脊髓灰质炎病毒壳蛋白基因不同免疫途径对免疫效果的影响

９０年代初出现的ＤＮＡ免疫技术,在免疫学和疫苗学的领域中是一重要的进展［１］,现有资料已明确,ＤＮＡ免疫可以诱发机体内良好的体液免疫和细胞免疫［２］,有极大的应用潜力［３］。但有许多基础问题仍有待解决,包括最佳免疫途径［４］。通常,人们认为肌细胞组织可能是较佳的免疫部位［５］,而表皮细胞属非终未细胞,存在ＤＮＡ整合的危险。本文根据ＤＮＡ整合的危险性和免疫效果这两个因素,探讨多种免疫途径对脊髓灰质炎（脊灰）病毒壳蛋白基因ＤＮＡ免疫所诱导的体液免疫反应的影响,以及可能存在的ＤＮＡ整合危险性。１　材料…     

vJ16env/IFNα-2b基因共表达颗粒化抗原疫苗的免疫程序

目的：观察国际流行株HIV-lenv与IFNα-2b基因共表达的颗粒化抗原疫苗与质粒DNA核酸疫苗免疫程序优化的效果。方法：将重组质粒pJ16env／IFN廿2b经脂质体介导转染RK细胞，并在痘苗病毒中共表达HIV-lenv与IFNα-2b基因，以间接免疫荧光与斑点酶联免疫法鉴定其表达产物。以表达产物与质粒DNA联合免疫鼠脾淋巴细胞，检测淋巴细胞转化率、细胞毒性T细胞杀伤活性、CIM^ 、CD8^ 细胞计数与体液免疫水平。结果：nJ16env／IFNα-2b基因表达的颗粒化抗原疫苗具有良好的免疫原性，3vJ16env／IFNα-2b pJ16env／IFNα-2b联合免疫效果优于vJ16env／IFNα-2b单独免疫。结论：pJ16env／IFNα-2b基因表达的颗粒化抗原疫苗能诱导机体产生细胞免疫与体液免疫。     

基因免疫研究进展

本文综述了基因免疫中ＤＮＡ转化方法的研究进展。     

sgp13OcDNA在痘苗病毒载体系统中的表达

ｇｐ１３０是一种分子量为１３０ｋＤ的细胞膜糖蛋白,是ＩＬ－６等多种细胞因子共用的信号传递分子。本研究将含ｇｐ１３０胞外区全长的可溶性片段的基因（ｓｇｐ１３０ｃＤＮＡ）构建到痘苗病毒载体中,并与野生型痘苗病毒在ＴＫ－１４３细胞中发生同源重组,用ＢｕｄＲ和Ｘ－ｇａｌ双重选择,得到带有人ｓｇｐ１３０的重组痘苗病毒（Ｖｓｇｐ１３０）。采用ＩＤＡ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ法证实：感染Ｖｓｇｐ１３０的ＴＫ－１４３细胞上清中有较强的ｓｇｐ１３０表达,表达产物分子量为１００ｋＤ左右。     

HIV-1CN54 DNA疫苗滴鼻免疫小鼠诱发系统和黏膜免疫应答

目的：探讨重组痘苗病毒rVVsyngp120或rVVmCN54gp120候选疫苗是否增强HIV-1CN54合成gp120基因(syngp120)DNA疫苗的免疫原性。方法：第0、7、14、21天用DNA疫苗滴鼻免疫小鼠,第28、35、42天再滴鼻接种rVVsyngp120或rVVmCN54gp120。体外测脾和肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞增殖应答与CD8^ CTL应答。测血清和黏膜洗液特异的IgG和IgA,并测其是否中和实验室适应株HIV-1SF33。结果：单纯DNA免疫后,脾和MLN淋巴细胞在体外发生增殖应答和CTL应答,且测出血清特异的IgG和黏膜洗液特异的IgA。重组痘苗病毒末次免疫后第2周(第56天),发现rVVmCN54gp120增强MLN淋巴细胞增殖应答和CTL应答,脾CTL应答也增强。rVVsyngp120则增强MLN CTL应答。同时发现：2组重组痘苗病毒免疫的动物其血清中特异IgG抗体滴度均有所增高,但黏膜(粪便和阴道)洗液特异IgA抗体滴度却未增高,未测出血清特异IgA和黏膜洗液特异IgG。免疫血清可中和HIV-1SF33,而阴道洗液却不能。结论：单纯DNA疫苗滴鼻免疫可诱发较弱的系统和黏膜体液免疫与细胞免疫,但维持时间短。重组痘苗病毒主要增强局部黏膜的细胞免疫应答,且稍增强系统体液免疫应答,未增强黏膜的IgA应答。免疫血清有中和作用。     

免疫酶技术在修饰的安卡拉痘苗病毒感染性滴度检测中的应用

 修饰的安卡拉痘苗（modified vaccinia Ankara，MVA）是MVA病毒在原代鸡胚成纤维细胞（CEF）中经过一系列的传代得到^[1]，在人体内可以表达 MVA 病毒蛋白及其携带的外源基因蛋白，但却不形成完整的病毒颗粒，为人体内复制缺陷性病毒^[2]，安全性好，即使在免疫功能缺陷病人和免疫抑制的恒河猴体内也未显示出明显的副作用^[3]。近年来，重组 MVA 病毒广泛地用于预防性疫苗和感染性疾病、癌症治疗的基础与临床研究^[4]，其中以 MVA 病毒作为载体的疫苗是最有希望用于预防人类艾滋病的活载体疫苗之一^[5]。由于 MVA 病毒本身的繁殖特点，其滴度的检测不适合采用常规的蚀斑法进行^[6]；而常规微量细胞病变（cytopathic effect，CPE）法相对耗时，对细胞培养要求高，往往受到主观因素的影响，因而不稳定且精确度降低^[7]，给检测工作带来不便。上世纪 90 年代初 Usuba 等^[8]建立了免疫酶技术测定流感病毒感染性滴度的方法，较常规方法省时、结果准确﹑重复性好。我们就免疫酶技术在 MVA 病毒感染性滴度检测中的适用性进行了探讨，旨在建立一种准确、快速的 MVA 病毒感染性滴度检测方法。......     

非复制重组痘苗病毒中白细胞介素6的表达及其对重组病毒免疫效果的影响

目的 研究白细胞介素6（IL－6）在非复制型痘苗病毒中的表达及其对重组痘苗病毒免疫效果的影响。方法 利用非复制型痘苗病毒表达载体pNEOCK11β75IL6和重组病毒RVJ123，通过两步重组构建能同时表达IL－6和乙型肝炎病毒（HBV）HBsAg的非复制型重组痘苗病毒PVJ123ΔCK11β75IL6。免疫动物并观察其免疫效果。结果 Southern blot证实痘苗病毒C、K片段间基因缺失的同时伴有IL－6基因的插入，IL－6和HBsAg可同时表达。鼻腔吸入分别免疫BALB／c小鼠和新西兰白兔，ELISAPOT实验证实免疫后两周小鼠肺淋巴细胞的抗－HBsAg IgA、IgG抗体分泌细胞（ASC）数比对照组（RVJ123ΔCK11β75）显著增加，并可在小鼠血液、肺浸出液以及新西兰白兔血液、肺浸出液、其他分泌液样品中检测到抗－HBsAg的特异性的IgA、IgG抗体。与对照组相比，IgA、IgG抗体阳转率及抗体滴度提高。结论 非复制型痘苗病毒载体中表达的IL－6可增强其诱导的免疫反应，为细胞因子IL－6作为有效的载体疫苗佐剂提供了实验基础。     

痘苗病毒载体与肿瘤基因治疗（下）——重组痘苗病毒载体介导的肿瘤基…

目前采用同源重组构建了多种表达外源基因的重组痘苗病毒载体，包括ＩＬ－２，ＩＬ－３，ＩＬ－４，ＩＬ－５，ＩＬ－６，ＩＦＮα，ＩＦＮγ，ＧＭ－ＣＳＦ，ＴＮＦ，ＩＬ－１０等细胞因子基因及ｐ９７，ＣＥＡ，ＭＵＣ１等肿瘤抗原基因，并应用于肿瘤基因治疗的体内外实验取得了明显的疗效。应用痘苗病毒载体进行ｉｎ ｖｉｖｏ基因治疗可望成为肿瘤基因治疗的一种新模式。     

表达2型单纯疱疹病毒糖蛋白D的重组痘苗病毒对动物的免疫效果

用表达２型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ－２）糖蛋白Ｄ的重组痘苗病毒（Ｒ－ｇＤ－Ｖ）免疫ＣＢＡ小鼠，通过间接免疫荧光（ＩＦ）（观察小鼠抗体滴度变化）和四甲基偶氮唑蓝法（ＭＴＴ）动态观察细胞毒性Ｔ细胞活性（ＣＴＬ），均见增高并检测了其产生的抗体对动物的保护作用。同时对Ｒ－ｇＤ－Ｖ和２型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ－２）产生的二次ＣＴＬ活性进行了比较，结果表明，Ｒ－ｇＤ－Ｖ产生抗体３周达高峰（１：６４０），７周下降为１：３２０，抗体对病毒攻击动物有保护作用，其中和指数（Ｎ）为６３。Ｒ－ｇＤ－Ｖ在鼠体内产生初次ＣＴＬ８ｄ达高峰，１２ｄ后消失；二次ＣＴＬ持续８周之久，且ＣＴＬ活性明显高于初次。Ｒ－ｇＤ－Ｖ和ＨＳＶ－２相比较产生ＣＴＬ在统计学上有差异（Ｐ＜０．０５）。说明Ｒ－ｇＤ－Ｖ能引起体液免疫和细胞免疫，对动物有保护作用。     

小鼠不同细胞间表观遗传修饰的变化对Pdx-1基因转录表达的影响

目的:通过比较小鼠不同细胞类型之间Pdx-1基因转录起始区的表观遗传修饰差异,探讨表观遗传修饰对Pdx-1基因转录表达的作用。方法:采用免疫共沉淀-实时定量PCR法检测小鼠胚胎干细胞(mES)、小鼠成纤维细胞株NIH3T3细胞和小鼠β细胞株NIT-1细胞Pdx-1和MLH1基因转录起始区DNA甲基化和组蛋白修饰(H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化)的状况。同时采用实时定量RT-PCR检测上述3种细胞各基因mRNA表达水平。分析基因的DNA甲基化水平、H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化修饰与基因表达之间的相互关系。结果:(1)以mES细胞为对照,NIT-1细胞的Pdx-1基因转录起始区呈低DNA甲基化和高H3K4m3修饰(P0.05),NIH3T3细胞的Pdx-1基因的转录起始区的DNA甲基化、H3乙酰化、H3K4m3和H3K9m3修饰水平明显增高(P0.05);(2)Pdx-1基因仅在NIT-1细胞表达,其表达与DNA甲基化存在等级负相关(r=-0.802,P0.01),与H3K4m3修饰存在直线相关(r=0.997,P0.01),与H3K9m3修饰存在等级负相关(r=-0.879,P0.01);(3)管家基因MLH1的表达与所检测的表观遗传修饰无相关性。结论:DNA甲基化、H3K9m3与H3K4m3修饰能相互协调,共同调控Pdx-1基因的表达,对胚胎干细胞向β细胞分化具有重要意义。     

HIV复制型痘苗病毒载体疫苗免疫原性分析

目的 分析比较HIV复制型痘苗病毒载体疫苗在小鼠和家兔体内的免疫原性。方法 HIV痘苗病毒载体疫苗vTKgpe以肌内、皮下、皮内3种途径接种小鼠，每周采血检测HIV特异性抗体和针对痘苗病毒载体的抗体，4周时取脾细胞用流式细胞仪检测细胞免疫。此外vTKgpe皮内途径接种2只家兔，每周采血检测抗体。结果 肌内和皮下免疫的小鼠在2周时开始出现HIV特异性抗体，4周时开始消失；针对痘苗病毒载体的抗体滴度在4周时急剧升高；血清吸附实验表明痘苗病毒抗体的升高对HIV特异性抗体检测有一定的掩盖。细胞免疫仅在皮内免疫的小鼠中检测到。家兔的HIV特异性抗体在2周时出现，并能维持一段时间。结论 在小鼠体内，肌内和皮下注射2种途径倾向于诱导体液免疫，而皮内接种则以诱导细胞免疫为主。家兔对痘苗病毒的敏感性要高于小鼠。     

HIV-2 gag rFPV与rDNA疫苗的联合免疫研究

目的 探讨HIV-2核心蛋白基因gag重组DNA疫苗与重组鸡痘病毒进行联合免疫引起小鼠的免疫应答，为研究HIV-2基因重组疫苗的免疫策略提供实验基础。方法 大量制备并纯化HIV-2 gag重组DNA疫苗和重组鸡痘病毒，以肌肉注射的方式免疫BALB／c小鼠，ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体，流式细胞仪测定CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞亚类数量，乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测脾CTL对HIV-2靶细胞的杀伤活性。结果 重组DNA疫苗和重组鸡痘病毒单独免疫及二者联合免疫均刺激小鼠产生HIV-2特异性抗体，脾T细胞亚类数量增加，并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性，但联合免疫组在各项指标上均高于单独免疫组。结论 以HIV-2gag重组DNA疫苗进行基础免疫、以HIV-2gag重组鸡痘病毒进行加强免疫能诱导小鼠产生更强的特异性细胞和体液免疫应答。     

B5-deficient vaccinia virus as a vaccine vector for the expression of a foreign antigen in vaccinia immune animals

Recombinant vaccinia viruses have shown promise as vaccine vectors. However, their effectiveness is markedly reduced by pre-existing anti-vaccinia immunity. The possibility of new vaccinia immunizations in the event of a bioterror-related smallpox release poses an additional negative impact on the utility of vaccinia-based vectors. Thus, we aimed to design a vaccinia vector that would enhance the immune response to an expressed foreign protein in a pre-immune animal model. To do this, we made use of the finding that most neutralizing antibodies against the extracellular form of vaccinia virus are directed against the B5 protein. We found that mice immunized with vaccinia, primed with Gag plasmid DNA, and boosted with a recombinant vaccinia virus lacking the majority of the B5 ectodomain expressing a test antigen, HIV Gag, had stronger anti-Gag immune responses than mice that were boosted with a wild-type virus-expressing Gag. These findings are particularly striking given the more attenuated phenotype of this virus, as compared to its wild-type counterpart. Importantly, we found that vaccination with a B5R deletion virus, followed by boosting with the Gag-expressing virus lacking the majority of the B5 ectodomain, resulted in poorer anti-Gag immune responses. Thus, recombinant vaccinia viruses lacking the B5 ectodomain may serve as vaccine vectors in DNA prime-vaccinia boost vaccinations of individuals with pre-existing immunity against vaccinia. These data open the possibility of extending the potential benefit of replication competent recombinant vaccinia virus vectors to a larger population.     

豚鼠延髓c-fos基因表达在钩端螺旋体OmpL39免疫应答期的变化

目的和方法：观察钩体外膜疏水蛋白ＯｍｐＬ３９的免疫保护作用和对豚鼠中枢ｃ－ｆｏｓ基因表达的影响,分别用ＯｍｐＬ３９与钩体死菌苗（ＷＬＣＶ）、生理盐水（ＮＳ）对照免疫豚鼠,用强毒０１７株钩体活菌攻击,处死动物后用新鲜延髓切片观察对比。结果：ＯｍｐＬ３９在豚鼠体内能产生高效价的阳性抗体,免疫保护率为１００％。ＯｍｐＬ３９免疫组豚鼠中枢ｃ－ｆｏｓ基因表达面积比为０．００８６％±０．０００３％,颗粒计数为４６３．０±１．３４个,较ＷＬＣＶ和ＮＳ组显著减少（Ｐ＜０．０５）。结论：ＯｍｐＬ３９有较强的免疫保护作用,对豚鼠中枢ｃ－ｆｏｓ基因的表达有抑制作用。     

乙型肝炎病毒DNA疫苗电转加强含S-PreS1颗粒的蛋白疫苗在小鼠中免疫效果的研究

目的探索新型有效的HBV治疗性疫苗研制的策略。方法构建含S与PreS1融合基因的HBVDNA疫苗,采用两次蛋白疫苗（含不同佐剂）肌内注射初免,一次DNA疫苗皮内电转免疫加强的联合免疫方式,在小鼠中分析比较了各疫苗所引起的体液与细胞免疫应答。结果HBVDNA疫苗皮内注射加电转可明显增强表面抗原（s）特异的细胞免疫应答（IFN-γ ELISpot分析）及PreS1特异性抗体水平,并以蛋白疫苗加铝佐剂初免组细胞免疫增强效果最明显。结论HBSS1 DNA疫苗结合皮内注射＋电转方式可明显加强含S-PreS1颗粒的蛋白疫苗在小鼠中免疫效果,明显高于蛋白疫苗单独应用。这些研究结果为新型HBV治疗性疫苗的研制与应用提供了依据。     

The N-terminal domain of the vaccinia virus E3L-protein is required for neurovirulence, but not induction of a protective immune response

Encephalitis is a rare, but serious complication from vaccination against smallpox using replication competent strains of vaccinia virus. In this report we describe mutants of vaccinia virus, containing N-terminal deletions of the vaccinia virus interferon resistance gene, E3L, that are attenuated for neuropathogenesis in a mouse model system. These recombinant viruses replicated to high titers in the nasal mucosa after intra-nasal infection of C57BL/6 mice but failed to spread to the lungs or brain. These viruses demonstrated reduced pathogenicity after intra-cranial infection as well, indicating a decrease in neurovirulence. Intra-nasal inoculation or inoculation by scarification with a low dose of recombinant virus containing a deletion of the entire N-terminal domain of E3L protected against challenge with a high dose of wild-type vaccinia virus, suggesting that this replication competent, but attenuated strain of vaccinia virus may have promise as an improved vaccine for protecting against smallpox, and as a vector for inducing mucosal immunity to heterologous pathogenic organisms.     

质粒型甲病毒复制子载体系统的构建及其功能鉴定

目的 构建质粒型甲病毒复制子载体系统,并对其功能进行鉴定.方法 在XJ-160病毒感染性cDNA克隆的基础上,将病毒非结构基因序列分为三个片段扩增,分步克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游,并用多克隆位点序列替代病毒的结构基因构建XJ-160病毒质粒型复制子载体.将病毒核蛋白基因及包膜糖蛋白基因分别克隆至pVAX1 CMV启动子下游构建载体的两个辅助质粒.通过绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因的表达检验该质粒型载体系统的功能特性.结果 成功构建了包括复制子载体和辅助质粒的质粒型甲病毒复制子载体系统,且该复制子载体系统可成功表达绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因.结论 本研究构建了能够表达外源基因的质粒型甲病毒复制子载体系统,为目标基因表达、重组病毒颗粒制备等奠定了基础.