HIF-1α反义寡核苷酸对喉鳞状细胞癌hep-2细胞放疗的增效作用

目的：通过HIF-1α反义寡核苷酸转染hep-2细胞株,观察细胞凋亡及对放疗的反应情况。方法：体外培养人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株,脂质体介导反义寡核苷酸转染,6h后4Gy7射线照射。低氧培养24h后RT—PCR检测HIF-1α mRNA表达,流式细胞仪检测HIF-1α蛋白水平及细胞凋亡率,MTT检测细胞存活情况。结果：低氧使人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株对放射的敏感性下降;低氧并未影响HIF-1αmRNA的表达,HIF-1α蛋白在低氧6h时表达已开始升高,低氧36h时达高峰,之后表达逐渐下降;放射刺激对HIF-1α蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）;各浓度的反义寡核苷酸转染组降低HIF-1α的转录及蛋白水平;MTT结果显示随反义核苷酸浓度增高,其增殖抑制效应越强（P〈0．05）,正义对照核苷酸及脂质体对照没有显著的抑制效应（P〉0、05）,但转染浓度在400nmol／L以上时,正义对照也表现出一定的增殖抑制作用（P〈0．05）;放疗后反义寡核苷酸转染组蛋白表达下降明显,较对照组及单纯放射组细胞凋亡率增加（P〈0．01）。结论：低氧环境下人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株对放射有抵抗作用,这种抵抗作用与低氧时HIF-1α蛋白表达上调有关,而放射本身并未上调HF-1α蛋白的表达;HIF-1α反义寡核苷酸转染hep-2细胞株能够降低HIF-1α蛋白表达,提高低氧环境下人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株对放疗的敏感性。     

Survivin反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞放疗的增敏作用

目的探讨SUrvivin在放疗诱导喉癌细胞凋亡中的作用以及Survivin反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide,ASODN）技术对HeP-2细胞株增殖、凋亡及其放疗敏感性的影响。方法人工合成硫代SurvivinASODN,通过脂质体法转染人喉鳞状细胞癌Hep一2细胞株后,采用：①流式细胞法测定SurvivinASODN转染Hep一2细胞的转染率;②RT-PCR法检测基因转染后SurvivinmRNA的表达情况变化;③流式细胞仪检测射线照射后细胞凋亡率及Survivin蛋白的变化。结果①各浓度带FITC标记的SurvivinASODN转染细胞后6小时,取转染细胞制成的单细胞悬液,于流式细胞仪进行检查,发现转染效率均为94％～98％;②各浓度SurvivinASODN作用于Hep-2细胞24小时后,均出现SurvivinmRNA的表达下调,并呈剂量依赖关系,同时伴有细胞凋亡率的升高;③放疗~DSurvivinASODN转染组细胞凋亡率均显著高于单纯放疗组细胞凋亡率（P〈0．05）,随着SurvivinASODN剂量的增加,细胞凋亡率逐渐增加（P〈O．01）。放疗加ASODN转染组细胞Survivin蛋白表达率低于单纯放疗各组细胞Survivin蛋白表达率（P〈0．05）。各实验组与对照组中凋亡率的变化与Survivin蛋白荧光指数的变化呈负相关。结论喉癌细胞对放疗的抵抗作用与Survivin蛋白的表达水平有关,Survivin反义寡核苷酸转染Hep-2细胞株能够提高细胞对放疗的敏感性。     

放疗诱导的Hep-2细胞凋亡及X染色体连锁的凋亡抑制蛋白的表达变化

目的：观察放疗后Hep-2细胞的凋亡率和细胞内X染色体连锁的凋亡抑制蛋白（XIAP）的变化,并分析二者之间的关系。方法：体外培养Hep-2细胞,不同剂量、不同时间放疗后MTT法检测细胞生存抑制率;流式细胞仪检测XIAP荧光指数及细胞凋亡率,并分析二者的相关性。结果：体外培养Hep-2细胞,不同剂量照射后48h检测结果表明,随着照射剂量增加,细胞抑制与凋亡逐渐增加,二者呈正相关（r=0．99,P〈0．05）;XIAP荧光指数随照射剂量增加而增加;同一剂量（4Gy）照射后不同时间（12、24、48h）检测结果表明,随时间延长细胞凋亡逐渐增加。但24h结果与12h结果相比无明显差异,而48h结果与其他2组比较有明显差异,相应的XIAP荧光指数随照射后时间增加而增加,而且在24h内XIAP表达增加明显,细胞凋亡与XIAP呈显著负相关（r=0．915,P〈0．01）。结论：7射线可抑制喉癌Hep-2细胞的生长,射线引起细胞死亡的主要方式是凋亡,且有剂量与时间依赖性。XIAP表达增加可能是Hep-2细胞放射凋亡反应延迟的原因之一。     

Stat3反义寡脱氧核苷酸在体外诱导喉癌细胞凋亡

目的:探讨Stat3反义寡核苷酸对人喉癌Hep-2细胞株细胞凋亡的影响。方法:设计Stat3反义寡核苷酸序列,应用脂质体瞬时转染法转染人喉癌Hep-2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测Stat3及p-Stat3的表达;MTT实验检测Stat3反义寡核苷酸对转染细胞的抑制情况,应用DNA ladder、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)及流式细胞术检测细胞凋亡水平和形态变化。结果:Western blot和RT-PCR结果显示Stat3反义寡核苷酸分别在蛋白及mRNA水平显著抑制Stat3基因表达,并在蛋白水平抑制p-Stat3表达;转染Stat3反义寡核苷酸的喉癌细胞增殖明显受到抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);DNA ladder、AO/EB及流式细胞术证实Stat3反义寡核苷酸在体外可抑制Stat3基因表达并诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡,且呈现浓度依赖性。结论:Stat3对喉癌细胞的过度生长、增殖起一定作用,Stat3反义寡核苷酸能够诱导喉癌细胞凋亡,抑制其增殖。     

Re1A反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的:探讨Re1A反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法:设计Re1A反义寡核苷酸序列,转染Hep-2细胞后在不同的时间点行MTT检测瘤细胞生长抑制情况,取转染48 h的Hep-2细胞行克隆形成实验,应用RT-PCR和Western blot检测RelA mRNA和蛋白的表达.结果:MTT显示转染Re1A反义寡核苷酸可明显抑制Hep-2细胞的增殖,随时间延长抑制率升高,与对照组比较差异有统计学意义.克隆形成实验显示Re1A反义寡核苷酸的Hep-2细胞克隆形成率明显低于对照组,与对照组比较差异有统计学意义.RT-PCR和Western blot结果显示Re1A反义寡核苷酸分别在mRNA和蛋白水平显著抑制RelA基因表达.结论:Re1A反义寡核苷酸可抑制Re1A的mRNA和蛋白的表达,并抑制Hep-2细胞增殖和克隆形成.     

反义表皮生长因子受体纳米颗粒对小鼠头颈鳞状细胞癌放疗增敏的实验

目的应用反义表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）纳米颗粒,研究阻断EGFR表达,对小鼠头颈部鳞状细胞癌（简称头颈鳞癌）敏感性的作用。方法载反义EGFR寡核苷酸纳米颗粒转染SCC VII细胞株,通过Western—blot研究其蛋白抑制效应。放射治疗千预后,细胞克隆试验和MTT试验检测细胞的放射敏感性,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡情况：构建小鼠头颈癌荷瘤模型,瘤体注射反义EGFR纳米颗粒,予以4Gy放射治疗,观察肿瘤生长抑制情况。结果反义EGFR纳米颗粒明显抑制EGFR蛋白的表达情况：反义EGFR纳米颗粒与放疗联合降低了肿瘤细胞克隆形成能力及生长能力（P〈0．05）：肿瘤细胞发生G1期阻滞,细胞凋亡率增加（P〈0．05）。体内实验发现反义EGFR纳米颗粒组肿瘤生长明显延缓。结论反义EGFR纳米颗粒通过下调EGFR的表达,使SCC VII细胞发生G1期阻滞,具有放疗增敏效应。     

反义端粒酶催化亚单位抑制喉癌细胞生长的离体实验研究

目的：探讨人端粒酶催化亚单位（hTERT)反义寡核苷酸对人喉癌细胞株Hep-2的生长抑制作用。方法；用脂质体包裹hTERT反义寡核苷酸转染体外培养的Hep-2细胞，分别于转染后24、48、72h用MTT法检测细胞增殖活性，转染的72h行HE染色及端粒酶活性测定。结果：转染后细胞增殖活性降低；细胞生长密度下降；端粒酶活性受到抑制。结论：hTERT反义寡核苷酸短期内可以降低端粒酶活性、抑制喉癌细胞的生长。     

Stat3反义核苷酸通过调节凋亡相关因子诱导喉癌细胞凋亡

目的:探讨反义Stat3基因诱导喉癌细胞凋亡的机制。方法:将设计好的已证实能诱导人喉癌细胞凋亡的Stat3反义寡核苷酸序列,应用脂质体瞬时转染法转染人喉癌Hep-2细胞,应用Western blot、PCR检测Hep-2细胞中Bcl-2,Bax及C-Myc基因及蛋白的表达情况。结果:Western blot和RT-PCR结果显示转染Stat3反义寡核苷酸细胞组,Bax的表达随反义寡核苷酸浓度增加,表达增强,而Bcl-2及C-Myc的表达则减弱。结论:反义Stat3寡核苷酸通过上调Bax,下调Bcl-2及C-Myc基因表达来参与其诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡的过程。     

shRNA-hIAP2增强CNE-1鼻咽癌细胞对放射敏感性的实验研究

目的构建人凋亡抑制蛋白（ human inhibitor of apoptosis protein2, hlAP-2 ）的shRNA,靶向抑制hlAP-2基因联合放疗,探讨其对CNEl鼻咽癌细胞株放射敏感性的影响。方法首先采用MTT法确定最佳放射剂量;再构建4条hlAP-2．shRNA沉默片段并用脂质体法转染CNEl细胞,最后采用实时荧光定量PCR（Q—PCR）和免疫印迹法（Westernblot,WB）筛选出最佳沉默shRNA序列;用最佳沉默shRNA序列转染CNEl细胞,分别设置转染放射线照射组与未转染放射线照射组,采用实时定量PCR和WB检测hlAP．2的基因及其蛋白表达;流式细胞术测细胞凋亡,transwell测细胞侵袭能力。结果MTr法明确4Gv为最佳放射剂量;Q-PCR和WB检测结果显示4条hlAP-2-shRNA均能有效抑制hIAP-2mRNA及蛋白表达（P〈0．05）,以hIAP-2-shRNA2沉默效果最显著（P〈0．05）;Q—PCR和WB检测结果显示转染hlAP-2-shRNA2后照射组与未转染hlAP-2-shRNA2照射组的CNEl细胞中hlAP-2基因与蛋白表达比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）;流式细胞术检测结果显示转染hIAP-2-shRNA2后照射组比未转染hlAP-2-shRNA2照射组凋亡率差异具有统计学意义（P〈0．05）;transwell检测结果显示转染hIAP-2-shR-NA2后照射组与未转染hIAP-2-shRNA2照射组侵袭能力差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论转染hIAP-2基因沉默后放射可增加鼻咽癌细胞凋亡率,降低其侵袭能力,能够起到放疗增敏作用。     

Testin基因对鼻咽癌5-8F细胞放疗敏感性的研究

目的 探讨Testin(TES)基因对鼻咽癌5-8F细胞放疗敏感性的影响。方法 鼻咽癌5-8F细胞系(未转染组)、稳定转染空载体的5-8F细胞系(空载体组)、稳定转染TES的5-8F细胞系(TES组),经过0、2、4、6、8、10 Gy放射剂量照射后,进行细胞克隆形成实验,使用Linear-quadratic模型计算拟合剂量生存曲线,计算放射增敏比(SER)。MTT实验检测放疗后细胞增殖能力,流式检测细胞凋亡变化。结果 分别行放射剂量 2、4、6、8、10 Gy照射后,TES组与未转染组和空载体组间细胞增殖率比较,差异有统计学意义(F=24.157、47.429、78.641、45.215、16.751,P均<0.01)。TES组的生存曲线较空载体组和未转染组下移,克隆形成率明显下降,说明TES可提高鼻咽癌细胞的放疗敏感性。MTT实验结果显示,经过6 Gy剂量放疗照射后,与空载体组和未转染组比较,TES组细胞增殖下降,且于第3天下降明显,显著低于其他两组(F=15.743,P<0.01),说明过表达TES能够抑制放疗后鼻咽癌5-8F细胞株的增殖。流式实验结果：未转染组、空载...     

Inhibiting XIAP expression by RNAi to inhibit proliferation and enhance radiosensitivity in laryngeal cancer cell line

Objectives

X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) is a novel member of the inhibitors of apoptosis (IAPs) family. The overexpression of XIAP is asscociated with radioresistance of human malignancies. The purpose of the present study was to investigate the effect of shRNA-targeted XIAP on the proliferation, apoptosis and radiosensitivity of human laryngeal carcinoma cells (Hep-2).

Methods

A siRNA expression vector (pSilencer4.1-XIAPshRNA) was constructed and stably transfected into human laryngeal carcinoma cells (Hep-2). The downregulation of XIAP expression was evaluated by RT-PCR and Western blot analyses. Then, we investigated the effect of XIAP-shRNA on the proliferation, cell cycle changes and apoptosis in vitro of Hep-2 cells. Finally, the radiosensitivity of Hep-2 cells was investigated by clonogenic cell survival assay.

Results

We established stably transfected cell line (Hep-2/XIAPshRNA) in which the expression of XIAP gene was downregulated. The cell viability of Hep-2/XIAP-RNA cells was obviously decreased compared with that of untransfected Hep-2 cells. Morever, XIAP-shRNA induced cell arrest in the G₀/G₁ phase of cell cycle by flow cytometry analysis. Results of TUNEL assay indicated that Hep-2 cells stably transfected pSilencer4.1-XIAP-shRNA showed obvious apoptosis characters. Furthermore, the downregulation of XIAP expression could lead to significant radiosensitivity enhancement in laryngeal carcinoma cells.

Conclusions

RNAi-mediated downregulation of XIAP expression can inhibit proliferation, induce apoptosis and diminish the radioresistance of laryngeal carcinoma cells, so combined therapy with XIAP inhibition and radiation may be a potential strategy for the treatment of laryngeal carcinoma.     

金丝桃素联合放射线照射对喉癌细胞Hep-2的影响

目的：探讨金丝桃素（HY）联合放射线照射对喉癌细胞Hep-2的影响。方法：体外培养的喉癌细胞Hep-2分别给予0、1、2、3Mg／ml终浓度的HY,加药1h后,给予5Gy的放射线照射（HY加放射组）;另取喉癌细胞Hep-2分别给予5、10、20、25μg／ml终浓度的HY,不给予放射线照射（单纯HY组）;各实验组均设空白对照。继续培养48h后,应用显微镜、MTT法和流式细胞仪（FCM）分析HY加放射组和单纯HY组对喉癌细胞Hep-2的影响。结果：光镜下可见喉癌细胞生长密集,细胞呈梭型或多角型,细胞彼此之间相接触,放射后的喉癌细胞主要改变为部分细胞肿胀,HY和喉癌细胞共同经放射线作用后,在HY低剂量时即可见细胞数量明显减少,肿胀细胞比例明显增多,高剂量时可见细胞坏死。MTT结果显示放射后HY可显著抑制喉癌细胞的生长;FCM分析表明放射后HY可将喉癌细胞阻滞在G0／C1期,并诱导喉癌细胞凋亡。HY单独应用,对喉癌细胞的抑制作用相对较弱。结论：HY联合放射线照射可有效地抑制喉癌细胞的增殖,并可诱导喉癌细胞凋亡。     

X-连锁凋亡抑制蛋白在顺铂诱导的喉癌Hep-2细胞凋亡中的作用

目的 探讨X-连锁凋亡抑制蛋白(x-linked inhibitor of apoptpsis protein,XIAP)在顺铂诱导喉癌Hep-2细胞凋亡中的作用和机制.方法 体外培养的Hep-2细胞,选择不同浓度的顺铂以不同时间作用于培养的细胞.利用结晶紫法、RT-PCR、流式细胞分析技术研究不同时间、浓度下细胞凋亡的发生率和XIAP、mRNA的表达及两者的相互关系.结果 正常状态下,Hep-2细胞为贴壁细胞,凋亡率低.顺铂作用后细胞凋亡率和XIAP表达水平发生明显变化,表现为XIAP表达水平的下降伴Hep-2细胞凋亡率的升高.不同药物浓度及不同时间点间相比较,细胞抑制率、XIAP的表达及凋亡率差异均有显著性意义.RT-PCR终产物分析表明,随着加药浓度的增加及药物作用时间的延长,XIAP的mRNA水平逐渐降低.相关性分析显示细胞抑制率、凋亡率与药物浓度及药物的作用时间成正相关,而XIAP的表达与药物浓度及作用时间呈负相关,XIAP的表达与调亡率呈负相关.结论 顺铂引起细胞死亡的主要方式是细胞凋亡.XIAP及mRNA在喉癌Hep2细胞中的表达与顺铂的作用浓度及作用时间有双相依赖性.通过诱发XIAP表达水平的降低使细胞的凋亡率升高是顺铂杀伤肿瘤的作用机制之一.     

XIAP反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞化疗增敏作用的研究

目的 通过X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASODN)转染喉癌Hep-2细胞,探讨其对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响.方法 体外培养人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,应用脂质体法进行XIAP ASODN基因转染,荧光显微镜下观察计算转...     

RNA干扰Jabl基因对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖影响

目的 通过脂质体将人工合成的Jab1 siRNA Ⅱ包裹后导入人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞(简称Hep-2细胞)中,使Jab1基因的表达受到抑制,并通过不同的方法来观察Jab1 siRNA Ⅱ对Jab1基因的表达及细胞增殖影响.方法 MTT法检测Jab1 siRNA Ⅱ不同时间对Hep-2细胞增殖的影响,RT-PCR方...     

RNA干扰DJ-1基因抑制喉癌细胞的增殖

目的 探讨RNA干扰(RNAi)抑制喉癌Hep-2细胞DJ-1基因的表达及观察其细胞效应.方法 设计合成3对特异性针对人DJ-1基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染Hep-2细胞,实验分为4组:瞬时转染非特异性siRNA对照组及转染特异性siRNA 3组(siRNA1、siRNA2、siRNA3).采用RT-PCR检测DJ-1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测DJ-1蛋白,流式细胞仪检测细胞凋亡及四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测特异性siRNA1组对Hep-2细胞效应.结果 本实验设计合成的3对特异性siRNA均不同程度地抑制DJ-1基因表达,其中特异性siRNA1组抑制效果最佳.M1Tr比色法结果显示特异性siRNAl组(终浓度50 nmo~L、100 nmolZL)对Hep-2细胞增殖具有抑制作用.流式细胞仪检测结果最示特异性siRNA1组能诱导Hep-2细胞凋亡,转染特异性siRNA1组凋亡率为(15.7±4.8)%,非特异性siRNA对照组凋亡率为(4.5±0.4)%,非特异性siRNA对照组与特异性siRNA1组凋亡率比较差异有统计学意义(t=4.736,P<0.01).结论 转染特异性siRNA组能有效抑制Hep-2细胞增殖,诱导Hep-2细胞凋亡.