肠道病毒71 型通过下调IRF9 的蛋白水平抑制干扰素的抗病毒作用

目的:初步探讨肠道病毒71 型抑制干扰素(IFN)信号通路的具体机制,为以后EV71 的治疗提供理论基础。方法:采用EV71 感染人横纹肌肉瘤细胞(RD 细胞)模型,实验组分正常对照组(Control)、EV71 病毒对照组(EV71 组)、仅有IFN-β处理组(IFN-β组)、EV71+IFN-β处理组(EV71+IFN-β组)。采用Real-time PCR 法检测IFN 诱导基因(ISGs)的表达。细胞核蛋白和胞浆蛋白分离后应用免疫印迹法检测p-STAT1 在细胞中的分布。采用免疫印迹法检测STAT1、IRF9 的表达。结果:EV71+IFN-β组与IFN-β组相比,OAS1、MX1、ISG54 mRNA 表达水平明显降低,分别降低约47%、50%、48%,差异有统计学意义(P<0.05),提示EV71 感染抑制了IFN-β诱导的ISGs mRNA 的表达。EV71 感染并不影响STAT1 的蛋白水平和磷酸化过程。IFN-β组,p-STAT1 主要定位在胞核中,而EV71+IFN-β组的p-STAT1 主要定位在胞浆中,提示EV71 可能抑制了p-STAT1 的核转位。检测细胞总裂解液中IRF9 的蛋白水平,结果发现,在IFN-β处理的细胞中,IRF9 的表达明显上调;而与IFN-β组相比,EV71+IFN-β组IRF9 的蛋白水平明显降低,提示EV71 感染抑制了IFN-β诱导的IRF9 的表达。结论:EV71 通过降低IRF9 来抑制ISGF3 的核转位,进而阻断IFN 的抗病毒作用。     

肠道病毒71型诱导Bax依赖的细胞凋亡

目的研究肠道病毒71型（EV71）诱导细胞凋亡的分子机制。方法采用CCK8比色法检测EVT1感染对于人横纹肌肉瘤细胞RD增殖的影响,通过Hoechst33342染色和Caspase3活性测定检测细胞凋亡特征,用WesternBlot方法检测凋亡相关蛋白Caspase3和8的激活。同时通过免疫共沉淀检测EV71感染后细胞内Bax的活化。结果EV71感染RD细胞可以明显抑制细胞增殖,引起Caspase3、8和PARP蛋白的激活,同时引起Bax蛋白表达增加并发生构象变化。结论EV71通过Bax构象变化诱导Caspase依赖的细胞凋亡。     

肠道病毒71型实验室诊断研究进展

人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科,基因组为单股正链RNA,最早是于1969 -1970年间在美国加利福尼亚州发生中枢神经系统症状的婴儿粪便中分离得到[1],之后世界上许多国家相继报道了EV71感染的流行,HFMD与EV71感染的关系也受到了广泛的重视.EV71与柯萨奇病毒(coxsackievirus)引起的手足口病不同,其感染性强、致病率高,是目前除脊髓灰质炎病毒以外导致婴幼儿神经系统疾病感染最重要的病原体,感染后可导致手足口病、无菌性脑膜炎、肺炎、疱疹性咽峡炎等,以上症状在患者中所占的比例分别为83％、11.1％、0.6％和1.2％[2].     

Ⅰ型干扰素受体研究进展

Ⅰ型干扰素受体是细胞因子受体超家族的一类复合亚基受体。通过受体的特异性单克隆抗体的制备和不同受体亚基的克隆,已清楚了Ⅰ型干扰素受体的结构和功能。本文分析了这些最新进展和不同受体亚基在Ⅰ型干扰素信号传递中的作用。     

肠道病毒71型手足口病的疫苗筛选和观察

目的 筛选安全有效新型EV71候选疫苗,为将来EV71疫苗开发应用奠定基础.方法 以重组蛋白VP1为疫苗设计靶点,不同候选疫苗包括灭活疫苗、DNA疫苗、VP1蛋白疫苗在0、2周、4周分别按照不同剂量和肌内注射途径免疫BALB/c雌性小鼠,在0、2周、4周、6周、8周、10周、16周分别采集小鼠尾静脉血,16周处死小鼠,收集小鼠脾脏细胞,检测小鼠体液免疫和细胞免疫功能,筛选评价候选疫苗的疗效和安全性.结果 灭活病毒疫苗、VP1 DNA质粒疫苗、VP1蛋白疫苗免疫小鼠2周后IgG抗体滴度即开始升高,4周后明显升高,8周后达高峰,至少维持16周以上;IgG亚类以IgG2a和IgG1为主.三种疫苗能诱导以γ-IFN和IL-4为主的细胞免疫反应.灭活疫苗疗效优于其他候选疫苗,未发现疫苗相关不良反应.结论 灭活病毒疫苗、VP1 DNA质粒疫苗、VP1蛋白疫苗均能诱导持久的特异性细胞免疫和中和抗体反应,以灭活病毒疫苗疗效较好,需要将来攻毒实验可进一步验证其免疫力.     

Ⅰ型干扰素及其在抗病毒和抗细菌感染中的作用

1957年，Isaacs和Lindenmann发现在流感病毒感染的鸡细胞中，一种细胞分泌物质可调节鸡细胞的抗病毒状态，这种物质被命名为干扰素(IFN)。Ⅰ型干扰素是第一种被发现的细胞因子，因其干扰病毒的复制而得名。干扰素的发现立刻引起了全世界的广泛重视。干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型两大类，Ⅱ型干扰素只有IFN-γ；Ⅰ型干扰素则包含多个种类，其中，IFN-α是一个大家族，目前已发现十多种亚型，     

肠道病毒71型（EV71）AH3株感染性克隆的构建与鉴定

目的 构建肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71） AH3株的全基因序列感染性克隆.方法 通过分段扩增和酶切连接将EV71全基因组cDNA片段逐步克隆入PWSK29载体,构建含全病毒基因组序列的重组质粒.转染Vero细胞后,获得拯救病毒.经RT-PCR、酶切、测序、间接免疫荧光（IFA）等方法进行鉴定.结果 酶切鉴定结果与预期一致,序列分析显示为EV71基因;其转染Vero细胞后,可观察到典型的细胞病变;所获得的拯救子代病毒滴度（TCID50）为107.5;IFA检测可见感染细胞出现绿色荧光.结论 成功构建EV71全基因序列感染性克隆,为病毒致病机理及减毒疫苗的研究奠定基础.     

宁夏2009年肠道病毒71型基因特征分析

目的 分析2009年宁夏回族自治区手足口病（Hand-Foot-and-Mouth Disease,HFMD）患者中肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）分离株的基因特征.方法 2009年,从宁夏自治区344例HFMD病例中采集的385份标本,用人横纹肌肉瘤（Human Rhabdomyosarcoma,RD）细胞对标本进行肠道病毒分离培养;采用型特异性RT-PCR对阳性分离物中的EV71病毒进行鉴定;对鉴定的EV71毒株VP1编码区进行核苷酸序列测定分析.结果 共分离到肠道病毒126株,其中58株为EV71（46%）,对其中46株EV71的VP1编码区序列进行测定和分析.宁夏分离株与EV71的A和B基因型代表株核苷酸序列同源性分别为81.7%～82.8%和83.1%～85.2%,氨基酸序列同源性分别为93.9%～95.9%和96.2%～97.9%;与C基因型的C1、C2、C3、C4a、C4b和C5亚型代表株核苷酸序列同源性分别为88.3%～90.6%、88.3%～90.1%、87.8%～89.0%、94.2%～98.9%、91.8%～94.1%和86.7%～89.1%;氨基酸序列同源性分别为97.9%～99.6%、97.9%～99.3%、97.6%～98.9%、97.9%～100%、98.6%～99.6%和97.9%～98.9%.在系统发生树上,这46株毒株与C4基因型代表株聚为一簇,属于C4亚型中的C4a分支.结论 2009年EV71的C4a亚型在宁夏有较广泛的流行,是宁夏流行的绝对优势基因亚型,C4a也是我国2005年以来流行的优势基因亚型.     

人肠道病毒71型感染免疫抑制恒河猴的分析

目的: 通过建立人肠道病毒71型(EV71)感染在免疫抑制恒河猴的动物模型,进一步分析人EV71在免疫抑制动物体内病毒增殖、病理变化以及病毒抗原在不同组织的表达情况。方法: 按照每天15 mg/kg的剂量给8只恒河猴口服环孢菌素A连续7 d后造成其免疫抑制状态,再经呼吸道和消化道感染EV71病毒FY23株,对其进行14 d的临床观察后处死,采集各器官组织进行病毒载量检测,同时对不同的组织进行病理学分析和免疫组化分析。结果: 感染EV71病毒后,免疫抑制组的临床症状、病毒载量、病理分析和免疫组化结果都明显比非免疫抑制组严重,从病毒对机体造成的影响来看呼吸系统感染较消化系统感染明显严重。结论: 本实验分析了人EV71在免疫抑制动物体内病毒增殖的情况,为建立用于EV71疫苗评价的恒河猴动物模型提供了依据,并对未来的EV71疫苗的使用人群范围做出了新的限定。     

HMGB1促进外源DNA诱导细胞产生Ⅰ型干扰素

目的探讨HMGB1在外源DNA-poly(dA-dT)刺激细胞Ⅰ型干扰素IFN-β中的作用。方法荧光素酶分析方法检测经poly(dA-dT)刺激后细胞IFN-β的表达差异,同时PCR法检测了胞内重要DNA结合蛋白—高迁移率族蛋白-1(HMGB1)的表达改变;构建携带HMGB1特异性shRNA的慢病毒载体,获得HMGB1稳定下调(HMGB1KD)细胞,经poly(dA-dT)刺激后检测IFN-β表达,分析HMGB1在外源DNA刺激IFN-β产生中的作用。结果 poly(dA-dT)刺激293T细胞后,IFN-β表达显著上调,同时,HMGB1的表达在不同细胞中也明显上升,当下调HMGB1后,poly(dA-dT)刺激IFN-β产生的能力大幅削弱,表达水平降至对照组的1/8(P<0.05)。结论 HMGB1在促进外源DNA诱导Ⅰ型干扰素产生中发挥了关键作用。     

青海省分离到肠道病毒71型及其VP1区基因特征分析

目的 研究2008年青海省手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）的致病病原体中肠道病毒71型（Human Enterovirus 71,HEV71）的VP1区基因特征.方法 采集青海省HFMD患者的粪便、疱疹液和咽拭子标本共335份,并进行病毒分离,然后对阳性分离株病毒进行肠道病毒血清型别的分子定型.对分离到的HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增,核苷酸序列测定和同源进化分析.结果 在335份临床标本中,共分离到45株阳性病毒分离物,其中30株鉴定为HEV71（占66.7%）,是主要病原体.对30株HEV71进行VP1区核苷酸序列测定后,分析发现它们在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上有一定差异,同源性分别在95.2%～100.0%和96.6%～100%之间.它们与1998年以来在我国分离的HEV71在核苷酸和氨基酸水平上的同源性都较高.与其他35株各基因型和基因亚型的HEV71代表株构建的亲缘进化树中显示,青海省HEY71分离株与C4亚型代表株聚为一簇,属于C4基因亚型C4a进化分支.结论 青海省从HFMD病例中分离到HEV71,也确认了青海省HFMD的病原体HEV71流行株的基因型为C4基因型中的C4a进化分支,并且存在多个传播链.     

人类肠道病毒71型的研究进展

肠道病毒71型是引起手足口病的主要病原体之一,其感染还可导致多种与神经系统相关的疾病,致残率及病死率较高.近年来,EV71感染在全球范围呈现上升趋势,2008年我国也有较大规模流行.本文对EV71的病原学特征、流行病学特征以及相关最新研究进展等方面作一综述.     

肠道病毒71型重组VP1蛋白的表达和EV71型手足口病血清学诊断方法的建立

目的 获得纯化的具有免疫活性的肠道病毒71型VP1蛋白,建立EV71感染早期、快速和准确的ELISA血清学诊断方法.方法 通过PCR方法扩增出VP1基因,定向克隆到原核表达载体pET-21b(+),阳性质粒转化入E.coli B121(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹分析目的 蛋白的表达水平.纯化的VPI蛋白用作包被抗原,建立手足口病(HFMD)患者抗-EV71-IgM和IgG的血清学诊断方法.结果 成功表达和纯化了VP1重组蛋白,所表达的蛋白能被EV71型手足口病患者血清所识别.调查发现,与正常人和EV71阴性手足口病患儿比较,EV71阳性手足口病血清中抗-EV71-IgM和IgG中A值显著升高.差异具有统计学意义(P<0.05).与RT-PCR结果比较,发现该方法IgM的诊断敏感性和特异性分别为73%和77%;该IgG诊断方法的敏感性和特异性分别为82%和83%.完成该试验仪需4 h.结论 利用pET原核表达系统成功克隆、表达和纯化了肠道病毒71型重组外壳蛋白VPI,且具有良好的抗原性.该抗原可用于研制EV71血清学诊断试剂盒.     

深圳地区肠道病毒71型VP1基因变异趋势研究

目的 研究深圳地区肠道病毒71型VP1基因变异趋势.方法 用肠道病毒71型特异性引物进行RT-PCR,并对EV71的VP1进行扩增,所得的序列与肠道病毒71型A、B、C基因型代表株的核苷酸序列比较,用DNA Star、BioEdit和Mega 3.1软件进行系统进化分析.结果 35株病毒间VP1核苷酸同源性为92.1%-100%,它们与A、B基因型代表株VP1区核苷酸同源性差异较大,为81.4%-91.1%,与C4基因型代表株接近,其核苷酸同源性在93%-97.4%之间.1998-2004年深圳地区EV71主要流行株为C4b亚型,从2003年开始逐步向C4a亚型过渡,至2006年已全部变迁为C4a亚型,且从2003年至2008年,深圳地区EV71 C4a株与安徽阜阳株FY23的核苷酸的同源性分别为：94.5%-94.7%,95.7%-95.8%,96.2%,95.4%-97.5%,96.3%-99.2%,有逐年增高的趋势.2006年两株EV71和2008年EV71代表株核苷酸序列在VP1区的第66位点,均由A→C,从而导致VP1区氨基酸的第22位点由谷酰胺变为组氨酸（Q→H）.结论 深圳地区EV71流行株逐渐由C4b亚型向C4a亚型演变,2006年部分EV71及2008年EV71 VP1第66核苷酸位点发生有义突变.     

蒙花苷抗肠道病毒71型诱导的炎症反应研究

为探讨野菊花的主要成分蒙花苷对肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)诱导的炎症反应的作用,建立EV71体外感染试验模型。在用EV71感染Vero细胞前,用终浓度分别为3、10和30μmol/L蒙花苷提前预处理各组细胞,应用MTT法检测细胞活力,应用ELISA检测细胞上清液中炎性因子IL-6、IL-1β、IL-8的分泌情况,应用qRT-PCR检测炎性因子IL-6、IL-1β、IL-8 mRNA的相对表达水平,评价蒙花苷的抗炎作用。应用Western blotting检测NF-κB p65的核转位,评价蒙花苷对NF-κB通路的影响。结果显示,与EV71组比较,10和30μmol/L蒙花苷分别将IL-6的分泌水平降低了7.15和10.4 pg/mL;IL-1β的分泌水平降低了3.00和5.15 pg/mL。30μmol/L蒙花苷将IL-8的分泌水平降低了15.5 pg/mL。30μmol/L蒙花苷能够显著降低EV71诱导的IL-6、IL-1β以及IL-8 mRNA的表达水平,分别降低了35.2倍、18.8倍和29.23倍。蒙花苷能够显著降低EV71诱导的NF-κB p65...     

北京市成人感染肠道病毒71型血清流行病学分析

目的 分析和评价北京市成年健康人群肠道病毒71型(EV71)血清保护抗体水平,为EV71预防控制提供科学依据.方法 从医院收集北京市健康成年人群的血样和资料,采用酶联免疫吸附法检测EV71 IgG抗体,用微量细胞病变中和试验方法进一步检测EV71中和抗体滴度水平.结果 检测成年人群486例,年龄分布为19～62岁,平均EV71 IgG抗体阳性率水平为40.3％,男性抗体水平与女性没有显著差异,EV71 IgG抗体阳性率随着年龄的增长而下降;中和抗体阳性水平滴度高于1∶256的占13.3％,中和抗体滴度水平随年龄增长而下降.结论 北京市40％的健康成年人群血清中具有EV71保护性抗体,抗体滴度高于1∶256者仅占13％,随着年龄增长,EV71保护性抗体水平呈现下降趋势.     

肠道病毒71型IgM抗体检测在手足口病早期诊断中的价值

目的 评估人肠道病毒71型(EV 71)IgM抗体在手足口病早期诊断中的价值.方法 自发病后连续每日采集2010年我院收治的38例手足口病患儿血清及咽拭子标本,分别检测EV 71IgM抗体、肠道病毒核酸、EV 71特异核酸.结果 38例手足口病患儿IgM抗体,按发病天数累加阳性率分别为:第1天60.5%、第2天71.1%、第3～4天81.5%、第5天92.1%、第6天92.1%;肠道病毒核酸阳性率为73.6%;EV 71特异核酸阳性率为60.5%.结论 EV 71 IgM抗体在手足口病发病的第1天即可出现,至第5天阳性率达到峰值,可作为手足口病早期诊断指标之一.     

肠道病毒71型IgM抗体检测在手足口病早期诊断中的价值

目的 评估人肠道病毒71型(EV 71)IgM抗体在手足口病早期诊断中的价值.方法 自发病后连续每日采集2010年我院收治的38例手足口病患儿血清及咽拭子标本,分别检测EV 71IgM抗体、肠道病毒核酸、EV 71特异核酸.结果 38例手足口病患儿IgM抗体,按发病天数累加阳性率分别为:第1天60.5%、第2天71.1%、第3～4天81.5%、第5天92.1%、第6天92.1%;肠道病毒核酸阳性率为73.6%;EV 71特异核酸阳性率为60.5%.结论 EV 71 IgM抗体在手足口病发病的第1天即可出现,至第5天阳性率达到峰值,可作为手足口病早期诊断指标之一.     

携带肠道病毒71型VP1基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的 构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型(EV71)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71 DNA疫苗的研发.方法 利用DNA重组技术,构建表达EV71 VP1蛋白的真核表达质粒VR-EV71 VP1,体外转染Vero细胞后检测目的 蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027.结果 酶切鉴定证实构建含EV71 VP1基因的重组质粒,体外表达目的 蛋白具有较好的抗原性,并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌.结论 成功构建稳定携带肠道病毒71型VP1基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础.     

抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备具有中和活性的抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1的单克隆抗体.方法 人工合成SP55和SP70(分别包含VP1的第163-177,208-222位氨基酸)两段VP1的多肽,分别免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术进行细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞并测定效价.用分泌的单抗和EV71病毒在RD细胞上进行中和试验以检验其中和活性.结果 得到2株能稳定分泌抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,2株单抗的中和效价分别为1:8和1:16.结论 成功制备出2株具有中和活性的抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体,为其下一步应用打下基础.