HSP70-Id复合物修饰的树突状细胞体外诱导特异性抗肿瘤作用

目的观察人慢性B淋巴细胞性白血病（B-CLL）细胞的独特型抗原Id-ScFv与热休克蛋白70（HSP70）形成复合物修饰的树突状细胞（DC）体外诱导特异性抗肿瘤作用,并初步探讨其机制。方法将HSP70与Id-ScFv体外结合形成复合物HSP70-Id,修饰自人外周血单核细胞获取的DC。倒置相差显微镜观察DC的形态特征;流式细胞仪检测修饰前后DC的表型变化,酶联免疫吸咐试验（ELISA）检测DC分泌的白细胞介素12（IL-12）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测修饰的DC对自身淋巴细胞的激活和增殖作用,流式细胞仪检测激活的自身淋巴细胞T细胞亚群的变化,台盼蓝染色法检测其对Daudi、K562和HepG2等细胞的杀伤作用。结果DC体外诱导培养成功,HSP70-Id复合物可使DC成熟,镜下可见典型的DC形态,其CD1a表达率为20％-30％,CD83表达率〉72％,CD86和HLA-DR表达显著增加（P〈0．05）,上清中IL-12、TNF-α亦显著高于DC对照组（P〈0．01）。HSP70-Id复合物修饰的DC激活自身淋巴细胞,对Daudi细胞的杀伤率为71．24％,而对K562细胞杀伤作用较弱,对HepG2细胞无明显作用。其淋巴细胞亚群中,CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞的比例均显著增加,分别为56．51％和70．21％,CD4^＋T细胞／CD8^＋T细胞比值由空白对照组的1．49倒置为0．81。结论HSP70-Id复合物修饰的DC生物学活性增强,经其刺激后,传代培养的淋巴细胞可产生高效而特异性的抗肿瘤免疫效应,可能是CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞及DC协同作用的结果。     

人T淋巴细胞白血病不同细胞株的混合抗原肽诱导特异性CTLs细胞毒效应及其交叉反应性分析

目的探讨T淋巴细胞白血病不同细胞株的混合抗原肽诱导特异性抗瘤免疫的作用及不同细胞株混合抗原肽之间的交叉反应性。方法从不同白血病细胞株中分别制备混合抗原肽,与Hsp70体外结合,观察Hsp70-抗原肽复合物对人外周血单个核细胞(PBMC)的激活增殖作用;以激活增殖的PBMC为效应细胞,对不同的靶细胞进行体外杀伤试验。结果不同白血病细胞株的抗原肽为混合肽,经Hsp70提呈均能够有效激活PBMC,并能使激活的PBMC增殖,增殖活化的PBMC可以特异性杀伤与抗原肽对应的白血病细胞;Hut78-肽和Molt-4-肽激活的PBMC对Hut78细胞、Molt-4细胞和Jurkat细胞的细胞毒作用均显著高于HL-60-肽激活的PBMC(P<0.05)。而Hut78/Molt-4-肽激活的PBMC对Jurkat细胞的杀伤作用则显著高于Hut78-肽和Molt-4-肽单独激活的PBMC(P<0.05)。结论不同T淋巴细胞白血病细胞株来源的混合抗原肽均能够诱导特异性抗肿瘤免疫,其所含的抗原肽之间存在交叉性,通过多株来源的抗原肽混合,这种交叉性可以被放大。     

Id2通过非HLH结构域促进SKOV3细胞的侵袭性

目的：观察分化抑制因子2（inhibitor of differentiation2，Id2）基因转染卵巢癌SKOV3细胞后，对细胞生长和侵袭能力的影响，探讨№基因缺失螺旋-环-螺旋（helix—loop—helix，HLH）结构域后对SKOV3细胞的影响。方法：以携带野生型，d2、Id2-DBM和Id2-DBM-δHLH基因的质粒（peDNA3．1-Id2、peDNA3．1-Id2-DBM和pcDNA3．1-Id2-DBM-8HLH）经脂质体介导转染SKOV3细胞。采用Western印迹法和RT—PCR法检测转染后SKOV3细胞Id2、Id2-DBM和Id2-DBM-8HLH的表达水平；MTT法检测SKOV3细胞的增殖曲线；划痕试验和Transwell小室检测细胞的迁移能力；Western印迹法检测Id2对MCF-7细胞上皮钙黏附素表达的影响。结果：mRNA及蛋白水平显示质粒成功转入；细胞生长曲线显示各组细胞的增殖无显著差异；与空白对照组相比，转染peDNA3．1-Id2、pcDNA3．1-Id2-DBM和peDNA3．1-Id2-DBM-δHLH后，细胞的侵袭能力增强，且peDNA3．1-Id2-DBM和peDNA3．1-Id2-DBM-δHLH组细胞明显伴有上皮钙黏附素表达水平的降低。结论：Id2蛋白的过表达可促进卵巢癌SKOV3细胞的侵袭能力，与上皮钙黏附素表达水平的降低有关，且该作用在缺失HLH结构域后依然存在。     

激发型CD40单克隆抗体联合特异性细胞毒T淋巴细胞对B细胞淋巴瘤的免疫治疗作用

目的研究激发型CD40单克隆抗体5C11联合特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对B细胞淋巴瘤的免疫治疗作用,方法人B细胞淋巴瘤Daudi细胞株经5C11刺激24或48 h,Annexin V/PI结合实验测定凋亡率,流式细胞术检测Fas表达率外周血单个核细胞来源的树突状细胞(DC),经凋亡Daudi细胞负载、5C11诱导成熟后,与自体T细胞混合培养,激发特异性CTL,JAM法检测5C11、CTL或5C11联合CTL对Daudi细胞的杀伤效应。皮下注射Daudi细胞,建立人源化SCID小鼠B细胞淋巴瘤模型;接种肿瘤细胞1周、3周后,分别经腹腔注射5C11、CTL、5C11 CTL进行治疗,通过肿瘤生长曲线、荷瘤小鼠生存期评价疗效。结果5C11作用后,Daudi细胞表面Fas的表达率显著上调,但细胞凋亡率没有明显改变。特异性CTL能有效杀伤靶细胞,且与5C11联合应用后,Daudi细胞DNA片段形成率显著增高,8 h为71.9%±4.0%,12 h达82.6%±4.4%经5C11、CTL、5C11联合CTL治疗后,荷瘤小鼠体内肿瘤生长速度均显著减缓,而且在低肿瘤负荷小鼠中,CTL、5C11联合CTL治疗分别取得了30.0%和70.0%的完全缓解率,与对照组相比,各治疗组小鼠生存期显著延长。结论激发型CD40单抗5C11可显著上调细胞表面Fas的表达,增强Daudi细胞对诱导凋亡的敏感性,从而促进肿瘤特异性CTL的体外杀伤和体内治疗效应。     

Id2通过非HLH结构域促进MCF-7细胞的侵袭性

目的：观察Id2基因转染乳腺癌细胞MCF-7后对细胞生长、侵袭能力的变化，探讨Id2基因缺失HLH结构域后对细胞的影响。方法：以携带Id2-DBM和Id2-DBM-8HLH基因的质粒（pCDNA3．1-Id2-DBM和pCDNA3．1-Id2-DBM-8HLH）经脂质体介导转染MCF-7细胞。RT—PCR法检测转染后Id2、Id2-DBM和Id2-DBM-6HLHmRNA表达水平；MTT法检测MCF-7细胞增殖曲线；划痕实验、transwell小室检测细胞的迁移能力；Western Blot分析Id2对MCF-7细胞E—cad表达的影响。结果：mRNA水平显示质粒均成功转入；细胞生长曲线显示增殖无显著差异；与空载组比较，转染pCDNA3．1-Id2-DBM和pCD．NA3．1-Id2-DBM-8HLH后侵袭能力增强，且E—cad表达降低。结论：Id2蛋白的过表达可以促进乳腺癌细胞MCF-7的侵袭能力，与E—cad的降低有关，且该作用在缺失HLH结构域后仍然存在。     

5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635对肝癌细胞的抑制作用

目的:研究5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635在体外对肝癌HepG2和SMMC-7721细胞的特异性杀伤作用。方法:将SG600载体中5型腺病毒(Ad5)纤毛蛋白的knob和shaft结构域替换为35型腺病毒(Ad35)纤毛蛋白的相应结构域,构建成5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635。流式细胞术检测5/35嵌合型腺病毒Ad5/35-EGFP对HepG2和SMMC-7721细胞的感染效率,体外病毒增殖实验观察溶瘤腺病毒SG635的增殖能力,Western blotting检测SG635感染后肝癌细胞中E1A蛋白的表达,CCK-8实验检测SG635对肝癌HepG2和SMMC-7721细胞的杀伤作用。结果:在肝癌HepG2和SMMC-7721细胞中,Ad5/35-EGFP的感染效率明显强于5型腺病毒Ad5-EGFP;5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635在HepG2和SMMC-7721细胞中72 h的增殖倍数高于5型溶瘤腺病毒SG600(15 848.93vs6 309.57,6 309.57vs5 011.87,均P<0.01),而在人正常成纤维细胞BJ中几乎不增殖。SG635感染后,HepG2和SMMC-7721细胞中E1A蛋白表达高于SG600感染,在BJ中则无E1A表达。在一定MOI范围内,SG635对于HepG2细胞和SMMC-7721细胞的杀伤作用逐渐增强,且杀伤率明显强于SG600(MOI为1时,90%vs60%;MOI为10时,90%vs50%),对BJ无杀伤作用。结论:5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635能够高效感染并特异性杀伤肝癌细胞,具有较好的靶向性和安全性。     

Id2 通过非 HLH 结构域促进 MCF-7 细胞的侵袭性

目的：观察Id2基因转染乳腺癌细胞MCF-7后对细胞生长、侵袭能力的变化，探讨Id2基因缺失HLH结构域后对细胞的影响。方法：以携带Id2-DBM和Id2-DBM-8HLH基因的质粒（pCDNA3．1-Id2-DBM和pCDNA3．1-Id2-DBM-8HLH）经脂质体介导转染MCF-7细胞。RT—PCR法检测转染后Id2、Id2-DBM和Id2-DBM-6HLHmRNA表达水平；MTT法检测MCF-7细胞增殖曲线；划痕实验、transwell小室检测细胞的迁移能力；Western Blot分析Id2对MCF-7细胞E—cad表达的影响。结果：mRNA水平显示质粒均成功转入；细胞生长曲线显示增殖无显著差异；与空载组比较，转染pCDNA3．1-Id2-DBM和pCD．NA3．1-Id2-DBM-8HLH后侵袭能力增强，且E—cad表达降低。结论：Id2蛋白的过表达可以促进乳腺癌细胞MCF-7的侵袭能力，与E—cad的降低有关，且该作用在缺失HLH结构域后仍然存在。     

Id1 和Id3 协同诱导结肠癌SW620 细胞EMT并影响其侵袭与迁移

目的：探讨分化抑制因子1 基因（inhibitor of differentiation-1, Id1）和Id3 是否协同促进结肠癌SW620 细胞EMT和细胞的侵袭迁移能力及其可能的机制。方法：利用慢病毒载体构建Idl 和Id3 单或双基因敲减的结肠癌SW620 细胞,实验分为4组：SW620-Sh-Id1 组（转染shRNA-Id1）、SW620-Sh-Id3 组（转染shRNA-Id3）、SW620-Sh-Id1-Id3 组（共转染shRNA-Id1 和shRNAId3）、SW620-NC组（转染阴性空载慢病毒）。用qPCR 法和Western blotting 法分别检测敲减效果,显微镜下观察稳定下调Idl 和Id3 后SW620 细胞形态的变化,划痕愈合实验和Transwell 小室法检测SW620 细胞迁移和侵袭的变化,Western blotting 检测EMT标志分子及迁移、侵袭相关蛋白的表达。结果：成功构建了Idl 和Id3 单基因敲减与双基因敲减的结肠癌SW620 细胞株。（1）Idl和Id3 的敲除诱导SW620 细胞形态由上皮样向间质样转变;（2）与对照组相比,SW620-Sh-Id1 组和SW620-Sh-Id3 组SW620 细胞侵袭和迁移的能力显著下降(均P<0.05);SW620-Sh-Id1-Id3 组细胞侵袭和迁移的能力较SW620-Sh-Id1 组和SW620-Sh-Id3 组也明显下降(均P<0.05);（3）与对照组相比,SW620-Sh-Id1 组和SW620-Sh-Id3 组β-catenin、snail1 及MMP2 蛋白表达降低,上皮黏蛋白及TIMP2 蛋白表达增高(均P<0.05);SW620-Sh-Id1-Id3 组与SW620-Sh-Id1 组和SW620-Sh-Id3 组相比,β-catenin、snail1 及MMP2蛋白表达也下降,同时上皮钙黏蛋白及TIMP2 蛋白表达也增高(均P<0.05)。结论：Id1 和Id3 可能通过诱导EMT协同影响结肠癌SW620 细胞侵袭与迁移的能力。     

干扰素抗肿瘤实验及临床治疗观察

目的：分析梯度浓度的干扰素(IFN—α)对Burkitt淋巴瘤细胞株Daudi和T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat及15例难治性淋巴瘤患者的直接作用。方法：以MTT法测定梯度浓度的IFN—α对两种淋巴瘤细胞株Daudi、Jurkat增殖杀伤作用，以DNA末端标记法，流式细胞术，电镜观察测定IFN—α对淋巴瘤细胞的凋亡诱导作用，并采用瘤内注射IFN—α联合化疗治疗15例耐药的难治性淋巴瘤。结果：低浓度IFN—α对Daudi、Jurkat细胞无明显杀伤作用，高浓度IFN(10000U／m1)可显著杀伤两种肿瘤细胞，且有时间相关性，高浓度的IFN—α可诱导淋巴瘤细胞凋亡。15例患者CR2例，PR10例，有效率80％，无明显不良反应。结论：IFN—α可直接杀伤淋巴瘤细胞，诱导凋亡，有显著时间、剂量依赖性。局部应用IFN—α是治疗难治性淋巴瘤的有效方法之一。     

CPP-Id对小鼠树突细胞表面共刺激分子表达的影响

背景与目的:B细胞淋巴瘤的独特型(idiotype,Id)免疫球蛋白可作为肿瘤特异性抗原诱发免疫反应抑制肿瘤的发展。本实验拟探讨小鼠淋巴瘤细胞株A20中Id-CTL表位的存在,了解细胞穿透肽(cell-penetratingpeptide,CPP)负载的Id(CPP-Id)进入树突细胞(dendriticcell,DC)的量,以及在细胞内的分布和进入细胞的时相,同时检测其对DC表面标志表达的影响。方法:用RT-PCR方法扩增A20细胞株的Id抗原CTL(cytotoxicitylymphocyte)表位的基因片段,并测序确定氨基酸的序列;通过流式细胞仪检测CPP-Id与Id进入小鼠DC的量的差异及抗原负载前后的DC表型的表达;共聚焦显微镜观察CPP-Id进入细胞的过程及时间;荧光显微镜观察CPP-Id在细胞内的分布。结果:RT-PCR扩增产物为660bp的片段,测序结果表明A20细胞株的Id抗原CTL表位的基因存在。共聚焦显微镜检测显示CPP-Id能在最初200s内快速进入DC,单纯Id进入DC的量很少。10μmol/L的CPP-Id负载的DC细胞平均荧光强度(MFI)高于单独使用Id组(4.35±0.48vs.1.14±0.33,P<0.005);两者负载的DC表面标记CD80、CD86、CD54及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子表达均比未成熟DC明显增加。结论:CPP-Id比Id进入小鼠DC的量明显增加,CPP肽可以提高Id抗原进入细胞的效率;CPP-Id体外冲击DC后,可以使DC表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子,协同刺激分子CD80、CD86以及粘附分子CD54表达显著增高,有利于活化CTL。     

HeLa细胞HSP-70多肽体外诱导免疫活性细胞及其抗瘤机理

[目的]探讨用HeLa细胞HSP 70多肽诱导免疫活性细胞 (immunecompetentcells ,ICC)的特异性抗肿瘤机制。[方法]用热休克处理的HeLa细胞提取的HSP 70多肽剌激正常人外周血单个核细胞 ,在剌激扩增前后测定T淋巴细胞表型 ,并测定扩增的免疫活性细胞对HeLa细胞的杀瘤活性。[结果]在扩增的细胞中CD3+、CD8+淋巴细胞百分率明显增高 (P<0.01)。该免疫活性细胞对Hela细胞和来源于病人的宫颈癌细胞都具有较高的杀伤活性 ,而对经HSP 70单抗封闭后的HeLa细胞的杀伤率则明显下降。[结论]HeLa细胞HSP 70多肽能有效刺激PBMCs诱导活化免疫活性细胞 ,该免疫活性细胞具有特异性抗肿瘤作用     

Expression of heat shock protein (Hsp) 70 and Hsp 40 in colorectal cancer

Heat shock protein (Hsp) 70 and Hsp 40 are stress proteins that cooperate as chaperones in mammalian cells. The present study was designed to determine the expression levels of Hsp 70 and Hsp 40 in colorectal cancer by immunohistochemistry and Western blot analysis. Among 50 colorectal cancer tissues studied, 80% and 14% of tumors showed specific immunoreactivity to Hsp 70 and Hsp 40, respectively. Hsp 70 and Hsp 40 were overexpressed in cancer tissue samples compared with normal tissues, on both analytic sets. However, there were no significant correlations between their expression and various clinicopathological parameters of colorectal cancer. Hsp 70 and Hsp 40 may be tumor markers for colorectal cancer.     

热休克诱导人肝癌HepG2细胞HSP70和P-gp的表达及槲皮素对二者的抑制作用

背景与目的:研究提示热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)可抑制细胞凋亡,降低肿瘤热疗、化疗的疗效,但其与细胞化疗耐受性的内在关系尚不甚明确;P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一种耐药蛋白,在肿瘤耐药中起重要作用。本研究拟通过热休克诱导人肝癌HepG2细胞表达HSP70和P-gp,并观察槲皮素(quercetin,Qu)对二者表达的抑制效应。方法:恒温水浴法,42℃热休克HepG2细胞90min,分别采用免疫组化、流式细胞术检测热休克前及热休克后2h、4h、8h、12h、24h时HSP70和P-gp的表达情况;并于热休克前1h应用不同浓度槲皮素作用于HepG2细胞,观察其热休克后4h二者的表达。结果:(1)热休克诱导后,免疫组化显示细胞内HSP70表达增多,“核内迁移”;流式细胞术示HSP70阳性细胞数升高,4h达到最高(11.47%),较对照组(6.64%)升高近一倍(P<0.01),24h后回落到低值;P-gp阳性细胞数随HSP70升高后升高,12h达到最高值(96.31%),较对照组(33.95%)升高近两倍(P<0.01),24h后回落到低值。(2)热休克前应用槲皮素能有效抑制热休克诱导HSP70和P-gp的过量表达,以100～200μmol/L槲皮素作用明显(P<0.01),呈浓度依赖性。结论:热休克可诱导HepG2细胞HSP70和P-gp的过量表达,P-gp的表达可能与HSP70的表达有关;槲皮素可阻断热休克诱导HepG2细胞HSP7     

Detection of irradiation-induced, membrane heat shock protein 70 (Hsp70) in mouse tumors using Hsp70 Fab fragment

Background and purpose

The major stress-inducible heat shock protein 70 (Hsp70) is frequently overexpressed in highly aggressive tumors, and elevated intracellular Hsp70 levels mediate protection against apoptosis. Following therapeutic intervention, such as ionizing irradiation, translocation of cytosolic Hsp70 to the plasma membrane is selectively increased in tumor cells and therefore, membrane Hsp70 might serve as a therapy-inducible, tumor-specific target structure.

Materials and methods

Based on the IgG1 mouse monoclonal antibody (mAb) cmHsp70.1, we produced the Hsp70-specific recombinant Fab fragment (Hsp70 Fab), as an imaging tool for the detection of membrane Hsp70 positive tumor cells in vitro and in vivo.

Results

The binding characteristics of Hsp70 Fab towards mouse colon (CT26) and pancreatic (1048) carcinoma cells at 4 °C were comparable to that of cmHsp70.1 mAb, as determined by flow cytometry. Following a temperature shift to 37 °C, Hsp70 Fab rapidly translocates into subcellular vesicles of mouse tumor cells. Furthermore, in tumor-bearing mice Cy5.5-conjugated Hsp70 Fab, but not unrelated IN-1 control Fab fragment (IN-1 ctrl Fab), gradually accumulates in CT26 tumors between 12 and 55 h after i.v. injection.

Conclusions

In summary, the Hsp70 Fab provides an innovative, low immunogenic tool for imaging of membrane Hsp70 positive tumors, in vivo.     

不同应激对HeLa细胞增殖、凋亡及热休克蛋白70表达的影响

背景与目的:研究热应激、地塞米松(Dexamethasone,Dex)、吐温80(Tween_80)、氨茶碱、乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetra_aceticacid,EDTA)、Ca2 和双氧水应激对HeLa细胞增殖、凋亡及热休克蛋白70(Heatshockprotein70,HSP70)表达的效应。材料与方法:应用噻唑蓝法[3_(4,5_dimethylthiazol_2_yl)_2,5_diphenyltetrazolium,MTT]测定细胞增殖;将收集的HeLa细胞制备成玻片和硝酸纤维素膜(Nitrocellulosemembrane,NCM)两种标本,应用免疫细胞化学、斑点印迹技术检测HSP70;提取细胞DNA,应用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果:HeLa细胞经不同应激处理后,细胞增殖均受到抑制;除EDTA处理组未出现凋亡外,其余组均见DNA降解,形成梯形条带;各处理组HSP70表达较对照组有所提高,其中双氧水、热处理和氨茶碱处理组与对照组相比差异有统计学意义,Dex和Tween_80处理组与对照组相比差异有统计学意义,EDTA和Ca2 处理组HSP70表达有升高趋势,但差异无统计学意义。结论:不同应激可提高HeLa细胞的HSP70表达,并引起细胞不同程度的凋亡。     

miR-223及Hsp 70在人乳腺浸润性导管癌及癌旁组织中的表达研究

目的:探讨miR-223及Hsp 70在乳腺浸润性导管癌患者肿瘤组织和癌旁组织中的表达差异。方法:使用Real-time PCR 检测肿瘤组织和癌旁组织miR-223的表达水平,并对乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤组织及癌旁组织切片,并且对组织中Hsp 70进行免疫组化染色后,进行观察和分析。结果:肿瘤组织中的miR-223表达水平显著高于对照癌旁组织(P＜0.01)。而Hsp 70在大部分的浸润性导管癌的癌细胞及组织中表达显著高于癌旁的增生性导管及正常导管上皮。结论:miR-223与Hsp 70表达存在一定的正相关性,并为设计乳腺癌新的靶向治疗策略提供了新的可能。     

体外构建的HTA-HSP70BCG冲激的树突状细胞疫苗的抗肿瘤作用

 目的 观察体外构建的榄香烯复合瘤苗抗原-卡介苗热休克蛋白70复合物（H_TA—HSP70_BCG）诱导的树突状细胞疫苗的抗肿瘤效应。方法 来源于小鼠的肝癌Hca-F榄香烯复合疫苗的抗原（HTA）与卡介苗来源的HSPT0（HSP70_BCG）在体外构建成HTA—HSP70_BCG复合物，用GM-CSF和IL-4诱导树突状细胞（DCs），分别用HTA—HSP70_BCG、HTA和HSP70麟对其冲激。用舯法检测该DCs刺激的全脾细胞的增殖活性及被刺激的脾细胞的细胞毒活性。用流式细胞仪检测DCs表面（瑚6和CD40的表达。结果 体外构建HTA—HSP70_BCG可以诱导DCs成熟，表现为DCs表达CD86和CD40上调，该DCs可以刺激全脾细胞增殖并使其产生特异性杀瘤活性，其强度明显大于HTA。结论 体外构建HTA—HSP70麟复合物可以诱导DCs成熟，该DCs可以激活脾细胞产生较强的特异性抗瘤效应。     

RNA interference-mediated silencing of the Hsp70 gene inhibits human gastric cancer cell growth and induces apoptosis in vitro and in vivo

AIMS AND BACKGROUND: The role of heat shock protein (HSP) 70 in gastric cancer has been extensively examined in many studies for the past decade. It has been demonstrated that over-expression of Hsp70 might play important role in malignant transformation and maintenance of malignant phenotypes. Therefore, silencing the Hsp70 gene could be applicable in molecular therapies of human gastric cancer. Herein, we designed a small interfering RNA targeting Hsp70 to knock down its expression and investigated its effect on cell proliferation and apoptosis in a gastric cancer cell line. METHODS: Two plasmids (phsp1-siRNA, phsp2-siRNA), along with a negative control (phsp3-siRNA), were created using a genic recombination technique. BGC823 cell lines were used to perform experiments. Western blotting and RT-PCR were used to detect Hsp70 expression in vitro and in vivo. Cell morphology was observed under light microscope. Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry and acridine orange/ethidium bromide double stain, and cell proliferative activity was measured by alamarblue assay. In all experiments, a negative control served as a baseline measure. RESULTS: We successfully constructed phsps-siRNA plasmids and transfected them into BGC823 cells. RT-PCR and western blotting revealed that the expression of Hsp70 was down-regulated in transfection groups compared with the control group. Flow cytometric analysis indicated that less S-phase fraction accumulated in small interfering RNA transfected cells than in parental cells and the cells transfected with empty vector. CONCLUSIONS: Our results demonstrated that RNAi against Hsp70 could effectively knock down gene expression, inhibit growth of cancer cells, induce cell cycle arrest and increase cell apoptosis in vitro and in vivo. Hsp70 might serve as a therapeutic target for human gastric cancer.     

INDUCEMENT OF ANTITUMOR－IMMUNITY BY DC ACTIVATED BY HSP70－H22 TUMOR ANTIGEN PEPTIDE

Antigen peptides from tumor cells, bound with heat shock protein 70 (Hsp70), can induce specific antitumor immunity in vivo[1]. On the surface of dentritic cells (DC), the most powerful antigen-presenting cells in vivo, there is CD91[2] which is high-affinity receptor of Hsp70. Hsp70 from tumor cells can induce the maturation of DC[3]. After capturing tumor antigen, DC can be used as specific vaccine for immunotherapy of tumor[4]. Through DC-presenting pathway, limited amount of antig…