hFRNK基因对胃泌素诱导的人结肠癌细胞侵袭力的影响

目的 观察腺病毒介导hFRNK基因对胃泌素所诱导的人结肠癌Colo320WT细胞侵袭力的影响.方法 试验分为胃泌素组、hFRNK组和对照组,胃泌素组用100 μmol/L胃泌素诱导结肠癌Col0320WT细胞12 h;hFRNK组,首先用脂质体瞬时转染腺病毒受体pCR3.1-CAR于Col0320WT细胞48 h,然后用100 μmol/L胃泌素干预结肠癌Colo320WT细胞12 h,再用重组腺病毒(pAdhFRNK)感染细胞;对照组为未经处理的Colo320WT细胞.用免疫印迹检测hFRNK基因黏着斑激酶(FAK)397位酪氨酸(FAKTyr397)的磷酸化表达,激光共聚焦显微镜观察FAKTyr397在细胞板状伪足的表达情况,免疫共沉淀检测hFRNK基因对四联信号复合物FAK-Src-Doek180一p130Cas形成的影响,Pull-down法检测hFRNK对Rac蛋白活性的影响.结果 胃泌素诱导后,磷酸化FAKTyrr397明显增强;与胃泌素组相比,hFRNK组中FAKTyr397表达下降,FAKTyr397定位到细胞板状伪足的量明显减少,FAK、Src、Dockl80和p130Cas 四联信号复合物没有形成,Rac的活性降低.结论 hFRNK基因可阻断胃泌素引起的FAK的磷酸化,阻断FAKTyr397摹积到细胞的板状伪足,阻止四联信号复合物FAK-Src-Dock180-p130Cas的形成以及Rac的活化,为hFRNK基因防治肿瘤的侵袭和转移提供理论依据.     

胃泌素对结肠癌细胞中粘着斑激酶通路下游E-钙粘蛋白/β-连环蛋白复合物的影响

目的探讨胃泌素对结肠癌细胞CoLo320WT中粘着斑激酶（FAK）通路下游E-钙粘蛋白／β-连环蛋白（E-cadherin／β-catenin）复合物分布的影响；方法脂质体转染表达胃泌索受体CCK-2R的pCR3．1／OR质粒于结肠癌细胞CoLo320中。G418筛选出稳定表达CCK-2R的阳性克隆，RT-PCR鉴定，转染成功命为CoLo320WT。应用10^-8mmol／L 胃泌素（G17）以时间梯度（0h、1h、6h、12h、24h、48h）干预CoLo320WT细胞，同时应用10^-6mmol／L胃泌素受体拮抗剂L365，260干预CoLo320WT细胞30min，再予10^-8mmol／L胃泌素干预。采用免疫印迹法检测磷酸化的FAK Tyr397和总FAK的表达。采用免疫共沉淀和免疫印迹法检测CoLo320WT中TX-100溶解和未溶部分中的E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的表达。用免疫细胞化学法观察E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的在胞膜、胞质和胞核的分布。结果随着胃泌素干预时间的延长，细胞中磷酸化的FAK Tyr397的表达量呈增加趋势，12h达最大值。胃泌素受体拮抗剂L365，260阻断后磷酸化的FAK Tyr397表达减少。而胃泌素对总FAK没有明显影响。TX-100可溶性部分中E-钙粘蛋白和酽连环蛋白的量在胃泌素干预后表达减少，拮抗剂L365，260阻断后又增加。而TX-100不溶解部分中表达却相反。免疫细胞化学观察到在胃泌素干预下CoLo320WT细胞中E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的分布发生胞质和胞核转移。结论胃泌素与其受体CCK-2受体结合，磷酸化的FAK Tyr397、激活FAK通路进而影响结肠癌细胞中E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的分布，促进结肠癌细胞侵袭和转移。     

人结肠癌细胞胃泌素-黏着斑激酶通路的研究

目的研究胃泌素对人结肠癌细胞信号分子黏着斑激酶(FAK)酪氨酸磷酸化和蛋白质表达的影响。方法使用胆囊收缩素2受体(CCK2R)的真核表达载体pCR3.1/CCK2R,转染人结肠癌细胞株Colo320,上调胃泌素作用;使用胃泌素拮抗剂下调胃泌素作用。使用胃泌素按浓度和时间梯度刺激细胞,以免疫沉淀和蛋白质印迹法检测FAK酪氨酸磷酸化和蛋白质表达情况。结果胃泌素能够引起FAK酪氨酸磷酸化,具有时间和剂量依赖性;CCK2R表达上调可以增强此作用;胃泌素拮抗剂具有相反作用。结论FAK是胃泌素发挥效应的下游信号分子,以酪氨酸磷酸化的形式发挥作用。胃泌素CCKRFAK信号通路在胃泌素引起的肿瘤细胞增殖过程中发挥重要作用。     

胃泌素对结肠癌细胞株HT-29水通道蛋白4表达的影响

目的: 观察胃泌素对人结肠癌细胞株HT-29水通道蛋白4表达的影响,探讨胃泌素促进结肠癌侵润转移的另一可能机制.方法: 体外培养结肠癌细胞株,采用不同浓度的胃泌素(10-6、10-7、10-8 mol/L)干预HT-29细胞12 h,同时用10 mmol/L的胃泌素受体拮抗剂丙谷胺处理细胞1 h,再给予10-7 mol/L的胃泌素干预相同时间.采用免疫细胞化学和流式细胞技术的方法检测水通道蛋白4表达的变化.结果: 各浓度胃泌素干预后,细胞水通道蛋白4的表达与空白组和丙谷胺处理组相比均明显增加(16.08%±1.93%,17.00%±2.72%,16.48%±2.22% vs 9.28%±2.74%,8.52%±2.72%,均P＜0.01);丙谷胺处理组的表达与空白组无差别,胃泌素各浓度组间亦无差别.结论: 胃泌素能够增加结肠癌细胞水通道蛋白4的表达,丙谷胺能够阻断胃泌素的作用.     

肝癌缺失基因-1基因结构域调控人结肠癌HT29细胞增殖的实验研究

目的 探讨肝癌缺失基因-1(DLC-1)基因主要结构域在调控人结肠癌HT29细胞增殖中的作用.方法 分别构建DLC-1基因Rho蛋白GTP酶活化蛋白(RhoGAP)、SAM、START结构域敲除的亚克隆重组质粒,并转染至人结肠癌HT29细胞,另设野生型HT29细胞组(对照组)、pcDNA3.1-HT29细胞组(空载体组)和pcDNA3.1-HT29-DLC-1细胞组(全长转染组)作为对照.应用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验、平板克隆实验检测细胞增殖的改变;流式细胞术检测细胞凋亡;pull-down方法分析RhoA蛋白活性.组间差异采用方差分析.结果 转染成功48 h后,与对照组及空载体组相比,全长转染组细胞增殖(F=146.36)及RhoA蛋白活性(F＝698.08)明显抑制(P均＜0.05),细胞早期凋亡增加(F=294.08,P＜0.05).敲除RhoGAP转染组细胞的增殖能力(F＝0.99)、细胞凋亡(F=0.049)及RhoA蛋白活性(F=5.769)与对照组及空载体组相比差异均无统计学意义(P均＞0.05);敲除SAM转染组细胞比DLC-1基因全长转染组更显著地抑制了细胞增殖(F=31.00,P＜0.05),使RhoA蛋白活性下调(F=92.57,P＜0.05),凋亡增加(F=130.44,P＜0.05);敲除START转染组相对于DLC-1基因全长转染组,细胞增殖能力增强(F＝15.47,P＜0.05),凋亡细胞减少(F=110.23,P＜0.05),RhoA蛋白活性上调(F＝199.39,P＜0.05).结论 DLC-1基因抑制HT29细胞增殖具有RhoGAP依赖性,SAM结构域可能是内源性RhoGAP活性的自身抑制区域,START结构域可能协助RhoGAP结构域而起作用.     

表型遗传修饰对人结肠癌细胞周期和抑癌基因表达的调控

目的：分析和探讨同一结肠癌细胞系DNA甲基化和组蛋白乙酰化对抑癌基因表达和细胞周期的影响。方法：培养结肠癌细胞HT－29、SW1116和Colo-320，分别以去甲基化制剂5－氮脱氧胞苷（5－aza-dC）和（或）组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）抑制剂trichostatinA(TSA)及丁酸盐干预细胞。提取基因组DNA和RNA，部分行甲基化特异性PCR（MSP）检测p16^INK4A基因启动子区甲基化情况；以RTPCR研究p16^INK4A和p^21WAF1 mRNA表达水平；同时以流式细胞仪分析SW1116和Colo-320细胞周期。结果：干预前，HT－29、SW1116和Colo-320三种结肠癌细胞系中均有较弱的p16^INK4A表达；SW1116和Colo-320细胞的p21^WAF1表达缺如，对于HT－29细胞，1μmol/L的5－aza-dC干预时则无显著改变。在SW1116和Colo-320细胞中，5－aza-dC干预后p16^INK4A表达增强，且以10μmol/L或5μmol/L浓度干预24h者为最明显，相反p21^WAF1仍无明显表达，该两个细胞系经TSA或丁酸盐使细胞阻滞于G1期。结论：三种人结肠癌细胞中，p16^INK4A基因的表达均受甲基化调节。SW1116和Colo-320细胞中p21^WAF1基因表达主要受乙酰化调节，在该两个细胞系中，乙酰化使细胞周期停滞于G1期。     

RhoA/ROCK通路参与血管紧张素Ⅱ诱导的血管外膜成纤维细胞表型转化

目的 血管外膜成纤维细胞(AF)的表型转化在血管重塑过程中起了重要作用.通过观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管AF中RhoA/ROCK通路活性的影响,探讨该通路在AF/肌成纤维细胞(MF)表型转化中的作用.方法 AngⅡ刺激体外培养的SD大鼠血管AF,测定刺激后10、30 min RhoA的活性变化,并分别测定2、6、12、24 h ROCK底物肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1(MYPT1)的磷酸化水平,Western blot检测AF/MF表型转化标记蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)的表达,并观察腺病毒dominant negative N19RhoA(dnN19RhoA,MOI=200)和ROCK抑制剂Y27632(10μmol/L)对α-SM-actin表达的影响.结果 AngⅡ刺激使AF RhoA活性的明显增强及ROCK底物MYPT1的磷酸化水平明显增加.刺激30 min RhoA活性约为未刺激的3倍,刺激12 h MYPT1的磷酸化约为未刺激的3.5倍.dnN19RhoA和Y27632均可明显抑制AngⅡ诱导的血管Afα-SM-actin表达,抑制α-SM-actin表达程度均约为75％.结论 AngⅡ可激活血管AF中的RhoA/ROCK通路,该通路参与了AngⅡ诱导的血管AF/MF表型转化.     

纤维连接蛋白对人结肠癌细胞侵袭力的影响

目的研究纤维连接蛋白（fibronectin，FN）对人结肠癌细胞侵袭力的影响，并探讨其中的信号传导机制。方法以递增浓度的FN刺激结肠癌细胞株Colo320，以免疫沉淀和蛋白质印迹法检测结肠癌细胞内黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）第397位酪氨酸（tyr-397）磷酸化的状况．以改良Boyden小室法检测相应的细胞侵袭力变化。设计反义寡核苷酸阻断FAK蛋白质表达，再次观察接受FN刺激后．结肠癌细胞内FAK tyr-397磷酸化状况及细胞侵袭力的改变。结果FN能够促进Colo320 FAK tyr-397磷酸化，在一定范围内具有剂量依赖性。FN浓度达10nmol／L时．此作用最显著，继续增加FN浓度．FAK tyr-397磷酸化不再呈现继续增强趋势．当浓度达到100nmol／L时，磷酸化程度反而有所下降；FN可以增强细胞侵袭力，同样在一定范围内具有剂量依赖性；反义寡核苷酸干预后．结肠癌细胞内FAK tyr-397磷酸化及细胞侵袭力均有显著降低（P〈0.01）。结论FN可以有效增强结肠癌细胞的侵袭力，其作用是通过FN—FAK信号通路实现的，FAK的活性形式是其酪氨酸位点的磷酸化．阻断FAK的表达町以减弱FN促进细胞侵袭的作用。     

黄白抑瘤方对人直肠癌Colo320细胞凋亡与Caspase3及聚ADP核糖聚合酶表达的影响

[目的]探讨黄白抑瘤方对Colo320细胞凋亡与凋亡相关蛋白Caspase3及聚ADP核糖聚合酶（PARP）表达的影响,以明确其治疗结直肠癌的生物学基础。[方法]使用不同浓度黄白抑瘤方体外干预Colo320细胞,检测不同浓度黄白抑瘤方对Colo320细胞凋亡的影响,检测其处理后Colo320细胞内凋亡相关蛋白Caspase3、PARP的表达。[结果]黄白抑瘤方作用Colo320细胞48h后,Colo320细胞出现了不同程度的亚二倍体凋亡峰,相较对照组细胞的早凋率明显上升（P〈0．01）;凋亡相关蛋白Caspase3和PARP表达差异有统计学意义（P〈0．01）。[结论]黄白抑瘤方能参与人直肠癌Colo320细胞的胞内凋亡通路,诱导细胞凋亡,从而达到抗肿瘤的作用。     

腺病毒siRNA抑制RhoA基因并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的建立RhoA基因的腺病毒siRNA系统,并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡,分析RhoA在肿瘤细胞中的功能和作用。方法用已构建的RhoA干扰质粒构建RhoA的腺病毒siRNA系统,筛选重组病毒并感染HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测RhoA蛋白表达和基因表达水平。感染Ad-siRNA-RhoA腺病毒的肝癌细胞用TNF-α诱导后进行MTT以及细胞内DNA片段化检测。结果成功构建RhoA基因的siRNA腺病毒系统。用重组病毒感染肝癌细胞,RhoA蛋白表达抑制率为76.48%;RhoA基因的mRNA转录水平降低74.46%。MTT检测显示,感染腺病毒Ad-U6-control对照组以及感染腺病毒Ad-siRNA-RhoA实验组的细胞A值差异无统计学意义(F=5.41,P>0.01),即利用siRNA抑制肝癌细胞中RhoA表达,肿瘤细胞凋亡不明显。TUNEL检测显示,RhoA腺病毒siRNA联合TNF-α致肿瘤细胞凋亡作用显著。结论构建的腺病毒siRNA载体系统能抑制目的基因RhoA的表达,联合TNF-α能抑制肿瘤细胞生长和增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤基因功能的基础研究和肿瘤基因治疗打下了实验基础。