条件化转染MT基因小鼠模型的建立

目的建立四环素诱导调控的MT转基因小鼠模型。为血管瘤试验研究及MT致瘤机理研究奠定基础。方法通过PCR方法从鸡的基因组序列中克隆绝缘子元件；构建四环素诱导调控的条件化转基因质粒，并将其调控元件和受控元件串联成一个载体，在两元件之间插入绝缘子，以减轻两者之间的相互干扰。为提高转基因的表达效率，在转基因盒的上游亦插入绝缘子元件；将MT基因亚克隆至此载体；转基因载体功能行细胞瞬转试验及半定量逆转录-PCR验证后，将其在体外扩增、酶切、回收，行小鼠受精卵原核注射，获得转染MT基因阳性小鼠；强力霉素体外诱导部分阳性鼠MT基因表达，使其具有血管瘤表型。结果绝缘子元件成功克隆；成功构建条件化转基因载体；体外试验证实目的基因的表达受强力霉素的严格调控；通过原核注射，获得5只转基因阳性鼠；2只行体外诱导2月后。1只出现血管瘤表型，逆转录．PCR检测证实MT表达。其余3只阳性小鼠在传代建系中。结论条件化MT转基因小鼠模型成功构建，此小鼠模型能够为血管瘤的试验研究及MT致瘤机理的体内研究提供一定的基础。     

HBV融合抗原真核表达载体pIRES-neo-HBAg的构建及表达

目的 构建HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,并验证其在293T细胞中的表达.方法 以含有HBV融合抗原的质粒pVAX1-HBV为模板,PCR扩增该融合基因.PCR产物经纯化后,将其克隆至载体pMD18-T中,构建pMD18-T-HBV质粒,经酶切和测序鉴定后,将其定向克隆入真核表达载体pIRES-neo,获得真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.将该重组表达质粒瞬时转染人293T细胞,采用Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术验证HBV融合抗原的表达.结果 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术结果显示融合抗原能够在293T细胞中表达.结论 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.     

荧光素酶标记的HBV细胞模型的建立

建立萤火虫荧光素酶(Fluc)为报告基因标记的乙型肝炎病毒(HBV)体外感染的细胞模型。利用分子亚克隆技术,以pAAV/1.2HBV质粒为模板,PCR扩增带有反向重复序列(ITR)的1.2倍HBV基因组片段,反向插入真核表达载体pGL3-CP-Fluc中,构建Fluc标记的HBV基因组表达质粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2,并将此质粒转染至Huh-7细胞中。全自动免疫分析仪进行HBsAg、HBeAg的定量检测,生物发光检测仪检测Fluc其在细胞的表达水平。成功构建了1.2倍HBV全基因真核表达载体,稳定转染Huh-7细胞后,质粒在细胞中高水平表达Fluc,并可以正常分泌HBsAg、HlBeAg。重组质粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2能在Huh-7细胞中表达,其稳定转染的细胞可作为一种新型的HBV体外感染模型,为抗病毒药物研究奠定基础。     

HBsAb靶向干扰素和IL-12双表达质粒pVAX-HBVE的构建与应用

目的构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE。方法将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名为pVAX-HBVE。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,ELISA检测目的基因表达;提取重组质粒pVAXHBVE,注射到乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转入1.3拷贝HBV全基因组的BALB/c小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果 pVAX-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pVAX-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够含有靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的双表达质粒,为慢性乙肝基因治疗提供新的策略。     

1．3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bew0细胞中的表达

目的构建1．3倍乙型肝炎病毒（HBV）全基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）一HBV1．3。并观察其在Bewo细胞中的表达。方法以质粒pMD18T—HBV上的HBVDNA序列为模板,构建1-3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBVDNA水平。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1．3倍HBV全基因表达载体．该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg。并可检测到高水平的HBVDNA。结论成功构建了1．3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）一HBV1．3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础。     

载体和基因片段的选择对戊型肝炎病毒基因免疫抗原表达的影响

目的比较不同载体和不同大小的目的基因片段对戊型肝炎病毒(HEV)基因免疫抗原表达的影响,为基于HEV中和抗原表位的HEV基因免疫提供一定的依据。方法将含Ⅳ型HEV中国株中和抗原表位的p166和p179片段编码基因分别克隆入pTR421和pCDNA3.1两种真核表达载体,用脂质体介导基因转染HepG2人肝癌细胞系,经间接免疫荧光和Western blot分析以及将质粒注射小鼠局部肌肉组织后经免疫组织化学染色检测,分析目的基因在体内外的表达水平。结果成功构建了pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179四种重组质粒,经限制性内切酶双酶切和核苷酸测序鉴定,编码基因正确无误;pTR421-179转染的细胞以及注射小鼠的局部肌肉组织可以检测到p179的表达,而pCDNA3.1-179、pCDNA3.1-166以及pTR421-166均检测不到目的基因在体内、外的抗原表达。结论载体和目的基因片段的选择显著影响HEV抗原在体内、外的表达,直接关系到基因免疫的成功与否。     

APOBEC3F的克隆、真核表达及其抗HBV效应的初步研究

目的克隆、体外真核表达载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3F(APOBEC3F)基因并研究其抗病毒效应。方法应用RT-PCR的方法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3F基因,构建HA-APOBEC3F融合蛋白真核表达载体pXFA3F,pXFA3F和具有复制能力的1.3倍HBV载体pHBV1.3共转染HepG2细胞,Western印迹检测APOBEC3F融合蛋白在HepG2细胞中的表达,ELISA方法检测细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBV相关mRNA水平变化。结果克隆了APOBEC3F基因,其经测序与GeneBank公布序列一致;构建的APOBEC3F真核表达载体pXFA3F经转染可在HepG2细胞中瞬时表达;APOBEC3F可抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原的分泌,可使转染细胞内HBV相关mRNA水平下降。结论成功克隆并真核表达了APOBEC3F基因,其在体外具有抗HBV生物学效应。     

固有免疫分子TRIM5α对乙型肝炎病毒复制的影响

目的:构建固有免疫分子TRIM5α的真核表达质粒,研究TRIM5α 对HBV复制的影响.方法:通过巢氏RT-PCR技术从恒河猴肺组织中扩增出TRIM5α的编码基因,并将其克隆入pcDNA3.1真核表达载体.将TRIM5α真核表达质粒转染HepG2细胞,用Western blot的方法鉴定TRIM5α蛋白表达情况.将TRIM5α真核表达质粒与复制型HBV质粒通过磷酸钙沉淀法共转染HepG2细胞、通过尾静脉高压注射法共转染BALB/c小鼠.ELISA检测转染细胞上清及小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;免疫组化检测小鼠肝组织HBcAg的表达;Southern blot检测转染细胞中HBV复制中间体.将TRIM5α真核表达质粒转染293T细胞3小时后,再将基于HIV-1结构的慢病毒载体三质粒系统转染293T细胞,通过检测转染细胞上清中的HIV-1 p24抗原含量来鉴定TRIM5α抗HIV-1功能.结果:成功构建TRIM5α真核表达质粒;过表达TRIM5α不能有效降低HBV抗原和复制中间体水平,但可抑制HIV-1 p24抗原的表达.结论:TRIM5α不能有效抑制HBV的复制.     

时空调控 miR-195敲减转基因载体的构建及验证

目的：构建时空调控 miR-195敲减转基因载体并验证其活性。方法通过分子克隆技术构建含有神经特异性启动子、四环素诱导表达系统、miR-195海绵、绿色荧光蛋白及绝缘子等调控元件的转基因载体并测序鉴定,利用细胞转染技术将该载体瞬时转染入 SH-SY 5 Y 细胞,经荧光显微镜观察其荧光表达,利用实时定量 PCR 技术及蛋白免疫印迹检测miR-195含量及 GFP 蛋白表达。结果通过将 Tet-on 四环素诱导系统中反义转录激活子 rt-TA 克隆到 NSE 启动子下游,以及 TRE-Tight 的多克隆位点内引入 miR-195海绵携带 IRES 介导的 EGFP ,获得双质粒 Tet-on 表达载体。以 pcDNA 3.1＋质粒为骨架,3个不同区域的双拷贝 cHs 4绝缘子核心片段为间隔,将其调控元件（ NSE-rtTA ）和反应元件（ TRE-miR-195 sponge-IRES-EGFP ）串联成单一转基因载体。该载体经测序验证序列正确,瞬时转染入 SH-SY 5 Y 细胞,经强力霉素诱导36 h 后细胞内可见明显绿色荧光蛋白表达,且 miR-195表达水平明显降低。结论成功构建神经系统特异性 miR-195敲减转基因载体,并具有时空调控的特点,为进一步建立转基因动物模型奠定基础。     

CKLF基因与CKLFSF1基因间的顺式调控元件

目的：探讨CKLF基因与CKLFSF1基因间序列(CCS)的调控作用。方法：运用PCR技术扩增CCS，并将此片段插入含有荧光素酶(luriferase)报告基因载体pGL3-basic，以及pGL3-SV40启动子中，构建受其调控的荧光素酶报告基因载体。应用脂质体介导基因转染技术，将4种重组质粒转染Hela细胞，进行瞬时表达分析。结果：在pGL3-basic和pGL3-basic-CCS质粒中的报告基因luciferase均无表达，但将CCS片段插入至promoter上游后，荧光素酶活性增加近1倍。结论：CKLF与CKLFSF1基因间的序列不具有启动子活性，但该序列中却可能存在调控其下游基因表达的顺式增强子元件。     

抗乙肝药物ZY101对HBV转基因鼠体内抗病毒作用研究

目的:观察ZY101在HBV转基因BALB/c小鼠体内的抗HBV作用。方法:将30只雄性HBV转基因鼠随机分为阴性对照组(杜氏磷酸盐缓冲液,DPBS)、阳性对照组(每天一次灌胃给予拉米夫定150mg·kg-1)、ZY101低剂量组(1mg·kg-1)、ZY101中剂量组(3mg·kg-1)和ZY101高剂量组(10mg·kg-1),每组6只,阳性对照组每天一次灌胃给药,其他组单次尾静脉注射。药前、药后后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 w采集血清,用ELISA试剂盒检测HBsAg、HBeAg的表达,用实时荧光定量PCR技术检测血清中HBV DNA的含量。药后38w处死所有动物,采集肝组织,检测肝组织中HBsAg和HBeAg表达及HBV DNA和RNA的含量。结果:拉米夫定每天灌胃给予HBV转基因小鼠150mg·kg-1能够明显降低血清HBV DNA水平(P0.05),但对HBsAg、HBeAg和HBV RNA无明显影响;ZY101分别单次尾静脉注射给予HBV转基因小鼠1、3、10mg·kg-1,能够降低血清及肝组织中HBsAg和HBeAg的水平(P0.05、P0.05、P0.01),且有剂量依赖性,但血清HBV DNA及肝组织HBV DNA、HBV RNA水平无显著影响。结论:在本实验条件下,拉米夫定每天灌胃给予HBV转基因小鼠150mg·kg-1能够降低血清HBV DNA水平;ZY101单次尾静脉注射给予HBV转基因小鼠1、3、10mg·kg-1,能够剂量依赖的降低HBsAg和HBeAg的表达水平。     

乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变株复制质粒的构建

目的　构建乙型肝炎病毒 (HBV)前C区和基本核心启动子区 (BCP)突变株的复制质粒。方法　以含 1 2倍拷贝HBVDNA全基因的质粒 (pHBV1 2 )为工具 ,采用分子克隆、PCR定点诱变、限制性酶切长度多态性和序列分析等技术构建目的质粒。转染肝癌细胞株Huh7后 ,测定培养上清HBsAg、HBVDNA来了解病毒抗原的表达和病毒复制。结果　成功构建了 10种HBV全基因前C区 /BCP区突变的表达质粒 ,转染肝癌细胞株 ,获得病毒的表达和病毒颗粒的分泌。其中 ,pUC HBVT176 2、A176 4双突变以及pUC HBVT175 3突变株复制效率较高 ,转染细胞培养上清的HBVDNA为3 16× 10 5拷贝 ml。野生型复制子培养上清HBVDNA含量稍低于BCP突变复制子。结论　获得 10株含有不同前C区和BCP区突变的HBV全基因复制质粒 ,为体外进一步研究上述变异的生物学意义提供基本模型。     

Toll样受体3介导抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒复制

目的探讨Toll样受体3（TLR3）介导的天然免疫对Bewo细胞中乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响。方法首先用TLR3配体polyI：C处理Bewo细胞,观察细胞TLR3 mRNA表达的动力学。然后将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1（＋）-HBV1.3转染Bewo细胞,12h后,以polyI：C处理3d。最后,用抗TLR3处理Bewo细胞1h后,加入25μg/ml polyI：C刺激。采用荧光定量RT-PCR、微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测细胞TLR3mRNA表达、HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平。结果 polyI：C可显著诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达（P〈0.05）,呈时间和剂量依赖性;与对照组比较,polyI：C可显著抑制HBV复制（P〈0.001）,抗TLR3可显著逆转polyI：C对HBV复制的抑制作用（P〈0.01）。结论 TLR3介导的天然免疫能一定程度抑制Bewo细胞中HBV复制,为防治HBV宫内感染提供了新的途径。     

乙型肝炎病毒核心蛋白小干扰RNA载体的构建与验证

目的 构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,并验证其干扰效果.方法 设计针对HBV基因组（ayw亚型）HBc基因的小干扰RNA序列（位于2147 bp ～2165 bp序列）,目的片段与载体成功连接后转入大肠埃希菌DH5α,酶切及测序验证其正确性.最后以脂质体转入HepG2.2.15细胞中,检测其干扰效果.结果 成功构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,并命名为pshRNA-HBc..酶切及测序验证正确,pshRNA-HBc对HepG2.2.15细胞中HBc表达具有特异性干扰效果.结论 构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,为后续研究HBc的生物学功能奠定良好基础.     

HBx modulates iron regulatory protein 1-mediated iron metabolism via reactive oxygen species

Hepatitis B virus X protein (HBx) is involved in viral metabolism and progression of liver disease. Iron metabolism plays a significant role in liver disease. In this report, to elucidate the relationship between iron metabolism and HBx, we established the Huh7 cell lines in which HBx was stably expressed (Huh7-HBx). In Huh7-HBx, we observed that transferrin receptor 1 (TfR1) expression decreased and ferritin heavy chain (FtH) expression increased as well as reactive oxygen species (ROS) level increased. We also found that these modulations were caused by the downregulation of iron regulatory protein 1 (IRP1). Furthermore, the levels of total iron and labile iron pool (LIP) were altered in Huh7-HBx. In addition, antioxidant N-acetylcystein (NaC) increased IRP1 expression by depleting HBx-induced ROS. We also confirmed these alterations of TfR1 and FtH in the primary hepatocytes of HBx transgenic mice and in HepG2.2.15 cells that constitutively replicate the intact HBV genome. In conclusion, these results suggest that HBx modulates iron metabolism via ROS leading to pathological status in liver diseases.     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

广东省乙型肝炎病毒表面抗原携带者配偶感染乙型肝炎危险性研究

目的探讨广东省乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）携带者配偶感染HBV的危险性,为成人乙肝防控工作策略提供参考依据。方法采用病例对照方法,选择广东省2006年乙肝血清流行病学调查发现的20。45岁HBsAg携带者及配偶作为病例组,按居住地、性别、年龄及婚龄等因素配比选择当年HBsAg阴性者及配偶为对照组。进行问卷调查和乙肝血清学指标检测。利用PCR方法分析夫妻双方均HBsAg阳性的HBV基因型。结果病例组配偶HBsAg阳性率13．71％,对照组配偶HBsAg阳性率8．06％。结婚5年以上者HBsAg携带者配偶抗一HBc阳性率高于结婚5年以下者,差异有统计学意义（x。=4．88,P〈0．05）,其中女性HBsAg携带者配偶抗一HBc阳性率更为显著（xz=6．39,P〈O．05）。性生活不使用安全套的夫妻配偶HBsAg阳性率（15．56％）高于性生活使用安全套的配偶（8．82％）。16对HBsAg均阳性的夫妻中,8对PCR扩增HBV阳性,7对（87．50％）HBV基因型相同;其中5对HBV为B型,2对为C型,仅1对夫妻HBV基因型不同。结论HBsAg携带者配偶感染HBV风险比普通人群增高;在今后的成人乙肝防控工作中,需要加强对HBsAg携带者配偶HBV感染的监测及乙肝疫苗的接种,同时需要加强宣教,提倡安全性行为。     

肝脏内源性microRNA调控乙型肝炎病毒基因的表达与复制

目的探讨肝脏内源性microRNA对乙型肝炎病毒(HBV)复制与基因表达的影响。方法通过miRNA靶点分析软件寻找与HBV序列之间相关联的肝脏内源性microRNA,体外化学合成相应的microRNA分子,将合成寡核苷酸及对照与1.3倍HBV全基因组真核表达质粒pUC18-HBV1.3采用Lipofectamine2000共转染HepG2细胞,转染48h后收集细胞培养上清;通过ELISA检测HBsAg、HBeAg的表达水平;Western印迹检测HBcAg的表达水平;Trizol抽提转染细胞RNA,逆转录后用荧光定量PCR检测HBVmRNA的水平;提取细胞基因组DNA,Southern印迹检测HBV的复制中间体。经以上检测从HBV蛋白表达、转录和复制水平评价相应的microRNA作用效应。结果生物信息学方法提示miR-16和miR-122存在与HBV基因组作用的可能结合位点。经试验初步证实miR-16可下调HBV蛋白的表达及HBVDNA水平;miR-122可下调HBsAg、HBeAg的表达,上调HBVmRNA的水平。结论肝脏内源性microRNA可以调节HBV的复制与基因表达。     

Gene expression profile of transgenic mouse kidney reveals pathogenesis of hepatitis B virus associated nephropathy

Hepatitis B virus (HBV)-associated nephritis has been reported worldwide. Immune complex deposition has been accepted as its pathogenesis, although the association between the presence of local HBV DNA and viral antigen and the development of nephritis remains controversial. To understand better the roles played by HBV protein expression in the kidney, the global gene expression profile was studied in the kidney tissue of a lineage of HBV transgenic mouse (#59). The mice expressed HBsAg in serum, and HBsAg and HBcAg in liver and kidney, but without virus replication. Full-length HBV genome (adr subtype, C genotype) isolated from a chronic HBV carrier was used to establish the transgenic mice #59. Similarly manipulated mice that did not express HBV viral antigens served as controls. Southern blotting, hybridization with HBV probe, and immuno-histochemical staining were used to study HBV gene expression. mRNA extracted from the kidney tissue was analyzed using Affymetrix microarrays. HBsAg and HBcAg were located mainly in the cytoplasm of tubular epithelium. Altogether 520 genes were "up-regulated" more than twofold and 76 genes "down-regulated" more than twofold in the kidney. The complement activation, blood coagulation, and acute-phase response genes were markedly "up-regulated". Compared to the controls, the level of serum C3 protein was decreased in #59 mice, while the level of C3 protein from kidney extract was increased. Results indicate that expression of HBsAg and HBcAg in tubular epithelial cells of the kidney per se can up-regulate complement-mediated inflammatory gene pathways, in addition to immune complex formation.