内皮祖细胞条件培养基对间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及其机制

目的:探讨小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)条件培养基(CM) 对同源间充质干细胞(MSCs)增殖和成骨分化功能的影响,并阐明其作用机制。方法:小鼠骨髓细胞经差速贴壁法结合专用培养基分别培养扩增MSCs和EPCs,采用流式细胞术(FCM)检测MSCs和EPCs表面标记物,以成骨、成脂和成软骨诱导分化对MSCs进行功能鉴定,以成血管对EPCs进行功能鉴定。将MSCs分为0% EPCs-CM组(对照组,采用LG-DMEM培养)、50% EPCs-CM组(采用50% EPCs-CM+50% LG-DMEM培养)和100% EPCs-CM 组(采用100% EPCs-CM培养)。采用MTT比色法检测各组MSCs的增殖活性;采用茜素红染色检测各组MSCs的成骨分化能力。结果:FCM法检测,第3代MSCs高表达Sca-1、CD29, 低表达CD45、CD11b;经诱导可向成骨、成软骨和成脂方向分化。第3代EPCs 高表达CD34、CD133和VEGFR2;在铺有基质胶的96孔培养板中可形成血管样结构。与对照组比较,50% EPCs-CM组和100% EPCs-CM组MSCs增殖活性明显增加,且呈浓度依赖性(P<0.05)。茜草色素红染色法检测,培养21 d后50%和100% EPCs-CM组MSCs的钙结节数量和钙盐沉积均高于对照组(P<0.05)。结论:利用差速贴壁法可同时分离MSCs和EPCs,EPCs-CM能促进MSCs 的增殖和成骨分化。     

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化

目的 通过成人脂肪体外分离培养脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）研究其生理特性及在特定培养条件下向成骨分化,探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景.方法 从成人脂肪中利用胶原酶消化法分离并体外培养干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,P3代脂肪干细胞通过成骨诱导液诱导向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶（AKP）,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OP）表达变化.结果 成人脂肪间质来源的ADSCs,能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞检测证实其特异表达相关干细胞表面标记物;成骨诱导后表现出呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性,茜素红染色阳性,诱导培养0、3、7、14、21、28天后RT-PCR定量检测证实细胞中ALP、OP阳性表达.结论 成人脂肪中可分离得到ADSCs,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向骨细胞分化,阳性表达OP、ALP,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源.     

脂肪干细胞成骨分化的研究进展

随着骨组织工程研究取得较好的发展,涌现出各类种子细胞。脂肪干细胞,来自脂肪组织,具有诸多的优势,成为骨组织工程研究的热点种子细胞之一。本文综述了脂肪干细胞成骨分化的诱导方法、过程、验证方法、影响成骨分化的供体因素和实验因素,并对其未来研究方向进行了展望。     

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

目的: 建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞（human adipose derived mesenchymal stem cells,hADSCs）的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性。初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制。方法 ： 剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15%Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养。行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能。通过RT PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ 2（peroxisome proliferator activated receptorγ 2,PPARγ 2）和骨桥蛋白mRNA表达情况。结果 ： 通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞。MTT法显示细胞增殖能力强。流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA DR低表达。细胞免疫荧光结果与之相符。hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能。在成骨分化过程中同时伴有成脂发生。RT PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ 2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ 2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论： 建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法。获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征。hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用。     

去分化间充质干细胞成骨再分化潜能的实验研究

目的:研究去分化间充质干细胞(de－differentiated mesenchymal stem cells,De－MSCs)成骨再分化能力?方法:以MSCs为对照,分别采用Cell Count Kit(CCK8)法?实时定量PCR(qPCR)?碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色法检测De－MSCs增殖能力?成骨相关基因?成骨再分化能力等?结果:De－MSCs可表达干细胞表面标志,在成骨培养基中增殖能力高于MSCs(P < 0.05),成骨相关基因(Runx2?Osterix?Bmp2)表达明显增加(P < 0.05),ALP活性检测发现De－MSCs明显高于MSCs组(P < 0.05),28 d后茜素红染色可见红色结节?结论:De－MSCs具备某些MSCs特征,但是体外再次成骨效率明显提高,De－MSCs可作为更优质种子细胞,为再生医学开拓新的思路?     

诱导脂肪干细胞成内皮分化的研究进展

<正>慢性难愈创面影响着全球数百万危及生命的个体,可能导致截肢和严重的疾病^[1]。微血管病变所致的局部组织缺血微循环障碍是创面难愈的主要原因之一^[2]。国内外学者应用内皮细胞治疗缺血性疾病已取得一定的疗效,但由于内皮细胞难以获取且为终末细胞,无法在体外大量扩增而受到限制^[3]。近年来,血管组织工程的发展为缺血性疾病的治疗提供了新的思路。     

电磁场诱导间充质干细胞成骨分化的研究进展

间充质干细胞（MSC）是一种多能成体干细胞,在一定诱导条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种功能细胞。在骨科领域为各种组织的修复提供良好的细胞来源,是目前组织工程及再生医学领域研究最为深入的种子细胞之一。电磁场(EMF)作为一种非侵入性的物理疗法,在治疗骨不连、骨缺损及骨质疏松等疾病具有良好的优势。因此,近几年对电磁场诱导间充质干细胞成骨分化的机制研究较多,本文就电磁场参数、电磁场类型对不同来源的间充质干细胞诱导成骨分化的相关机制做一综述。     

年龄因素对大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响

目的探讨年龄因素对脂肪干细胞成骨分化能力的影响。方法通过密度梯度离心法分离不同年龄段ADSCs进行培养及传代,观察细胞生长情况,细胞培养至第3代进行诱导分化,各年龄组细胞均在成骨诱导分化后进行检测。观察其形态变化、细胞凋亡率、碱性磷酸酶活性及钙离子浓度测定。结果体外培养的ADSCs呈梭形,诱导条件下,各年龄组细胞形态由梭形变为立方形、多角形;经检测,随年龄的增长细胞的凋亡率在不断增大,幼年组细胞碱性磷酸酶活性较老年组高,钙离子浓度随年龄增加而降低。结论ADSCs成骨分化能力随着年龄的增加而降低。     

年龄因素对大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响

目的 探讨年龄因素对脂肪干细胞成骨分化能力的影响.方法 通过密度梯度离心法分离不同年龄段ADSCs进行培养及传代,观察细胞生长情况,细胞培养至第3代进行诱导分化,各年龄组细胞均在成骨诱导分化后进行检测.观察其形态变化、细胞凋亡率、碱性磷酸酶活性及钙离子浓度测定.结果 体外培养的ADSCs呈梭形,诱导条件下,各年龄组细胞形态由梭形变为立方形、多角形;经检测,随年龄的增长细胞的凋亡率在不断增大,幼年组细胞碱性磷酸酶活性较老年组高,钙离子浓度随年龄增加而降低.结论 ADSCs成骨分化能力随着年龄的增加而降低.     

不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞（orofacial bonemesenchymal stem cells, OFMSCs）增殖和成骨分化的影响。方法 体外分离、培养OFMSCs,成骨、成脂、成软骨分化诱导及鉴定,并使用不同含糖量培养基（5.5、11、16.5、25、44 mmol/L）培养OFMSCs,以5.5 mmol/L基准糖浓度为对照组,其余组为实验组。采用CCK-8及流式细胞仪检测各组OFMSCs的增殖活性及增殖指数,OFMSCs成骨诱导后4、7 d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,21 d进行茜素红染色及矿化定量分析,同时用RT-PCR检测3、7、14及21 d相关成骨基因Runx2、Osterix的表达。结果 培养的OFMSCs成骨诱导21 d后茜素红染色可见钙结节,成脂诱导14 d 后油红O染色可见红色脂滴,成软骨诱导14 d 后阿利新蓝染色可见蓝色胞浆;糖浓度在5.5～25 mmol/L促进OFMSCs的增殖,但随着糖浓度的继续增加（25～44 mmol/L）,OFMSCs的增殖活性受抑制;成骨诱导时,随着培养液糖浓度升高,ALP活性呈剂量依赖性降低（P Runx2、Osterix mRNA 表达量高于实验组（P Runx2、Osterix mRNA 表达量均出现先上调再下调的趋势。结论 在一定范围的糖浓度内,糖浓度升高可促进OFMSCs的增殖;而糖浓度升高对成骨分化呈抑制效应。     

骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化

摘 要: 【目的】 为研究患者来源干细胞成骨分化的差异性,选取临床诊断为骨质疏松症患者的骨髓干细胞进行成骨分化诱导? 【方法】 采用密度梯度离心法,从临床6名患者(骨质疏松症3人,非骨质疏松症3人)的腰椎骨髓血液中分离获得原代骨髓间充质干细胞,并体外扩增至3-4代后进行实验?成骨诱导液的成分包括地塞米松(100 nmoL/L),二磷酸抗坏血酸(0.05 mmoL/L),β-甘油磷酸钠(10 mmoL/L)溶解于含有100 mL/L胎牛血清的低糖DMEM中?通过测定hMSC的增值与碱性磷酸酶(ALP)含量反应干细胞成骨分化活性?定量PCR检测Runx-2?ALP及成骨标志基因osteocalcin(OC)和osteonectin(ON)表达水平;通过矿化结节茜素红染色确认并定量检测钙离子浓度?【结果】 比较两组干细胞增殖差异,骨质疏松组较非骨质疏松组降低,而ALP含量无显著差异?Q-PCR检测显示在第3?7天时,骨质疏松组Runx-2?ALP的mRNA表达水平均显著低于非骨质疏松组?骨质疏松组的成骨相关基因OC在3?7?14 d时mRNA表达水平均显著低于非骨质疏松组,而ON仅在第7天表达具有显著差异;矿化结节染色及钙离子定量检测显示,较之非骨质疏松组,骨质疏松组矿化结节染色浅,钙定量降低?【结论】 使用成骨诱导干细胞分化方案(地塞米松?二磷酸抗坏血酸?β-甘油磷酸钠)结果提示骨质疏松症患者的干细胞成骨分化能力较非骨质疏松患者降低?因此,选取有骨质疏松症患者自身的骨髓间充质干细胞作为治疗的种子细胞可能并不适用于临床?     

小鼠脂肪源性干细胞的成骨分化研究

目的 体外分离培养和鉴定小鼠脂肪源性干细胞,向成骨方向分化,为后续的实验选取合适的种子细胞奠定基础.方法 从白色脂肪组织中分离培养脂肪源性干细胞,应用流式细胞仪分析其表面的标记.分别通过碱性磷酸酶、茜素红和油红-O染色方法染色方法鉴定向成骨和成脂方向分化.结果 脂肪源性干细胞高表达表面标记CD29、CD44,并且能够向成骨和成脂方向分化.结论 利用胶原酶消化法,在小鼠脂肪组织中成功分离、培养出脂肪源性干细胞,获得的细胞具有多向分化潜能,为后期组织工程技术修复骨组织,提供了坚实的实验基础.     

Bmp2影响脂肪干细胞成骨能力的研究

目的 探究在大鼠脂肪干细胞内过表达骨形态发生蛋白2(Bmp2)后成骨基因的表达情况以及成骨能力的变化。方法 通过电转染Bmp2至大鼠脂肪干细胞内,以空白组作为对照,分为空白对照组(Control组)、空载组(Vector组)、成骨诱导组(Inducement组)、过表达组(Bmp2组),采用Western blot、qRT-PCR及免疫荧光对比成骨基因表达情况,采用碱性磷酸酶染色与茜素红染色观察硫化钴沉淀及钙盐沉积情况。结果 Western blot与qRT-PCR检测显示,与Control组相比,Bmp2组的Bmp2、Bmp4、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)、矮小相关转录因子2(Runx2)、磷酸化大鼠信号转导分子1/5(P-Smad1/5)、远端缺失同源框2(Dlx2)、骨涎蛋白(BSP)表达显著增高(P<0.05),而Smad1/5的表达情况差异无统计学意义;免疫荧光检测显示,与Control组相比,Bmp2组的OPN、Runx2荧光强度显著增高(P<0.05);茜素红染色及碱性磷酸酶染色结果显示,与Control组相比,Bmp2组细胞周围钙盐沉积增多,硫化钴...     

不同诱导时间下大鼠脂肪间充质干细胞成骨的差异

目的观察诱导时间的不同对大鼠脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞的影响。方法脂肪间充质干细胞（ADSCs）分诱导组和非诱导组。诱导组在细胞接种同时（A组）、50%～60%融合时（B组）、85%～95%融合时（C组）分别加入同一浓度的由地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠。非诱导组的A、B、C组由普通培养基培养不加入诱导剂。结果经钙钴染色后,诱导组大部分细胞呈阳性反应,以细胞达85%～95%融合时的结节体积最大。非诱导组未见片状阳性细胞。茜素红染色后可见红色结节,以细胞达85%～95%融合时诱导培养组形成结节较早。细胞内碱性磷酸酶活性检测表明诱导组与同期非诱导组相比细胞内碱性磷酸酶活性明显提高。结论 ADSCs经过诱导后,可向成骨细胞方向分化;诱导组细胞内碱性磷酸酶活性明显高于同期非诱导组;初始接种密度相同的情况下,ADSCs间相互接触程度越高,成骨能力越强。     

microRNA调控间充质干细胞成骨分化的研究进展

间充质干细胞是一类体内广泛存在的多能干细胞,具有多向分化潜能,为多种组织器官提供保护及损伤修复。近年来,间充质干细胞向成骨细胞诱导分化用于治疗骨代谢等相关性疾病已成为热点。microRNA（miRNA）作为生物体内重要的小分子非编码RNA,通过转录后调控影响基因表达,参与各种生命过程。研究显示,多种不同的miRNA在间充质干细胞向成骨分化过程中起着核心调节作用。本文结合相关文献,对miRNA调控间充质干细胞成骨分化的作用及机制归纳总结,以帮助全面了解靶向miRNA治疗骨代谢性相关疾病的潜能。     

兔不同部位脂肪间充质干细胞成骨能力的差异

目的观察兔不同部位来源的脂肪间充质干细胞（ADSCs）分化成骨的能力。方法分别从一只新西兰兔的腹股沟、腹膜后、颈背部取出脂肪组织并提取脂肪间充质干细胞,体外培养传至第5代,加入诱导剂分别进行成骨诱导,不加入诱导剂的为对照组。观察通过钙钴染色、茜素红染色、碱性磷酸酶活性检测细胞成骨能力。结果经钙钴染色及茜素红染色后,诱导组大部分细胞呈阳性反应,以腹股沟部脂肪间充质干细胞的结节体积最大,对照组未见明显阳性细胞。细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性检测表明诱导组比对照组ALP活性明显升高（P〈0.05）;腹股沟部脂肪间充质干细胞ALP活性较颈背部及腹膜后高,差异有统计学意义（P〈0.05）;颈背部与腹膜后相比较无明显差异（P〉0.05）。结论兔ADSCs经过体外诱导后,具有成骨能力;腹股沟部脂肪可作为骨组织工程种子细胞来源的较佳取材部位。     

微RNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

目前,对于大面积骨坏死及骨代谢疾病临床仍没有合适的治疗方法。治疗这些疾病的关键在于如何促进成骨分化,而微RNA(miRNA)作为真核细胞内的特异性调节因子,参与了大量基因的编码,在转录、翻译过程中发挥重要作用,其通过对多种信号通路的调节,促进间充质干细胞的成骨分化和骨再生。同时,miRNA的异常表达也是导致骨质疏松、骨性关节炎等骨代谢疾病的重要因素。由于miRNA数量较多,故其在调节骨代谢过程的作用机制仍不明确,未来需进一步研究,以为骨代谢疾病的特定治疗提供理论依据。