DNA甲基转移酶3b对乳腺癌细胞微小RNA表达的影响

目的 通过DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)与siRNA干扰改变乳腺癌细胞MCF-7中DNA甲基化水平,探讨DNA甲基转移酶3b(Dnmt3b)表达对乳腺癌细胞相关mRNA、微小RNA(miRNA)的影响.方法 通过5-Aza-CdR抑制乳腺癌细胞整体甲基化水平,免疫荧光染色检测其抑制...     

DNA甲基转移酶3b催化区保守序列shRNA真核表达载体构建

目的构建针对基因DNA甲基转移酶3bmRNA催化区保守序列的shRNA真核表达载体,并对其克隆进行鉴定。方法以DNMT3bmRNA序列为靶基因设计3条shRNA和一条阴性对照HK,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体PGensil-1中,构建真核表达载体P-DNMT3b-shRNA1、P-DNMT3b-shRNA2、P-DNMT3b-shRNA3、P-HK。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,接种于LB平板后分别挑取5个单克隆菌落进行扩增,经筛选后对提取质粒进行测序鉴定。结果重组质粒经SalI酶切鉴定得到大小2个基因片段,大片段约为4．55kb,小片段约为440bp,与设计相同;四组重组质粒经测序鉴定显示插入完全正确。结论成功构建了P-DNMT3b-shRNA（1、2、3）及HK真核表达载体,为下一步实验奠定了基础。     

宫颈癌组织中DNA甲基转移酶1、3A和3B mRNA的表达

目的探讨DNA甲基转移酶1、3A和3B在宫颈癌发生发展中的作用。方法应用real-time PCR技术检测10例宫颈癌、10例宫颈上皮内瘤变和10例正常宫颈组织DNMT1、3A和3BmRNA的表达。结果宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 1mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是0.30±0.1、0.26±0.12和0.10±0.04,宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 1表达有显著差异（P〈0.05）;宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT3A mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是0.94±0.27、0.51±0.24和0.13±0.04,三组相比较有显著性差异（P〈0.05）;宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 3B mRNA对GAPDH mR-NA的相对丰度值分别是0.30±0.09、0.28±0.11和0.11±0.04,宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 3B表达有显著差异（P〈0.05）。结论 DNMT1、3A和3B参与了宫颈癌的发生,并在宫颈上皮内瘤变时就已经起了一定作用。     

DNA甲基化转移酶3B基因和多巴胺D1受体基因交互作用与精神分裂症的关系

目的 探讨DNA甲基化转移酶3B(DNMT3B)基因与多巴胺D1受体(DRD1)基因交互作用对精神分裂症患病风险的影响.方法 选取DNMT3B基因2个标签SNP(rs2424908和rs6119954)以及DRD1基因5个标签SNP(rs4532、rs5326、rs2168631、rs6882300和rs267418),采用TaqMan探针SNP基因分型技术对365例精神分裂症患者和365名健康对照者进行检测,使用多因子降维法软件(MDR)分析基因-基因交互作用.结果 DNMT3B基因rs6119954位点基因型分布在患者组与对照组之间差异有统计学意义(χ2=8.06,P=0.018);MDR分析结果显示DNMT3B与DRD1基因相互作用存在于两位点模型(rs6119954-rs267418)(OR=1.79,95%CI:1.29～2.47;χ2=12.51,P=0.0004),三位点模型(rs6119954-rs5326-rs267418)(OR=2.36,95%CI:1.73～3.22;χ2=29.33,P＜0.0001)以及四位点模型(rs2424908-rs6119954-rs5326-rs267418)(OR=3.08,95% CI:2.24～4.24;χ2=48.88,P＜0.0001).结论 DNMT3B与DRD1基因存在交互作用,并可能增加精神分裂症的发病风险.     

DNA甲基转移酶3b基因在肝外胆管癌组织中的表达

目的：研究DNA甲基转移酶3b( DNMT3b)在人肝外胆管癌组织中的表达情况,并分析DNMT3b的表达与胆管癌临床病理因素之间的关系,探讨其在胆管癌发生发展过程中的作用。方法：用免疫组织化学法检测DNMT3b在24例人肝外胆管癌组织和20例慢性胆管炎组织中的阳性细胞表达率,将二者进行对比并分析其与胆管癌临床病理之间的...     

人DNA甲基化转移酶3B1真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建人DNA甲基化转移酶3B1(DNMT3B1)真核表达载体pCMV-DNMT3B1.方法:根据Genebank中人DNMT3B1 cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT 3B1,并将扩增产物克隆到真核表达载体pCMV-2B中.结果:PCR扩增得到人DNMT3B1的cDNA片段大小为2.6 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCMV-DNMT3B1.结论:成功构建了人DNMT3B1真核表达载体,为进一步研究DNMT3B1提供了条件.     

DNMT1和DNMT3b基因在人膀胱癌组织和细胞中的表达及意义

目的 探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)和DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)在人膀胱癌组织和人膀胱癌细胞系BIU-87中的表达及意义.方法 用免疫组织化学法分别检测DNMT1和DNMT3b蛋白在24例膀胱癌组织和10例正常膀胱组织中的阳性表达率;用RT-PCR和Western blot分别检测DNMT1和DNMT3b基因在人膀胱癌细胞系BIU-87中mRNA表达水平和蛋白表达水平.结果 在24例膀胱癌组织中,DNMT1阳性表达率为(75.29±2.51)%,而在10例正常膀胱组织中的阳性表达率为(12.61±1.57)%,二者之间的差异具有显著性意义(P<0.05);DNMT3b在24例膀胱癌组织中的阳性表达率为(70.91±2.86)%,在10例正常膀胱组织中的阳性表达率仅为(10.16±1.22)%,二者差异亦具有显著性意义(P<0.05);在人膀胱癌细胞系BIU-87中,通过RT-PCR和Western blot均检测到DNMT1和DNMT3b基因mRNA和蛋白的表达.结论 在膀胱癌组织中,DNMT1和DNMT3b蛋白的表达较正常膀胱组织明显增加,说明DNMT1和DNMT3b的高表达可能与膀胱癌的发生发展有关;DNMT1和DNMT3b在人膀胱癌细胞系BIU-87中存在表达.     

DNA甲基化在热休克诱导细胞周期素D1表达水平降低中的转录调控机制

目的研究DNA甲基化在热休克诱导的人细胞周期素D1基因启动子活性下降调控中的作用。方法 DNA甲基化通过甲基化特异性PCR方法检测。甲基化位点突变采用Stratagene公司定点突变试剂盒。甲基化位点的作用通过报告基因技术分析启动子活性确认。结果热休克处理可能造成细胞周期素D1基因启动子+65/67位点发生DNA甲基化,而突变该位点逆转了由报告基因活性分析研究的热休克效应。结论启动子+65/67位点的DNA甲基化可能调控细胞周期素D1的热休克效应。     

子宫颈部肿瘤中DNA甲基化转移酶-1表达和P16/MGMT基因启动子甲基化的临床意义

目的 探讨子宫颈部肿瘤中Dnmt-1（DNA甲基化转移酶-1）表达和P16／MGMT基因启动子甲基化的临床意义。方法 用MS—PCR．（Methylation Specific—PCR．）和免疫组织化学染色方法研究Dnmt-1蛋白和P16／MGMT基因启动子甲基化在117例子宫颈部良、恶性病变组织中的表达意义。结果 Dnmt-1在浸润性鳞状上皮癌和腺癌中的表达明显高于慢性宫颈炎和宫颈上皮内瘤变。P16／MGMT基因启动区在慢性宫颈炎中全部表现为非甲基化，而在宫颈上皮内瘤变、浸润性鳞状上皮癌和腺癌中则表现为很高的异常甲基化水平。在子宫颈腺癌中，P16／MGMT基因启动子甲基化率在Dnmt-1表达阳性组明显高于Dnmt-1表达阴性组。结论 Dnmt-1蛋白表达和P16／MGMT基因启动子甲基化在宫颈癌进展过程中的早期就起着非常重要的作用．而且Dnmt-1蛋白表达和P16／MGMT甲基化检测对于恶性肿瘤的诊断有着重要的辅助意义。     

Wip-1基因在子宫内膜癌组织中的表达及其与细胞凋亡的关系研究

目的 探讨野生型p53诱导磷酸酶1(Wip-1)基因在子宫内膜癌组织中的表达及与细胞凋亡的关系.方法 选取子宫内膜癌患者68例,子宫内膜不典型增生患者30例,并留取正常子宫内膜组织标本40份.培养子宫内膜癌细胞系ECC-1(ER阳性)和KLE(ER阴性),将细胞分为Wip-1 siRNA组、siRNA对照组和空白对照组.利用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测不同组织及不同转染组细胞中Wip-1基因表达,四甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测不同处理组细胞增殖能力,An-nexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)双染色检测不同处理组细胞凋亡及细胞周期.结果 子宫内膜癌组织中Wip-1mRNA表达水平(2.37士0.16)高于子宫内膜不典型增生组织(1.59士0.14)和正常子宫内膜组织(1.14士0.12),且子宫内膜不典型增生组织高于正常子宫内膜组织,差异均有统计学意义(P＜0.01);子宫内膜癌组织中Wip-1 mRNA表达水平与病理分期、病理分级、淋巴结转移、p53有关(P＜0.01);Wip-1 siRNA组ECC-1细胞和KLE细胞在转染后24、48、96 h细胞存活率均低于siR-NA对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05);Wip-1 siRNA组ECC-1细胞和KLE细胞Go+G1期比例均高于siR-NA对照组和空白对照组,而S期和G2 +M期比例均低于siRNA对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.01);Wip-1siRNA组ECC-1细胞和KLE细胞凋亡率均高于siRNA对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(P＜o.05).结论 Wip-1基因参与了子宫内膜癌细胞增殖和凋亡过程.     

肝癌临床发展与cyclin D1表达DNA含量及细胞凋亡发生的关系

Cyclin D1基因是近年来提出的重要原癌基因,其基因表达产物在细胞周期关键限速点G1-S转换中起重要正调控作用[1].此外,细胞凋亡的发生及细胞增殖在肝癌的发生发展中也起重要作用[2,3].本研究通过检测cyclin D1表达、细胞凋亡发生和细胞DNA含量,探讨三者与肝癌临床分期之间的关系,为寻找对临床有价值的肿瘤标记物和预后判断提供帮助.     

细胞周期素D1shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建针对细胞周期素D1(cyclinD1,由CCND1基因编码)的shRNA表达载体,筛选出有效序列,观察其对肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 设计针对cyclin D1基因编码区的3条寡核苷酸链,体外退火后克隆入干扰栽体Pgenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.以脂质体法将空载体Pgenesil-1-K和3个重组质粒Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13分别导人549肺腺癌细胞,48 h后用Real time PCK和Western blotting技术检测各实验组肺腺癌细胞内cycli D1 mRNA及蛋白的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期观察构建的载体对A549细胞增殖的影响.结果 经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的 基因片断.转染cyclin D1-shRNA的A549细胞48 h后测定cyclin D1 mRNA和蛋白含量.以Pgenesil-1-CCND13抑制cyclin D1 mRNA及蛋白表达效果最为有效.其抑制率分别为62%和60%,而且它能抑制A549细胞的增殖.结论 成功构建了针对cyclin D1的RNA干扰表达载体Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13,Pgenesil-1-CCND13能有效抑制cyclin D1在A549细胞中的表达,并抑制A549的增殖,为进一步应用于肺腺癌的治疗实验研究奠定了基础.     

细胞周期调控因子p27、Cyclin D1和DNA含量在食管癌中联合检测的意义

目的探讨食管癌中CyclinD1、p27的表达及与DNA含量联合测定的意义及相互关系。方法收集食管癌组织及癌周正常组织标本,应用免疫组织化学检测CyclinD1、p27蛋白表达,应用流式细胞术检测DNA含量。结果食管癌组织中CyclinD1和p27蛋白表达阳性率分别为45.8%和33.3%,CyclinD1表达阳性组的DNA含量显著高于CyclinD1表达阴性组分别为(1.54±0.21)和(1.08±0.43),(P<0.05),而p27表达阳性组的DNA含量和SPF值低于p27蛋白表达阴性组分别为(1.10±0.19),(5.56±5.18)%和(1.66±0.28),(19.78±6.12)%,(P<0.05)。结论CyclinD1、p27蛋白与食管癌的发生、发展有关,检测CyclinD1、p27及DNA含量可作为诊断和评估食管癌恶性程度的重要指标.     

子宫内膜癌中DNA甲基转移酶3B的表达特点与临床意义

目的：探讨子宫内膜癌中DNA甲基转移酶3B（DNA methyltransferase 3B, DNMT3B）的表达特点、与雌激素受体（estrogen receptor,ER）和孕激素受体（progesterone receptor,PR）的相关性及意义。方法：免疫组织化学法检测DNMT3B、ER、PR在104例子宫内膜癌组织中的表达并与临床病理特点及预后相对照。结果：104例子宫内膜癌组织中DNMT3B阳性率为50%,Ⅰ型内膜癌（内膜样癌）中DNMT3B过表达率（54.8%）显著高于Ⅱ型内膜癌（30.0%,P=0.028）,且Ⅰ型内膜癌中,随肿瘤分化变差,DNMT3B阳性率增加（1级、2级、3级分别为43.3%、51.3%、86.7%）,差异有统计学意义（P=0.019）。DNMT3B在肌层侵犯程度重、存在脉管癌栓、淋巴结转移及分期晚的病例中过表达率更高,DNMT3B过表达的患者组预后更差,但差异未见统计学意义（P>0.05）。Ⅰ型内膜癌DNMT3B与ER、PR表达呈负相关,ER、PR阴性组DNMT3B过表达率（78.9%、86.7%）高于ER、PR阳性组DNMT3B过表达率（47.7%、47.8%）,差异有统计学意义（P=0.016,P=0.006）;ER、PR均阴性时,DNMT3B过表达率最高（92.9%）,差异有统计学意义（P=0.002）。Ⅱ型内膜癌中DNMT3B与ER、PR表达未见相关性（P>0.05）。序列分析显示,DNMT3B基因启动子区有多个ER、PR结合位点。结论：内膜样癌与非内膜样癌中DNMT3B表达特点不同,DNMT3B过表达有可能作为预后或预测因子而辅助病理诊断和生物学行为评估。Ⅰ/Ⅱ型子宫内膜癌的甲基化特点可能不同,Ⅰ型内膜癌中DNMT3B过表达与ER、PR表达呈负相关,Ⅱ型内膜癌中DNMT3B表达与ER、PR表达关系不大。     

反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体联合转染对人胆管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体对人胆管癌细胞株QBC-939的增殖能力和细胞凋亡的影响。方法分别构建反义DNMT1基因和反义DNMT3b基因真核表达载体,脂质体介导法将二者先后转染入QBC-939,经G418筛选和荧光细胞克隆挑选得到稳定转染细胞株,并用Western blot检测转染前后的蛋白表达变化;用MTT法和软琼脂克隆形成试验观察各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞生长周期及凋亡率的变化。结果Western blot检测证实转染反义基因能使相应蛋白表达水平降低;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因能影响QBC-939的生长曲线,使细胞增殖减慢,并以前者为甚;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因的细胞克隆形成率分别为(6.78±0.89)%和(14.86±2.13)%,明显低于未转染组;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC-939的细胞周期,使之阻滞于G1期,细胞凋亡率从(1.63±0.27)%分别增加到(18.47±1.46)%和(6.19±0.78)%;在上述效应检测中,单独转染反义DNMT3b基因实验组对QBC-939细胞的生长无明显影响。结论通过联合转染反义DNMT1和DNMT3b基因真核表达载体,能抑制胆管癌细胞的生长和增殖,并促进凋亡的发生,其效果明显优于单独转染DNMT1反义基因;在DNA甲基化的过程中,DNMT1起着主要的作用,DNMT3b扮演着协同的角色,二者通过甲基化途径对胆管癌的发生发挥作用。     

DNMT1靶向RNAi重组体对胃癌细胞周期的影响

目的 :本研究利用RNA干扰 (RNAinterfering ,RNAi)技术 ,以DNMT1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因 ,设计构建重组体 ,研究其对胃癌细胞周期的影响。方法 :设计有小发夹结构的两条DNA序列 ,经退火成互补双链 ,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体 ,经鉴定正确后 ,转染胃癌细胞AGS ,最后使用流式细胞仪分析细胞周期。结果 :转染后的胃癌细胞的S期细胞较前有明显减少 ,G2 -M期细胞明显增多。结论 :DNMT1靶向RNA干扰重组体转染到胃癌细胞中后促使S期细胞进入G2 -M期 ,最后衰老死亡。从而为肿瘤的治疗开辟了新途径。     

DNMT1与UHRF1基因在胃癌细胞系中的表达特点及其与癌细胞DNA甲基化的关系

[目的]探讨DNMT1和UHRF1在胃癌的形成和转化中的表达特点和可能的生物学作用。[方法]提取CIMP型H（High）的胃癌细胞系HGC-27和CIMP型为L（10w）的胃癌细胞系MGC803,BGC823及AGS的核酸样品进行UHRF1和DNMT1表达的分析。[结果]DNMT1在MGC823和HGC-27表达水平明显高于其他胃癌细胞系（P〈0．01）;UHRF1在HGC-27中有表达水平高于其他3个胃癌细胞系（P〈0．01）。[结论]胃癌细胞DNA的甲基化不但和DNMT1有关而且和UHRF1也有着密切关系。     

特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因SiRNA表达载体的构建、鉴定及对高糖状态下INS-1细胞周期的影响

目的 构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响.方法 根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至INS-1细胞中,Westernblotting观察PTH1R表达,鉴定其转染效率,筛选出最佳抑制基因后,应用流式细胞仪检测25mmol/LD-葡萄糖处理INS-1细胞周期.结果 菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确.并能成功转染到INS-1细胞株中,Westernblot筛选最佳抑制基因.细胞周期检测提示PTHIR沉默后抑制INS-1细胞从G0/G1期进入S期.结论 成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,高糖状态下PTH1R表达可能为INS-1细胞自我保护的一种作用.     

SiRNA真核表达载体阻断HeLa细胞stathmin基因表达研究

目的：构建人stathmin基困的siRNA真核表达载体,探讨其对HeLa细胞中stathmin基因表达的干涉作用．方法：将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4．1-CMV neo真核表达载体,酶切及测序鉴定．脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选后RT—PCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果．结果：经酶切及测序鉴定,成功构建siRNA真核表达载体＋经脂质体转染HeLa细胞后,RT—PCR显示所构建的干涉stathmin基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达,HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低．结论：成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer—S1和pSilencer—S2,并在HeLa细胞中有效地发挥了对stathmin基因表达的干涉作用．