mMIP-1α-DT390重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达研究

目的 构建小鼠MIP-1α(mMIP-1α)基因和白喉杆菌外毒素DT390基因的真核融合表达载体,并对其功能进行初步研究.方法 通过RT-PCR获得mMIP-1α基因,插入含DT390基因的真核质粒SRα,获得真核表达载体SRα-mMIP-1α-DT390.重组载体经PCR、限制性内切酶酶切及DNA序列测定鉴定,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测目的蛋白的表达,并利用转染NIH3T3细胞后的培养上清体外测定mMIP-1α-DT390融合蛋白的选择性细胞毒活性.结果 成功构建真核表达质粒SRα-mMIP-1α-DT390,mMIP-1α-DT390融合蛋白可在NIH3T3细胞株中正确表达,细胞转染上清对小鼠活化T淋巴细胞具有较强的细胞抑制效应.结论 mMIP-1α-DT390融合基因真核表达载体的获得及功能的部分研究为进一步研究其抗炎效果和临床应用奠定基础.     

人类可溶性TNFR Ⅰ-GFP融合蛋白重组体的构建、表达和特性分析

目的构建并表达hsTNFR Ⅰ(human solubletumor necrosisfactor receptor Ⅰ)-GFP(green fluorescence protein)-pET28a融合蛋白,用以检测跨膜型TNF-α(mTNF-α).方法用PCR从GFP-pKEN重组质粒中扩增GFP的cD-NA,将其插入hsTNFR Ⅰ-pET28a重组质粒中hsTNFR Ⅰ基因片段的下游,获得hsTNFR Ⅰ-GFP-pET28a重组体.转化大肠杆菌BL-21,用IPTG诱导重组蛋白表达,经镍金属螯合层析柱纯化.用MTT法检测重组融合蛋白对sTNF-α细胞毒效应的抑制活性,并用重组融合蛋白直接对转染TNF基因细胞表面的mTNF-α进行定性检测.结果hsTNFR Ⅰ-GFP重组融合蛋白可明显抑制sTNF-α细胞毒效应,且呈剂量依赖性;该融合蛋白不但可与NIH3T3细胞膜上鼠源性mTNF-α结合,而且也可与转基因NIH3T3细胞表面人mTNF-α结合.结论hsTNFR Ⅰ-GFP重组融合蛋白具有TN-FR的生物学活性,同时保留GFP的发光特性,可用来检测细胞表达mTNF-α的水平.     

Nogo-66受体LRR功能区的真核分泌表达

目的: 构建含有人Nogo-66受体LRR功能区段cDNA序列的真核分泌型表达载体,并在COS-7细胞中表达. 方法: 采用定向克隆的策略,在保证阅读框正确的前提下,从原核表达载体pES-His/LRR上切下编码LRR的DNA片段,亚克隆入真核分泌型表达载体pSectag2B中,构建LRR与c-Myc表位、6His标签基因相融合的真核表达质粒pSectag2B/LRR,在Lipofectamine 2000介导下瞬时转染COS-7细胞. 结果: 利用针对c-Myc表位和6His标签的抗体分别作免疫荧光和Westernblot,证实胞内表达正确融合的目的蛋白;同时双抗体夹心ELISA也检测到转染细胞上清中存在融合蛋白. 结论: 真核表达质粒构建成功,转染后目的蛋白在COS-7细胞中实现分泌表达.     

TGFB1抑制A549细胞增殖的分子机制研究

①目的 构建并鉴定TGFB1真核表达载体pcDNA3.1/TGFB1,探讨TGFB1抑制A549细胞增殖的可能机制.②方法 采用基因重组技术将TGFB1 CDS 插入真核表达载体pcDNA3.1 (+),构建TGFB1真核表达质粒.脂质体介导转染肺癌细胞A549,分为正常对照、空质粒及转染组.MTT和集落形成实验检测各组细胞活性和细胞增殖能力.Real-time- PCR及Western blot方法 检测各组中TGFB1、p53、Bax和Fas的mRNA和蛋白的表达水平.③结果 酶切和测序结果 证实TGFB1真核表达质粒构建成功.MTT和集落形成实验结果 显示pcDNA3.1/TGFB1转染组、细胞活性和细胞增殖能力明显降低(P<0.01).pcDNA3.1/TGFB1转染组与正常对照组、空质粒组比较:TGFB1、p53、Bax和Fas mRNA表达显著增加(P<0.01);TGFB1、p53、Bax和Fas蛋白的表达水平显著增加(P<0.01).④结论 TGFB1可能通过上调p53、Bax和Fas蛋白的表达抑制肺癌细胞A549的增殖.TGFB1有可能成为肿瘤生物治疗的靶点.     

核转运抑制肽表达载体的构建及对HeLa细胞增殖、迁移的影响

目的 构建核转运抑制肽与红色荧光蛋白(RFP)的融合表达载体,探讨该融合蛋白在HeLa细胞中的表达、定位以及对细胞增殖、迁移的影响。方法 分别合成编码两种核转运抑制肽Bimax1和Bimax2的多核苷酸,退火后插入红色荧光蛋白表达载体pDs-Red-C1;质粒转化大肠杆菌DH-5α,挑取阳性菌进行DNA测序;利用脂质体转染法将重组载体pDs-Red-Bimax1、pDs-Red-Bimax2及空白载体转入HeLa细胞中,荧光显微镜观察红色荧光的表达与定位;MTT实验和细胞迁移实验检测融合蛋白表达对细胞增殖、迁移的影响。结果 DNA测序显示,两种核转运抑制肽Bimax1和Bimax2成功插入红色荧光蛋白表达载体;转染真核细胞后Bimax1和Bimax2引导红色荧光蛋白在细胞核表达;同时,融合蛋白RFP-Bimax1和RFP-Bimax2对HeLa细胞的增殖、迁移有抑制作用。结论 成功构建核转运特异性抑制肽与红色荧光蛋白融合表达的载体,融合蛋白在细胞核局限表达并能抑制肿瘤细胞的增殖、迁移。     

髓系细胞触发受体-1真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建髓系细胞触发受体-1(TREM-1)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从人外周血总RNA中扩增TREM-1 基因的全长cDNA,插入克隆载体pUCm-T,BamH I和Pst I,酶切后将目的片段插入真核表达载体pEGFP-C3,构建含有TREM-1的重组质粒pEGFP-TREM-1,转染293细胞,用荧光显微镜观察、Western-blot鉴定蛋白表达.将pEGFP-TREM-1重组质粒转染THP-1细胞,100 ng/ml LPS刺激24 h后,半定量RT-PCR检测TNF-α和IL-1β基因的 mRNA水平.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为TREM-1基因;经转染的293细胞在荧光显微镜下可见荧光,并能表达TREM-1蛋白;重组TREM-1蛋白具有生物学活性,能增强TNF-α和IL-1β基因的mRNA水平.结论:成功构建了能够表达TREM-1的真核表达质粒pEGFP-C3-TREM-1,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础.     

EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能

目的: 构建EB病毒核心抗原2(EBNA2)的真核表达载体,在真核细胞中表达,并检测其表达产物的功能.方法: 应用DNA重组和PCR方法从质粒pSG5-EBNA2中亚克隆EBNA2的编码基因,插入到真核表达载体pCMV-HA中.应用脂质体的方法将重组质粒pCMV-EBNA2瞬时转染Cos-7细胞,通过Western blot和免疫荧光方法检测EBNA2的表达.应用荧光素酶报告实验检测EBNA2蛋白的活性.结果:克隆EBNA2的编码基因,经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致.以含有EBNA2编码基因的真核表达载体瞬时转染Cos-7细胞,EBNA2基因的表达产物通过Western blot和免疫荧光方法得到证实.荧光素酶报告实验显示所表达的蛋白具有转录激活活性.结论:成功构建EBNA2的真核表达载体,证实其在真核细胞Cos-7可以表达,并具有转录激活功能.     

汉坦病毒H8205株IL-2/G1融合基因在Vero细胞中的稳定表达

目的 探讨外源性IL-2／G1融合基因在非洲绿猴肾细胞(Vero)获得稳定表达的可行性,为汉坦病毒基因工程疫苗的研制提供一定的实验基础。方法将汉坦病毒H8205株G1的cDNA重组人源IL-2基因后克隆到真核表达载体pcDNA3．1／His,形成重组真核表达质粒pcDNA3．1／His-IL-2-G1,在脂质体介导下,将其导入Vero细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,并继续培养6周,然后通过间接免疫荧光、ELSIA、SDS-PAGE电泳等方法检测IL-2-G1基因在Vero细胞中的稳定表达情况。结果成功构建重组质粒pcDNA3．1／His-IL-2-G1,其片段插入方向正确。经间接免疫荧光和SDS-PAGE电泳证实,转染了真核表达质粒pcDNA31／His-IL-2-G1后在Vero细胞培养上清和胞浆中有融合蛋白的表达,其相对分子量为78000u,与预期的相符合。经人IL-2 ELISA检测试剂盒检测证实在培养上清和细胞裂解物所表达的融合蛋白有IL-2特性。结论在脂质体介导下,外源性IL-2／G1融合基因能够成功导入Vero细胞并获得稳定表达。     

IL-18-PE38真核表达质粒的构建及表达

目的 构建含有白细胞介素18(Interleukin 18,IL-18)及毒素融合基因的真核表达质粒,并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况.方法 通过分子克隆技术,将IL-18-PE38(Pseudomonas exotoxin A)融合基因插入真核表达载体Psec Tag 2B中,构建真核表达质粒Psec Tag 2B-IL-18-PE38,重组质粒经限制性内切酶及PCR测定证实构建成功后,用脂质体介导法将其转染小鼠NIH3T3细胞中,然后用免疫荧光技术鉴定其表达.结果 经酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因已被正确地插入真核表达载体Psec Tag 2B中.荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在其中表达.结论 成功构建了重组的真核表达载体Psec Tag 2B-IL-18-PE38并在体外细胞株获得表达,为下一步动物实验打下基础.     

小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用

目的构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达载体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术（SOE—PCR）将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）获得重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,最后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性。结论本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础。     

Protective effect of human CD40-Ig fusion protein in a murine model of acute graft-versus-host disease

目的在小鼠GVHD模型中研究利用人CD40-Ig阻断CD40/CD40L相互作用的保护性效果.方法将人CD40基因胞外区插入含有人IgG1 Fc段基因的pIG1载体中,构建携带CD40-Fc融合基因的瞬时表达载体转染COS-7细胞,ELISA法检测CD40-Ig融合蛋白的表达.再将CD40-Fc融合基因连接入pcDNA3.1的相应位点构建稳定表达载体转染CHO细胞,利用Protein A亲和层析法纯化融合蛋白.SDS-PAGE、Western blot和配基结合实验鉴定CD40-Ig的性质.将C57BL6/J(H-2b)小鼠的脾细胞经尾静脉注射入亚致死剂量照射的BALB/c(H-2d)小鼠体内建立急性GVHD模型,通过体内注射CD40-Ig融合蛋白评价其对急性GVHD小鼠的保护效果.结果按上述方法分别构建了哺乳动物表达载体pIG/40Ig和p3.1/40Ig.ELISA 和Western blot确定在COS-7和CHO细胞中表达了CD40-Ig融合蛋白.SDS-PAGE结果显示该蛋白具有通过二硫键结合的二聚体结构并以同源二聚体的形式存在.纯化的CD40-Ig可与CD40L结合.体内应用CD40-Ig融合蛋白治疗可延缓小鼠GVHD病情发展并显著延长小鼠的平均存活时间.结论我们的结果证明CD40/CD40L相互作用在GVHD的病理过程中可能起到了十分重要的作用,提示人CD40-Ig融合蛋白在临床预防和治疗GVHD方面的巨大应用潜力.     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

高可溶性Aβ融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的在大肠杆菌中表达阿尔茨海默病(AD)相关肽段Aβ与具有强助溶作用的麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,从而经济有效地获得具有天然免疫原性的Aβ肽段,为深入研究AD的发病机理和治疗药物提供重要的物质基础。方法用PCR法扩增Aβ的基因片段,并将其插入到含有麦芽糖结合蛋白的融合表达载体pMAL-c2中,经测序后再将重组质粒转化入大肠杆菌TB1中进行诱导表达。经多聚麦芽糖亲和色谱的纯化获得MBP-Aβ融合蛋白。再用SDS-PAGE及Western blotting鉴定Aβ及其融合蛋白的表达和免疫原性。结果测序结果证实插入的DNA片段与Aβ序列一致。SDS-PAGE电泳显示Aβ融合蛋白被高效表达。Western blotting结果表明Aβ及其融合蛋白可被其特异性抗体识别。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性的Aβ融合蛋白并经纯化和酶解后获得了Aβ纯肽段,为AD病机理的研究及其病理模型的建立提供了物质基础。     

雪旺氏细胞凋亡在TNFRⅠ－/－鼠实验性自身免疫性神经炎发病机制中的作用

目的： 建立实验性自身免疫性神经炎（EAN）在肿瘤坏死因子α受体I（TNFRⅠ）基因敲除鼠（TNFRⅠ－/－）的动物模型,进一步研究雪旺氏细胞凋亡在其发病机制中的作用。方法：采用周围神经P0 蛋白180-199肽段皮下免疫方法分别在TNFRⅠ－/－及野生鼠C57BL/6上制备EAN动物模型;连续观察EAN的发病过程、疾病严重程度并进行临床症状评分;免疫后第22天取2组动物雪旺氏细胞进行原代培养,通过流式细胞仪检测Fas及Annexin-Ⅴ（Annexin-Ⅴ+/PI－）在雪旺氏细胞的表达。结果：TNFRⅠ－/－组EAN症状高峰临床评分（1.50±0.19）较野生型组（1.90±0.16）明显减低;TNFRⅠ－/－EAN组雪旺氏细胞Fas阳性表达率为（88.03±1.40）％,野生型组为（94.70±1.53）％,两组比较差异有显著性（P<0.05);Annexin-Ⅴ（Annexin-Ⅴ+/PI－）在TNFRⅠ－/－组雪旺氏细胞的阳性表达率为（8.78±0.94）％,野生型组为（13.03±4.15）％,TNFRⅠ－/－组呈降低趋势,但两组比较差异无显著性（P>0.05)。结论：TNFRⅠ可能通过增加雪旺氏细胞的凋亡进而引起周围神经损伤而加重EAN的临床症状。     

重组多功能抗凝多肽的表达及活性测定

目的 探讨多功能抗凝多肽基因的克隆、表达的可行性及其活性的测定。方法 设计一个具有双重抗凝功能的重组多肽分子结构,它由谷胱甘肽-S-转移酶(GST)作为载体蛋白与重组抗凝多肽融合而成。编码重组抗凝多肽的DNA序列是根据氨基酸序列逆向翻译后经人工合成,并插入表达质粒pGEX-5X-3中,与其中的编码GST序列的3‘端融合。采用大肠杆菌DH5α进行原核表达。应用亲和层析的方法得到纯化的融合蛋白。重组抗凝多肽含有31个氨基酸,由3个功能部分组成：(1)Lys-Gly-Asp(KGD)氨基酸序列,可抑制血小板GpⅡb／Ⅲα受体与纤维蛋白原的结合;(2)纤维蛋白单肽A的7-16残基(FBA^7-16),是凝血酶的抑制剂。(3)水蛭素C末端的12肽,可直接抑制凝血酶。结果 纯化的融合蛋白能抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集(100μmol／L时其活性为对照组的20．7％);随浓度增加而显著延长部分凝血活酶时间(80μmol／L时凝血活酶时间为74．7s)和凝血酶时间(80μmol／L时为102．3s)并抑制凝血酶的蛋白酶分解活性(100μmol／L时活性为对照的11％)。同时,也发现GST也有抗血小板作用,但其作用要明显弱于融合蛋白。结论 通过基因重组的方法设计一具复合抗凝功能的多肽是可行的。     

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人脐静脉内皮细胞

目的研究PEP-1-EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力。方法用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育,分别观察其进入细胞的能力及PEP-1-EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性,并用MTT法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性。结果EGFP蛋白不能进入细胞内。PEP-1-EGFP融合蛋白可在5min内穿透人脐静脉内皮细胞,其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性,进入细胞后27h仍可观察到微量绿色荧光。PEP-1-EGFP蛋白浓度达200μmol/L时对细胞仍无毒性。结论PEP-1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础。     

人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达

目的构建含人Tau多表位肽段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化目的蛋白,检测Tau多表位DNA疫苗免疫小鼠后特异性抗体产生情况。方法以质粒pVAX1-Tau为模板,用PCR扩增人Tau多表位肽段基因,插入表达载体pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-TauP1/P2。将鉴定后的阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并采用GST法纯化、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。以TauP1/P2 DNA疫苗免疫小鼠获取血清,Dot-blot检测TauP1/P2特异性抗体产生情况。结果 PCR扩增出约300 bp的基因片段,克隆至表达载体后,经酶切和测序验证正确;获得了纯化的目的蛋白,并证实了GST-TauP1/P2融合蛋白的表达。Dot-blot检测到特异性TauP1/P2抗体的产生。结论成功构建和表达人Tau多表位肽段基因的目的蛋白GST-TauP1/P2,能够识别Tau多表位DNA疫苗免疫后小鼠产生的特异性TauP1/P2抗体。     

PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导入人主动脉平滑肌细胞

目的:研究细胞穿透肽PEP-1携带大分子蛋白穿透人平滑肌细胞的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和培养的人平滑肌细胞共同孵育,在荧光显微镜下直接观察PEP-1介导目的蛋白EGFP转导入人平滑肌细胞的能力。结果:EGFP蛋白不能进入细胞内,PEP-1-EGFP融合蛋白和人平滑肌细胞共同孵育1h后可见有明亮绿色荧光分布于胞浆和胞核。结论:PEP-1能有效携带目的蛋白进入人平滑肌细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的大分子抗平滑肌细胞增殖进行血管成形术后再狭窄的蛋白治疗奠定了基础。     

内质网应激介导的Kupffer细胞源性TNF-α经TNFR/caspase 8途径诱导肝星状细胞凋亡

目的 探讨Kupffer细胞（KCs）内质网应激以及KCs细胞源性肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在肝星状细胞凋亡中的作用。方法 建立大鼠肝纤维化模型,按随机数字表法分为4组,15只/组：对照组：腹腔注射生理盐水（2 mg/kg）;肝纤维化组：腹腔注射40%CCl4溶液（花生油制成,2 mg/kg）;内质网应激组：腹腔注射40% CCl4溶液（2 mg/kg）和衣霉素（1 mg/kg）;KCs封闭组：腹腔注射40% CCl4溶液（2 mg/kg）和衣霉素（1 mg/kg）后,经腹腔注射氯膦酸脂质体（50 mg/kg）。以上4组注射处理均为2次/周,共8周。在动物模型基础上,建立KCs、LX2共培养细胞系,随机分为4组：对照组：分离培养对照组大鼠肝脏KCs,与LX2细胞共培养;肝纤维化组：分离培养肝纤维化组大鼠肝脏KCs,与LX2细胞共培养;ER-stress组：分离培养ER-stress组大鼠肝脏KCs,与LX2细胞共培养;肿瘤坏死因子受体（TNFR）阻断组：在ER-stress大鼠基础上,经门静脉注射anti-rat TNFR mAb（0.35 mg/kg）后,按照分离大鼠肝脏KCs,与LX2细胞共培养,收集细胞和上清液。运用肝功能检测、天狼星红染色、ELISA、免疫荧光、RTPCR,检测各组大鼠肝功能水平、肝纤维化程度、KCs极性、炎症因子表达以及活化肝星状细胞数量。运用ELISA、RT-PCR、Western blot,检测各组细胞极性、炎症因子表达、LX2凋亡程度、TNFR/caspase 8通路蛋白表达。结果 体内实验结果显示,与对照组相比,肝纤维化组的谷氨酸转氨酶（AST）、天冬氨酸转氨酶(ALT)水平、天狼星红染色阳性区域、结蛋白阳性细胞（活化肝星状细胞）数量均显著增多（P<0.05）,CD16阳性细胞、TNF-α表达和mRNA水平显著下降（P<0.05）;与肝纤维化组相比,ER-stress组ALT和AST水平、天狼星红染色阳性区域、结蛋白阳性细胞数量均明显降低（P<0.05）,CD16阳性细胞、TNF-α表达和mRNA水平均明显增多（P<0.05）;与ER-stress组相比,KCs封闭组ALT和AST水平、天狼星红染色阳性区域、结蛋白阳性细胞数量均显著增多（P<0.05）,CD16阳性细胞、TNF-α表达和mRNA水平均显著下降（P<0.05）。体外实验结果显示,与对照组相比,肝纤维化组内TUNEL阳性的LX2细胞、CD16阳性细胞、KCs内TNFR、cleaved-caspase 8、cleaved-caspase 3的表达均明显降低（P<0.05）,但结蛋白阳性的LX2细胞显著增加（P<0.05）;与肝纤维化组相比,ER-stress组内TUNEL阳性的LX2细胞、CD16阳性细胞、KCs内TNFR、cleaved-caspase 8、cleaved-caspase 3的表达均明显增加（P<0.05）,但结蛋白阳性的LX2细胞显著减少（P<0.05）;同时,在阻断TNFR后,与ER-stress组相比,虽然TNFR表达未见明显变化,但下游cleaved-caspase 8、cleaved-caspase 3的表达均显著下降（P<0.05）。结论 KCs内质网应激促进了其M1型极化,并增加了KCs源性TNF-α的表达。KCs源性TNF-α经TNFR/caspase 8途径诱导了肝星状细胞的凋亡。