转基因星形胶质细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠的研究

目的　评价酪氨酸羟化酶 (TH)基因转染的星形胶质细胞移植入帕金森病 (PD)模型大鼠脑内后对旋转行为改善作用。方法　用pcDNA3 1/TH质粒转染原代培养的星形胶质细胞 ,采用免疫组化及RT PCR方法检测到TH表达后 ,将转基因的星形胶质细胞移植入PD模型大鼠脑纹状体内 ,观察PD大鼠的旋转行为变化情况。结果　移植后共观察 12周 ,转基因细胞移植组PD大鼠 (n =10 )的旋转行为明显改善 (P <0 0 5 ) ,改善情况在 2～ 8周最显著 ,对照组大鼠 (n =10 )的旋转行为无变化。结论　转基因的星形胶质细胞脑内移植后可短期改善PD大鼠的旋转行为 ,星形胶质细胞有可能作为有效的载体细胞。     

酪氨酸羟化酶cDNA移植治疗帕金森病的实验研究

帕金森病(PD)的主要病因是黑质多巴胺能神经元损伤,表达的酪氨酸羟化酶(TH)减少。本文在应用6-羟多巴胺(6-OHDA)制备偏侧PD大鼠模型的前提下,首次将TH cDNA移植到PD大鼠纹状体内,模型动物的旋转行为明显改善,用免疫组化法及PCR法证实了外源性THcDNA可以进入脑细胞内,并表达出有生物活性的TH。     

帕金森病的分子生物学机制及基因治疗研究进展

随着分子克隆与基因重组技术的发展,基因治疗帕金森病已成为神经科学领域重要的研究方向。本文对帕金森病的分子生物学机制,基因治疗的方法,靶细胞的选用及其基因转染,移植后的疗效及存在的问题进行综述。     

外源性EGFP和TH基因修饰骨髓基质细胞源神经干细胞帕金森病猴模型脑内移植后的跟踪观察

目的评价外源性酪氨酸羟化酶(TH)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因修饰的骨髓基质细胞源神经干细胞(BMSCs-D-NSCs)在猴帕金森病(PD)模型脑内移植后长期存活情况及其功能评定。方法应用MPTP制成偏侧PD猴模型。将构建的pEGFP-hTH转染培养的自体BMSCs- D-NSCs,而后植入PD猴模型脑内,观察其行为学变化,并进行单光子发射计算机体层摄影术(多巴胺转运蛋白显像)和正电子发射计算机体层摄影术(葡萄精代谢显像)检查。用免疫组化法检测移植细胞的存活情况。结果成功构建pEGFP-hTH和pEGFP-C2转染的BMSCs-D-NSCs中TH和EGFP基因均有效表达;细胞移植后5个月PD猴症状仍有所改善。多巴胺转运蛋白显像见细胞移植组术侧纹状体平均标准摄取值低于对侧及健康猴,而高于PD猴术侧。葡萄糖代谢显像见细胞移植组术侧纹状体平均标准摄取值低于对侧及健康猴,而高于PD猴术侧,而细胞移植组间明显差异。免疫组化发现, 细胞移植术后5个月移植区仍存存大量TH、EGFP阳性细胞。结论 pEGFP-hTH和pEGFP-C2转染的BMSCs-D-NSCs存体外和体内均长期表达外源性TH、EGFP基因,基因工程细胞在PD猴脑内存活并发挥治疗作用。     

帕金森病的干细胞移植及其基因治疗研究进展

随着神经干细胞研究的发展以及分子生物学技术的进步，神经干细胞移植及基因治疗已成为帕金森病治疗的主要研究方向。本文回顾了帕金森病的治疗现状、移植神经干细胞的来源、相关的修复机制及神经干细胞联合基因治疗帕金森病的进展作一综述。     

转基因成肌细胞移植治疗帕金森病的实验研究

评价转基因成肌细胞移植治疗帕金森病（ＰＤ）的疗效。方法移植转酪氨酸羟化酶（ＴＨ）基因的成肌细胞（ｎ＝２４）和未经遗传修饰的成肌细胞（ｎ＝１０）于偏侧ＰＤ鼠损毁侧纹状体。用阿朴吗啡（ＡＰＯ）诱发旋转行为，反向聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＴＨ免疫组化检测ＴＨ基因的表达和ＴＨ蛋白的合成以及高效液相色谱仪－电化学检测器（ＨＰＬＣ－ＥＣＤ）检测纹状体多巴胺及代谢产物含量以此评估基因治疗的效果。结果治疗组移植治疗后ＡＰＯ诱发的旋转行为明显改善（Ｐ＜０．０１），且可持续１３个月，而对照组ＡＰＯ诱发的旋转行为无改善（Ｐ＞０．０５），应用ＲＴ－ＰＣＲ、ＴＨ免疫组化和ＨＰＬＣ－ＥＣＤ在治疗组移植部位检测到ＴＨ基因的表达、ＴＨ蛋白的合成和移植侧纹状体部多巴胺及其代谢产物含量增高。结论遗传修饰的成肌细胞能够在体内长时间、有效地表达ＴＨ，并改善ＰＤ鼠的病理行为，是ＰＤ基因治疗的合适靶细胞之一。     

脑内移植重组基因治疗帕金森病的实验研究

本研究把Ⅰ型人酪氨酸羟化酶（ｈｕｍａｎｔｙｒｏｓｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｔｙｐｅⅠ；ＨＴＨ１）ｃＤＮＡ连接到逆转录病毒载体ＬＮＳＸ上，构建成真核表达载体ＬＮＳＨＴＨ１，然后通过ｉｎｖｉｖｏ途径转染帕金森病模型鼠的纹状体细胞。外源的ＨＴＨ１基因在宿主脑内得到了表达，并使其病理行为改善约７０％。这种新的基因治疗帕金森病的方式，有其独特的优越性。     

GFP标记的TH基因在帕金森病大鼠脑内的表达

目的:探讨HTH_1基因治疗帕金森病的可能性。方法:以绿色荧光蛋白(GFP)作为标记,观察HTH_1基因在体外和脑内的表达。结果:构建同时表达GFP和HTH_1双基因的多基因表达载体GC-GFP-P-HTH_1-SN,并转染L-6TG细胞,移植入帕金森病模型大鼠纹状体内,用荧光显微镜、流式细胞仪、免疫组化、Western blotting等方法检测GFP、THT_1在体外和脑内均有表达。结论:本实验为外源基因表达产物的检测提供一个新方法。     

晚期糖基化终末产物受体对帕金森病模型小鼠脑内酪氨酸羟化酶表达的影响

目的探讨晚期糖基化终末产物受体(RAGE)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)模型小鼠脑中酪氨酸羟化酶(TH)表达量的影响。方法采用12周龄的C57BL/6雄性小鼠依据不同处理方法分为6组(均n=10):对照组;MPTP组;空载病毒阴性对照(RAGE-NC)组;目的基因阴性对照(siRNA-RAGE)组;RAGE-NC+MPTP组;siRNA-RAGE+MPTP组。携带空载siRNA的慢病毒(RAGE-NC)与携带抑制RAGE表达的目的 siRNA-RAGE慢病毒经脑立体定位仪定向注射于小鼠两侧黑质,根据分组情况给予腹腔注射MPTP 30mg·kg~(-1)或等量生理盐水(每周2次×5周)。5周后予小鼠断头取脑,利用免疫组织荧光染色法检测各组小鼠脑组织黑质中TH数量变化情况,采用Western blot法分别检测各组RAGE、caspase-3、TH蛋白表达水平。结果与RAGENC+MPTP组比较,siRNA-RAGE+MPTP组RAGE蛋白表达减少(0.782 8±0.139 6 vs 1.039 0±0.146 4,P0.01),caspase-3蛋白表达减少(0.864 4±0.105 3 vs 1.240 0±0.080 7,P0.001),TH蛋白表达量显著升高(1.114 0±0.201 1vs 0.771 1±0.211 3,P0.05),差异有统计学意义。结论抑制RAGE表达可抑制凋亡反应,提高PD多巴胺能神经元模型中TH蛋白表达水平,有潜在的神经保护作用。     

酪氨酸羟化酶与帕金森病

酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase ,TH)是脑内多巴胺 (dopamine ,DA)合成的限速酶 ,在以黑质纹状体DA系统功能不足为主要表现的帕金森病 (Parkinson’sdisease ,PD )中 ,TH不仅作为继发因素产生一系列异常改变 ,而且由于其可以产生活性氧类 (reactiveoxygenspecies ,ROS)并可为ROS攻击失活 ,故而可能是一个重要的原发因素直接参与了PD发病。这为PD与TH关系的研究提供了一个新的重要视点。     

帕金森病基因治疗的实验研究

帕金森病(PD)的主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元变性,表达的酪氨酸羟化酶(TH)减少或者活性降低。目前外源性多巴是最有效的抗PD药物,但常在数年后失去其有效的治疗作用。用胚胎脑细胞移植虽有效果,但胚胎脑来源困难。因此需要探索新的有效治疗方法。本研究将遗传修饰的成肌细胞植入偏侧PD鼠模型纹状体进行基因治疗。移植转TH基因的成肌细胞(治疗组,n=24)和未经遗传修饰的成肌细胞(对照组,n=10)于偏侧PD鼠损毁侧纹状体。用阿朴吗啡(APO)诱发旋转行为,RT-PCR、TH免疫组化检测TH基因的表达和TH蛋白的合成以及HPLC-ECD检测纹状体多巴胺及代谢产物含量以此评估基因治疗的效果。治疗组移植治疗后APO诱发的旋转行为明显改善(P<0.01),且可持续13个月,而对照组APO诱发的旋转行为无改善(P>0.05),应用RT-PCR、TH免疫组化和HPLC-ECD在治疗组移植部位检测到TH基因的表达、TH蛋白的合成和移植侧纹状体部多巴胺及其代谢产物含量增高。遗传修饰的成肌细胞能够在体内长时间、有效地表达TH,并改善PD鼠的病理行为,是PD基因治疗的合适靶细胞之一。     

基因修饰的神经干细胞脑内移植后TH表达和神经递质的变化

目的：探讨经TH基因修饰的神经干细胞脑内移植后，PD模型动物脑内TH表达和神经递质的变化。方法：构建pN2ATH逆转录病毒载体质粒，用PA317细胞包装，G418筛选阳性克隆，病毒上清感染神经干细胞，将神经干细胞和表达TH的神经干细胞植入PD大鼠纹状体内，观察移植后TH的表达情况以及DA和DOPAC含量变化。结果：TH基因修饰的神经干细胞移植2月内，TH在纹状体内的表达增加，纹状体DA和DOPAC含量增高，好于单纯神经干细胞移植组和对照组，但比正常水平低，结论：TH基因修饰的神经干细胞，脑内移植能增加纹状体内TH的表达以及DA和DOPAC含量，为其脑内移植治疗PD提供了理论基础。     

TH基因修饰细胞脑内移植治疗猴帕金森病的实验研究

目的 评价包囊化酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroylase,TH）基因修饰的基因工程细胞脑内移植治疗帕金森病的疗效。方法 将pcDNA3/hTH质粒转染人神经母细胞瘤细胞系SYTY细胞，筛选出阳性克隆，微包囊化处理后的含有TH基因修饰细胞植入PD猴模型脑内，观察其行为、CSF中DA含量的变化，用免疫组化法检查移植细胞的存活情况。结果 （1）pcDNA3/hTH基因经亚克隆，提取纯化的质粒，经ECORI酶切后产生1.9Kb和5.5Kb的片段。转基因后的SY5Y细胞免疫细胞化学染色显示TH染色强阳性；（2）移植后PD猴症状明显改善，脑脊液中DA含量升高；（3）SABC免疫组化发现移植区存在大量TH阳／性细胞。结论 构建的TH基因工程细胞体外和体内均表达人类TH基因；微包囊化处理后的基因工程细胞在PD猴脑内存活并发挥治疗作用。     

甲氰菊酯联合多巴胺对小鼠多巴胺能神经通路的影响

目的 观察甲氰菊酯(Fenpropathrin,Fen)单独腹腔注射及与多巴胺(Dopamine,DA)立体定向注射联合使用对C57BL小鼠黑质纹状体多巴胺能神经通路的影响。方法 分别采用Fen腹腔注射、DA立体定向注射至纹状体及DA预处理联合Fen注射建立C57BL小鼠模型,观察小鼠行为学变化,HPLC检测脑组织内Fen的含量; 激光共聚焦显微镜观察小鼠的黑质多巴胺能神经元及纹状体的TH染色。结果 Fen及DA分别单独使用及DA预处理联合Fen注射均造成小鼠自主活动能力减少,HPLC检测显示小鼠脑组织中Fen的浓度与腹腔Fen给药浓度成正比,TH染色发现Fen连续使用7 d和DA立体定向注射后第7 d的小鼠黑质均出现神经元中TH表达不均一,并且纹状体出现斑片状的TH染色丢失,其中DA预处理后使用Fen注射7 d组改变最明显。结论 Fen能够透过小鼠血脑屏障,可以直接作用于小鼠黑质纹状体多巴胺能系统,并且可以明显增强DA对黑质纹状体的损伤作用。     

Olfactory ensheathing cell transplantation restores functional deficits in rat model of Parkinson's disease: a cotransplantation approach with fetal ventral mesencephalic cells

Different strategies have been worked out to promote survival of transplanted fetal ventral mesencephalic cells (VMCs) using trophic and nontrophic support. Olfactory ensheathing cells (OECs) express high level of growth factors including NGF, bFGF, GDNF, and NT3, which are known to play important role in functional restoration or neurodegeneration. In the present investigation, an attempt has been made to study functional restoration in 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) following cotransplantation of VMC and OECs (cultured from olfactory bulb, OB) in striatal region. The functional restoration was assessed using neurobehavioral, neurochemical, and immunohistochemical approach. At 12 weeks, post-transplantation, a significant recovery (P < 0.001) in -amphetamine induced circling behavior (73%), and spontaneous locomotor activity (SLA, 81%) was evident in cotransplanted animals when compared with 6-OHDA-lesioned animals. A significant restoration (P < 0.001) in [³H]-spiperone binding (77%), dopamine (DA) (82%) and 3,4-dihydroxy phenyl acetic acid (DOPAC) level (75%) was observed in animals cotransplanted with OECs and VMC in comparison to lesioned animals. A significantly high expression and quantification of tyrosine hydroxylase (TH)-positive cells in cotransplanted animals further confirmed the supportive role of OECs in viability of transplanted dopaminergic cells, which in turn may be helping in functional restoration. This was further substantiated by our observation of enhanced TH immunoreactivity and differentiation in VMC cocultured with OECs under in vitro conditions as compared to VMC alone cultures. The results suggest that cotransplantation of OECs and VMC may be a better approach for functional restoration in 6-OHDA-induced rat model of Parkinson's disease.     

丘脑底核高频电刺激对大鼠纹状体多巴胺代谢影响的研究

目的研究丘脑底核(STN)高频电刺激(HFS)对大鼠纹状体多巴胺(DA)代谢的影响。方法给予正常大鼠一侧STN-HFS,应用微透析观察其对纹状体DA及其代谢产物的影响,应用免疫组化观察其对黑质DA能神经元的影响。结果微透析检测发现刺激侧纹状体DA代谢产物明显增高(P<0.05),DA水平无变化(P>0.05);免疫组化检测发现刺激组和对照组酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量无差异(损毁侧分别为24.00±6.81、23.43±5.49,P>0.05)。结论STN-HFS可能通过影响黑质-纹状体DA代谢发挥作用,STN-HFS对黑质DA能神经元可能无保护作用。     

Ablation of the subthalamic nucleus protects dopaminergic phenotype but not cell survival in a rat model of Parkinson's disease

Inhibition or ablation of the hyperactive subthalamic nucleus (STN) in Parkinson's disease (PD) does not only reverse motor deficits, silencing the glutamatergic output of the subthalamic nucleus, but has also been implicated to have neuroprotective effects on nigral neurons in animal models of Parkinson's disease. Ablation of the subthalamic nucleus has been shown to increase the number of tyrosinhydroxylase-immunopositive cells and partially restores behavioral deficits in animal models of Parkinson's disease. However, it is unclear whether subthalamic nucleus ablation indeed prevents cell death or whether the effect is due to the rescue of the dopaminergic (DA) phenotype of impaired cells by upregulating tyrosine hydroxylase (TH). We therefore investigated the potential neuroprotective effects of a preceding subthalamic nucleus lesion on 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-induced nigral cell death and compared the retrograde tracer fluorogold (FG) as a marker of cell survival with tyrosinhydroxylase immunoreactivity as a marker of the dopaminergic phenotype. In the present study, we show that ablation of the subthalamic nucleus does not affect the number of fluorogold-labeled cells but increases the number of tyrosinhydroxylase-positive neurons in subthalamic nucleus-lesioned hemiparkinsonian animals and leads to partial behavioral recovery of the rats.We conclude that subthalamic nucleus ablation exerts neuroprotective properties on the dopaminergic nigrostriatal pathway against 6-hydroxydopamine toxicity in terms of rescuing the neurotransmitter phenotype in the remaining neurons rather than enhancing the total number of nigral cells.