菌41 cfu/ml、环状芽孢杆菌21 cfu/ml。结论:研究建立的实时荧光PCR鉴定方法具有良好的重复性和准确性,可用于微生物菌剂中5种常用芽孢杆菌的快速鉴定,具有很好的推广应用前景。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的：建立双重荧光定量RT—PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒，并应用于临床样本的检测。方法：在A型流感病毒M基因和B型流感病毒NP基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针，建立优化单一和双重荧光RT—PCR反应体系，评价所建双重RT—PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性，并应用于疑似流感含漱液标本检测。结果：该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性，检出限分别为0．1TCID50和0．01TCID50，可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸。构建的体系定量标准曲线相关系数分别为0．998和0．999，具有较好的稳定性。结论：本研究建立的双重荧光定量RT—PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒，灵敏度高，稳定性好，是一种快速检测流感病毒的新方法。     

实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析

目的 了解双重实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌的效果.方法 采集从业人员肛拭子样本,用双重实时荧光PCR法检测沙门菌和志贺菌,检出的疑似阳性样本按国标法进行培养鉴定.结果 采用双重实时荧光PCR反应体系共检测从业人员39 974人次,荧光PCR检测出沙门菌阳性41份,阳性率1.22‰,培养法检测出31份,阳性率为0.78‰,沙门菌荧光PCR检测法的灵敏度为100％,特异性为99.95％.荧光PCR检测出志贺菌10份,阳性率为0.25‰,培养法检测出3份,阳性率为0.08‰,志贺菌荧光PCR法的灵敏度为100％,特异性为99.98％.从样品处理到检测结果仅需要时间2h～ld.结论 双重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于从业人员体检的快速诊断和肠道传染病的初筛,为肠道传染病的分子流行病学调查提供新的检测手段.     

溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系的建立

目的:建立溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系。方法:根据溶藻弧菌胶原酶基因colH的保守序列设计一对引物和一条TaqMan探针,优化反应体系中的引物浓度和探针浓度,评价此反应体系的特异度,并确定其检测下限。结果:优化的反应体系中,引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L,检测下限为1.0×102拷贝/μl,较普通PCR提高了100倍。特异度为100%。结论:本研究所建立的检测体系能够灵敏和特异地检测溶藻弧菌,可以作为溶藻弧菌的快速检测方法。     

TaqMan荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立

目的：建立特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测霍乱弧菌。方法：根据GenBank上的霍乱毒素（cholera toxin，CT）基因序列，在其保守区域设计特异性引物与TaqMan探针，并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化，同时验证方法的特异性、敏感性和重复性。结果：本方法对霍乱弧菌的检测具有高度特异性，与副溶血性弧菌、沙门菌、志贺菌、变形杆菌、大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应；检测灵敏度达10cfu／ml；反应体系具有很高的稳定性；整个操作过程仅需2h。结论：本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速．适用于霍乱弧菌的日常监测和爆发疫情的应急诊断。     

应用多重PCR技术检测120株蜡样芽胞杆菌毒力基因

目的 应用多重PCR技术对蜡样芽孢杆菌毒力基因进行快速检测,为研究蜡样芽胞杆菌致病性提供有力依据。 方法 根据蜡样芽胞杆菌（B.cereus）的cer、hblA、hblC、nheA、nheB、cytK和bceT基因设计并合成引物,优化反应条件,应用多重PCR技术检测120株B.cereus毒力基因序列。结果 多重PCR检测结果非常理想,不同基因扩增条带清晰可辨,蜡样芽胞杆菌呕吐毒素基因cer携带率为96.66%（116/120),细胞毒素cytK基因携带率为42.37%(50/118),肠毒素bceT基因携带率为38.33%(46/120),非溶血性基因nheA携带率为78.33％(94/120),非溶血性基因nheB携带率为83.05％(98/118),溶血性基因hblA携带率为55.0%(66/120),溶血性hblC基因携带率为27.96%(33/118)。结论 多重PCR结果很好,7对引物所扩增出的DNA条带区分明显,电泳条带清晰,特异性强,敏感度高。本实验对120株蜡样芽胞杆菌7种毒力基因进行检测,为研究蜡样芽胞杆菌致病性提供有力依据。     

实时荧光定量PCR技术在疫情和食物中毒检测中的应用

实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术是一种日益成熟的生物体核酸检测技术,由于其具有快速、特异、敏感、定量、安全、操作简便等特点,在医学诊断、卫生防疫等领域中得到广泛的应用。目前,针对常见疫情和食物中毒中的病源微生物,已设计和开发了相应的特异性引物及探针,可以对这些微生物进行快速检测,从而提高了政府及相关部门应对和解决突发公共卫生事件的能力。     

登革1型病毒荧光定量PCR快速检测

目的建立登革1型病毒的快速特异的荧光定量PCR检测方法。方法设计登革1型病毒特异的引物和TaqMan探针,制作标准曲线,并检测其特异性、重复性、再现性和敏感性,采用荧光定量PCR和常规PCR对临床标本进行检测比较。结果成功构建了标准曲线,回归方程为Y=-3.410logX+45.10,相关系数R²=0.999,扩增效率Eff=96.5%,灵敏度可达10³ copies/mL,此荧光定量PCR方法对登革1型病毒检测高度特异,与其他3型登革病毒和乙型脑炎病毒之间并无交叉反应;采用登革病毒种特异引物探针和本研究建立的登革1型病毒型特异引物探针对166份cDNA样本进行荧光定量PCR检测,均发现126份为阳性,阳性率均为75.9%,Ct值为20.84～36.36,浓度范围为1～1.3×104copy/μL;常规PCR方法检测到其中36份为阳性,阳性率为21.7%。结论荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测登革1型病毒,并能实现对病毒滴度的绝对定量。