公共场所冷却塔水嗜肺军团菌的基因序列分型研究

目的 为了解温州市中央空调冷却塔水中嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,LP)基因特征,采用序列分型方法(sequenced-based typing,SBT)对公共场所中央空调冷却塔水中的嗜肺军团菌进行分子分型研究。方法 选择嗜肺军团菌的7 个管家基因 flaA、asd、mip、pilE、mompS、proA 和 neuA 作为目的基因, 对温州市公共场所中央空调冷却塔水中分离的31株嗜肺军团菌进行PCR扩增并测序。测序结果上传欧盟军团菌感染工作组(EWGLI)数据库进行比对、分型。运用DNAsp 5.0 、Bionumerics5.1及SplitsTree 等软件对分型结果进行分析。结果 31株嗜肺军团菌中,11株LP1型被分为2种ST型;17株非LP1型被分为8种ST型,其中7种ST型是新发现的序列型,并新发现1个等位基因;另3株非LP1型因缺少neuA基因未被数据库确认 。7个管家基因的核苷酸多态性 (Pi)范围为0.00995(mip)～0.02311(flaA)。 flaA具有最大的核苷酸多态性 ( 0.02311 )。经聚类分析得到本地分离的嗜肺军团菌株的遗传进化关系。结论 温州市公共场所冷却塔水中的嗜肺军团菌与国内外其他地区报道的嗜肺军团菌具有一定的亲缘关系,同时也具有地区特异性和遗传多样性。     

四川省嗜肺军团菌血清Ⅰ型(LP1)基因分型研究

目的为了解四川省嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,LP)基因特征,采用多位点串联重复序列分析(MLVA)和基因序列分型(SBT)两种方法对四川省1989—2016年分离到的42株嗜肺军团菌血清I型(LP1)进行基因分型研究。方法根据文献报道的军团菌8个VNTR位点和SBT 7个管家基因对42株嗜肺军团1型菌(LP1)分别进行PCR扩增。VNTR结果经毛细管电泳分析后,得到MLVA分型。SBT结果测序后上传至欧洲军团菌感染组(EWGLI)数据库得到ST分型。结果 42株嗜肺军团菌血清I型(LP1)分为8个MLVA型,优势型别为M08型(47.6%)和M07型(23.8%)。SBT分为12个ST型,其中有2个ST型(ST2359,ST2360)为首次发现。ST1(52.3%)、ST630(14.2%)为优势型别。12个ST型分为3个克隆群(Clonal Complex,CCs)和2个singleton。结论 MLVA方法和SBT方法均能用于LP1型分子流行病学监测及分子遗传学特征的研究。四川省LP1型具备较高的遗传多样性和地区特异性,有感染人的风险,应加强对公共卫生环境中军团菌的监测工作。     

温泉水中嗜肺军团菌污染调查及分子分型研究

目的 探讨温泉水环境中嗜肺军团菌的污染状况和分布规律,了解其主要血清型别及基因型别。方法 采取随机抽样方法采集温泉场所蓄水池、温泉池、客房淋浴水等,浓缩后用细菌培养法分离得到可疑菌株,用血清学与荧光定量 PCR技术进行嗜肺军团菌的鉴定。对分离的菌株用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型方法(SBT)进行基因分型。结果 65份温泉水中35份检出嗜肺军团菌,检出率为53.85%。嗜肺军团菌计数范围在20 CFU/100 mL-16 000 CFU/100 mL之间。血清分型以LP1、LP3为主。分离的嗜肺军团菌菌株均携带dot基因。对40株嗜肺军团菌菌株进行了PFGE聚类分析,得到10种不同的带型。40株菌株13种ST型可以被分为3个克隆群和1个单态群。结论 本地区温泉水嗜肺军团菌污染程度较高,分子分型结果表明这些菌株具有遗传多样性。     

嗜肺军团菌mip基因的克隆与表达

目的　扩增嗜肺军团菌mip基因 ,导入载体 pUC18,构建重组质粒 pLpmip ,并在原核系统中表达。 方法　采用聚合酶链式反应 (PCR)从嗜肺军团菌扩增得到巨噬细胞感染增强蛋白基因 (mip基因 ) ,导入载体pUC18,构建重组质粒 pLp mip并转化大肠杆菌JM 10 9,并用限制性酶切分析、聚合酶链式反应、序列分析、硫酸十二烷酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)、Western印迹进行鉴定。结果　扩增出 82 8bp的mip基因 ;构建重组质粒 pLpmip ;表达出 2 4kD的抗原区带。结论成功扩增 82 8bp的嗜肺军团菌mip基因 ,构建重组质粒 pLpmip ,并在原核系统中表达出 2 4KD的抗原区带。     

Population structure of Neisseria meningitidis ST-9493 identified in Colombian isolates

IntroductionNeisseria meningitidis is associated with invasive infections causing high mortality rates. The objective of this study was to describe the population structure of Colombian invasive isolates with ST-9493, a potentially emerging clonal group in the country.MethodsThe complete genomes of 34 invasive isolates of serogroup B with ST-9493 and its variants at one or two loci were sequenced by Illumina to describe the phenotypic and genotypic characteristics of these isolates.ResultsThe relationship of a clonal group associated with ST-136 CC41/44 was phylogenetically established, identifying two main clades composed of isolates from an outbreak or endemic. The most frequent alleles and peptides included porA 17, porB 44, fHbp 2.24, NHBA 10, and the FetA F5-17 variant. Most of the isolates were susceptible to the antibiotics evaluated.ConclusionThis study shows that meningococcal isolates with ST-9493 are an autochthonous clonal group with population dynamics and the capacity to cause endemic and epidemic meningococcal disease in Colombia.     

上海口岸管道水中军团菌污染状况及其细胞内生长能力研究

目的 了解口岸公共场所管道水军团菌污染状况和细菌在细胞内的生长能力。方法 采集上海市口岸管道水132份,采用GVPC(军团菌选择性培养基)培养计数法对水样中军团菌进行定性和定量分析。用小鼠巨噬细胞J774细胞对分离菌株进行菌株致病性研究。结果 平板培养法检测管道水中军团菌阳性率为18.94%, 25份培养阳性标本中军团菌定量数值为50～1 320菌落形成单位(CFU)/L。分离的25株军团菌中17株是嗜肺军团菌;其中血清1型2株、8型13株、7型1株、5型1株;其余8株为米克戴德军团菌。细胞内生长实验结果显示, 4个血清型的嗜肺军团菌均具有很高的细胞内生长能力,而米克戴德军团菌细胞内生长能力较低。结论 管道水中军团菌污染率和含菌量较高,且菌株具有很高的细胞内生长能力,提示其具有一定致病性,有引起军团菌病的危险,应采取相应消毒和预防措施。     

嗜肺军团菌pilE基因的克隆及其原核表达

目的克隆嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛蛋白pilE基因,构建重组质粒pET-pilE,并在原核系统中表达。方法采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增军团菌Ⅳ型菌毛蛋白pilE基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a( ),构建原核表达重组质粒pET-pilE,经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了429bp完整的pilE基因,构建的原核表达重组质粒pET-pilE表达出35.7 kDa的融合蛋白质。结论成功构建了军团菌pilE基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达,为以后深入研究奠定了基础。     

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳（PFGE）分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩 端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用 DNA限制性内切酶Not I对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3 株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对 、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA 基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种（L. interrogans）不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄 疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L. interrogans种,上述两种方法 对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪 。     

成都地区肉鸭屠宰链弯曲菌毒力基因分布及分子分型研究

目的 了解并分析肉鸭屠宰环节中弯曲菌分离株的9种毒力基因分布及分子分型特征。方法 利用特异性引物对弯曲菌9种与致病力相关的毒力基因进行PCR检测;参照美国PulseNet 脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准方法,对68株鸭源弯曲菌分离株进行PFGE分型。结果 毒力基因PCR检测结果显示空肠弯曲菌中cadF、iamA和cheY毒力基因携带率均为100%,flaA(97.1%)、cdtB(94.3%)、cdtC(94.3%)和ciaB(80%)毒力基因的携带率也较高,其余毒力基因cdtA(25.7%),virB11(2.9%)较低;结肠弯曲菌中除cadF(100%)毒力基因外,高于50%携带率的毒力基因有cheY(84.8%)、cdtB(72.7%)、iamA(66.7%)和cdtA(54.5%),另外4个毒力基因flaA(48.5%)、virB11(18.2%)、cdtC(36.4%)和ciaB(18.2%)携带率均较低。利用PFGE方法对弯曲菌分离株进行分子分型,结果显示35株空肠弯曲菌和33株结肠弯曲菌可分为15个和11个谱型,表现为较低的遗传多样性。结论 弯曲菌毒力基因分布广泛,且空肠弯曲菌携带率较高;PFGE基因谱型相似性表明该肉鸭屠宰场存在交叉感染和弯曲菌沿屠宰链传播的现象。     

广东地区空调冷却塔水嗜肺军团菌分离株脂肪酸分型研究

目的探讨脂肪酸分析方法在种水平上对嗜肺军团菌的判断能力;将脂肪酸分型方法与传统的血清分型方法进行比较,了解不同血清型嗜肺军团菌株脂肪酸成分的异同。方法选取近3年从广东地区空调冷却塔水中分离到的112株嗜肺军团菌分离株,提取脂肪酸,利用MIDI公司Sherlock系统进行菌体脂肪酸成分分析,使用SPSS 13.0软件对获得的数据资料进行统计分析及聚类分析。结果脂肪酸分析法判定嗜肺军团菌的符合率为84.8%,所有菌株共有的脂肪酸成分有9种,主要脂肪酸成分有4种,分别为16∶0 iso、15∶0 anteiso、16∶1 w7c和14∶0 iso脂肪酸。血清1型菌株与血清6、7型菌株相比,有3种主要脂肪酸含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论可以依据菌体脂肪酸分析方法对嗜肺军团菌进行快速鉴定;嗜肺军团菌菌株的脂肪酸成分稳定,但各血清型间脂肪酸含量存在一定差异;MIDI数据库中军团菌脂肪酸数据仍有待完善。本研究同时提供了广东地区空调冷却塔水嗜肺军团菌株脂肪酸组成及分型数据。     

嗜肺军团菌htpA基因的克隆及其原核表达

目的克隆并检测嗜肺军团菌htpA基因在原核系统中表达情况,为进一步研究HtpA蛋白的免疫性能作必要的准备。方法采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得军团菌热休克蛋白A基因htpA,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGhtpA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,转化宿主菌大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了291bp完整的htpA基因,构建了原核表达重组质粒pGhtpA,并检测到约36kDa的GST-htpA融合蛋白质表达条带。结论成功克隆了嗜肺军团菌htpA基因并使HtpA蛋白在原核表达系统中得到了有效的表达,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

嗜肺军团菌主要外膜蛋白与鞭毛亚单位蛋白双基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的构建嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)与鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建mompS与flaA基因完全融合的重组质粒,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌904bp的mompS及1432bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSF,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-LpSF在原核系统中得到了表达。结论成功构建了嗜肺军团菌mompS-flaA双基因的原核融合表达载体,并在大肠杆菌中得到了表达,为进一步研究嗜肺军团菌核酸双价疫苗提供研究基础。     

Unexpected similarity of pulsed-field gel electrophoresis patterns of unrelated clinical isolates of Legionella pneumophila, serogroup 1

Phenotypic and genotypic methods identify subtypes of Legionella pneumophila, serogroup 1, and match patient and environmental isolates from suspected sources. The strength of this association is limited by the lack of information regarding the frequency and distribution of isolates belonging to various subtypes. In this study, 62 clinical isolates of L. pneumophila, serogroup 1, were subtyped by using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), to determine the distribution and degree of diversity of PFGE patterns among monoclonal antibody (MAb) subtypes. Unexpectedly, 8 of 21 MAb Philadelphia 1 isolates had a common PFGE pattern, and, among 12 MAb OLDA isolates, only 2 PFGE patterns were seen. Our hypothesis was that PFGE patterns were distributed randomly; however, statistical analysis showed that the distribution of subtypes was not random (Fisher's exact test 0.13; P>.05). In light of these results, researchers who do epidemiological investigations should use caution when interpreting the significance of matching PFGE patterns of L. pneumophila, serogroup 1.     

河南省20株布鲁氏菌鉴定与PFGE分子分型研究

目的检测与分析河南省2010-2012年20株布氏菌型别及PFGE脉冲场凝胶电泳指纹图谱特征。方法采集病人静脉血,分别以试管凝集试验(SAT)、双相血培养瓶分离培养、热裂解法制备DNA模板和AMOS-PCR鉴定4种布氏菌型别。采用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对检出的布鲁氏菌进行分子分型鉴定。结果分离培养的20株布鲁氏菌经鉴定,19株为羊种,1株为牛种;羊种布鲁氏菌经XbaI酶切与脉冲场凝胶电泳后,共获得了8种不同带型,带型相似度在80%~100%之间,牛种与羊种菌株在带型相似度上差异较大,具有较好的分辨能力。结论河南省病人感染的布鲁氏菌以羊种为主要型别,AMOS-PCR与PFGE作为布鲁氏菌菌型鉴定与分子分型的技术手段,为布鲁氏菌病的病原学监测与应急检测提供依据。     

人工水和自然水环境中嗜肺军团菌mip基因分型

目的 比较人工水体与自然水体环境中军团菌的mip基因差异.方法 将2003-2008年间广州和新会两市水样中分离的121株嗜肺军团菌分为人工与自然水体环境分离株两组,分别对其mip基因进行系统进化树重建,基因多态性分析,分子方差分析与中性检验,并比较两种分离来源菌株的mip基因差异.结果 121株嗜肺军团菌mip基因按分离环境来源不均匀地分布在系统进化树的拓扑分支.人工水体环境分离株共有8个等位基因型,以等位基因1型为优势群,比例55.36％,自然水体环境分离株有11个等位基因型,以等位基因28型为优势群,比例40％.人工水体环境分离株的核苷酸多态性与平均核苷酸差异大于自然水体环境分离株.分子方差分析结果显示两种环境分离株mip基因差异占总体差异的14.43％.中性检验证明人工水体环境分离株的mip3’末端处,Tajima检验P＜0.05,D值显著大于0.而自然环境分离株在此区域未见显著性差异.结论 嗜肺军团菌mip基因在人工与自然水体环境分离株之间存在显著差异,这种差异可能来源于人工水体环境对嗜肺军团菌种群大小的影响或平衡选择作用.     

军团菌外膜蛋白抗原基因的克隆并在原核系统中表达

目的克隆军团菌外膜蛋白抗原基因ompM，构建重组质粒pLPM，并在原核系统中表达。方法采用聚合酶链反应(PCR)从军团菌基因组DNA中扩增得到ompM基因，导入载体pUC18，在JM109中表达，并用SDS-PAGE进行鉴定。结果扩增出773bp的ompM基因；构建重组质粒pLPM；表达出25kDa的蛋白质。结论成功扩增军团菌ompM基因，构建重组质粒pLPM，并在原核系统中得到了表达。     

Epidemiological and molecular characterization of community and hospital acquired Staphylococcus aureus strains prevailing in Shenyang,Northeastern China

In order to obtain adequate information for the treatment of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infections, it is crucial to identify trends in epidemiological and antimicrobial resistance patterns of local S. aureus strains. Community and hospital acquired S. aureus isolates (n = 202) were characterized using staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing, pulse field gel electrophoresis (PFGE) analysis, spa typing and minimal inhibitory concentration (MIC) determination. The prevalence of the Panton-Valentine leukocidine (pvl) and several antibiotic resistance genes among the isolates were also detected by PCR. All of the S. aureus isolates were susceptible to vancomycin, daptomycin and linezolid. Three hospital isolates were resistant to teicoplanin while 14 showed intermediate resistance to teicoplanin. The resistance patterns of community-acquired MRSA (CA-MRSA) isolates to other antimicrobials were similar to those of hospital-acquired MRSA (HA-MRSA) isolates except for clindamycin and gentamicin. There was excellent correlation between phenotypes and genotypes in the determination of S. aureus resistance to erythromycin, gentamicin, and tetracycline. The SCCmec type II and SCCmec type IV were the predominant types detected in hospital and community isolates, respectively. The most frequently encountered spa types were t002 and t030 both in HA- and CA-MRSA isolates. Pulsotype A was the most predominant pulsotype identified among the isolates tested, followed by pulsotype B. Seventy-two hospital isolates (19 HA-MRSA and 53 HA-MSSA) and 10 CA-MRSA were positive for the pvl gene. This study shows that the combination of susceptibility testing and various molecular methods has provided useful information on the antibiotic resistance and molecular diversity of S. aureus in a specific region of China. The high proportion of pvl positive MSSA and MRSA isolates observed in this study indicates that adequate measures are needed to curtail the spread of those MRSA and MSSA clones prevailing both in hospital and the community.     

嗜肺军团菌lvgA基因分析及实时荧光定量RT-PCR对军团菌的检测

目的确定不同嗜肺军团菌lvgA基因序列的差异性及其感染宿主细胞后转录水平的变化,建立基于lvgA基因检测嗜肺军团菌的荧光定量RT-PCR。方法通过使用NCBI/Blast,Pfam,TMHMMServer v.2.0等网络资源分析嗜肺军团菌lvgA基因编码蛋白的保守功能结构域、跨膜区域。根据参考序列设计引物,采用PCR技术从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增lvgA基因,将其连接入克隆载体pMD18-T进行测序,并用cltust软件比较不同嗜肺军团菌菌株lvgA基因的核苷酸、氨基酸序列。根据lvgA基因和嗜肺军团菌16SrDNA序列内的特异保守区域设计引物,以实时荧光定量RT-PCR检测嗜肺军团菌在感染人单核巨噬样细胞THP-1后lvgA基因转录水平的变化,同时,采用基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR对嗜肺军团菌患者血液样本进行检测。结果研究表明,嗜肺军团菌lvgA基因为军团菌毒力基因,其产物定位于外膜表面。不同嗜肺军团菌菌株中lvgA基因的核苷酸序列和氨基酸序列保守,相似度分别达:99%,96%,96%和99%,98%,98%。在感染宿主细胞后lvgA基因的转录水平上调明显,最高达4.3倍(P<0.05)。基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR方法可有效地检测嗜肺军团菌患者血液样本中的嗜肺军团菌。结论 lvgA基因与嗜肺军团菌的毒力相关,建立的基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR方法具有快速、敏感、稳定等优点,适用于嗜肺军团菌肺炎临床实验室的早期诊断。     

浙江省首次从室外中央空调冷却塔水中分离到嗜肺军团菌

采集浙江省9家医院、6家超市中央空调冷却塔的15份水样中有8份检出嗜肺军团菌,阳性率高达5333%。玻片凝集试验结果证实,4份医院水样、1份超市水样存在两种不同血清型的嗜肺军团菌,13株嗜肺军团菌中Lp1型8株、Lp6型4株、Lp7型1株。上述菌株PCR扩增结果均为阳性。     

2007年中国四省福氏志贺菌分离菌株的毒力基因检测和PFGE分析

目的分析中国河南等四省的福氏志贺菌分离菌株毒力基因和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型。方法应用PCR方法检测2007年从河南、青海、甘肃和山西分离的262株福氏志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、志贺肠毒素2基因(sen)、志贺肠毒素1基因(set1A)以及侵袭性蛋白基因(ipaBCD)。参考美国CDC的PulseNet实验方法 ,用限制性内切酶NotI对细菌染色体进行酶切,对这些分离菌株进行PFGE分析,使用BioNumerics软件进行聚类分析,并按照PulseNet命名原则对带型进行命名。结果 262株福氏志贺菌分离菌株ipaH、sen、set1A和ipaBCD基因的携带率分别为100%、93.89%、96.18%和92.75%。具有7种毒力基因携带模式,其中89.31%的菌株为Ⅰ型毒力基因携带模式(ipaH+sen+set1A+ipaB-CD+),有99.24%菌株同时携带两种或以上毒力基因。262株福氏志贺菌共分为83个PFGE型别,其中CNJZXN11.0002、CNJZXN11.0003、CNJZXN11.0060、CNJZXN11.0081、CNJZXN11.0137、CNJZXN11.0169、CNJZXN11.0190、CNJZXN11.0195、CNJZXN11.0196、CNJZXN11.0199、CNJZXN11.0217、CNJZXN11.0325和CNJZXN11.0327为13种主要带型。CNJZXN11.0003型菌株在4省均有分布,CNJZXN11.0199为河南菌株的优势带型,CNJZXN11.0137、CNJZXN11.0325和CNJZXN11.0327为山西特有的PFGE带型,与CNJZXN11.0003等主要带型聚类相似性较小。结论四省分离的福氏志贺菌株中ipaH、sen、set1A和iPaBCD毒力基因的携带率较高,而且这些菌株的PFGE型别既具有地区性差异,又具有优势型别的交叉。