HPV16L1-E7重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7的构建及克隆表达

目的研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-E7重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的重组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法以HPV16型野毒株HPV16-114／K为模板,利用PCR克隆技术构建可表达HPV16主要衣壳蛋白L1(1-301aa)和转化蛋白E7(1-60aa)融合基因的重组质粒pUC19L1-E7,HPV16L1-E7DNA片段经质粒pBSLl-E7转入腺病毒Ad5穿梭质粒pCA14L1-E7,与腺病毒质粒pBHGl0共转染293细胞,制备重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7,密度梯度超迷离心纯化HPV16嵌合L1-E7VLP。结果成功构建了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7,制备HPV16L1-E7重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7,HPV16L1-E7融合蛋白可在293细胞中高效表达,可达细胞总蛋白的10％以上,并装配成嵌合病毒样颗粒(cVLP)。结论成功制备了可高效表达IPV16L1-E7嵌合L1-E7VLP的重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7载体疫苗,为HPV重组腺病毒疫苗用于宫颈癌的防治打下了基础。构建的pUC19L1载体可以比较方便的插入外源基因,用来构建多价疫苗,因此在制备HPV16多价疫苗方面具有广泛的应用价值。     

人乳头瘤病毒基因工程疫苗的基础实验研究

人乳头瘤病毒(HPV)16型感染与宫颈癌的发生、发展密切相关,故研制HPW16型基因工程疫苗对预防HPV感染、控制宫颈癌的发生有重要意义。本研究构建HPV16 L1基因工程菌并进行了基础实验研究。首先采用PCR技术从3例宫颈癌组织中扩增和克隆了HPV16L1基因片段并进行测序。进而构建了pPIC3.5～HPV16L1真核表达工程菌、pQE31～HPV16L1和pGEX4T-HPV16LI原核表达工程菌及杆状病毒-昆虫细胞表达系统。经SDS-PAGE、Westem blot和电镜等手段证明了工程菌表达HPV16 L1蛋白的分子特性和免疫原性,而且,重组菌表达的HPV16 L1可以形成类病毒颗粒(VLP)。经免疫BALB/C小鼠可获得高效价特异血清,证实重组HPV16 L1蛋白具有良好的免疫原性。为进一步研制临床应用疫苗及血清学诊断试剂提供了实验基础。     

减毒沙门氏细菌为载体的人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体构建

目的 :构建一种廉价高效的防治宫颈癌的人乳头瘤病毒新型双启动子DNA疫苗。方法 :设计合成细菌厌氧诱导启动子Nir ,含有FNR顺式反应元件、RBS和真核基因Kozak元件 ,插入pTriEx真核启动子CMVIE下游 ,构建pCMVnir双启动子载体。将人乳头瘤病毒 16型L1L7,融合基因 ,插入pCMVnir,制备pCMVnirL1E7,转化减毒沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧诱导表达 ,SDS PAGE和Westernblot分析检测Nir启动子的活性。结果 :经DNA序列和限制性内切酶鉴定分析 ,成功构建了HPV双启动子DNA疫苗载体pCMVnirL1E7,转化沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧条件下可诱导表达HPVL1E7蛋白质。结论 :成功构建了一种与胞内寄生细菌(减毒沙门氏细菌 )匹配的双启动子DNA疫苗新型载体 ,并构建了HPV16pCMVnirL1E7新型DNA疫苗     

HPV L1病毒样颗粒疫苗诱导机体免疫反应的研究现状

HPV感染与宫颈癌发展密切相关,HPV病毒样颗粒(VLP)在体外由病毒的主要衣壳蛋白L1自发装配而成。HPV VLP成为候选疫苗,它能很有效的减少感染并且诱导很强的抗病毒免疫。免疫后产生的中和抗体具有型特异性,接种VLP后也能产生细胞免疫,疫苗可诱导出至少持续5年的高滴度抗L1VLP抗体,比自然感染高10倍。疫苗诱导的长期保护效应通常是免疫记忆的特征。     

Isolation and cloning of human papillomavirus 16 L1 gene from Iranian isolate

OBJECTIVE: To isolate and construct cloning and expression vectors containing human papillomavirus (HPV16-L1) gene as target for application as recombinant vaccine. METHODS: The study was performed in 2007 in Tarbiat Modares University, Tehran, Iran. Four genital specimens DNAs were amplified with the use of HPV type-specific primers based on HPV-16 L1, E6, and E7 genes. The polymerase chain reaction products were cloned into suitable cloning and expression vectors and were confirmed by restriction enzyme analysis and sequencing. RESULTS: The desired plasmids were sequenced and indicated 99% homology with those submitted full length L1 sequences in the GenBank. CONCLUSION: The results showed that there was 99% homology between our product and those mentioned in the GenBank. Nowadays empty viral capsids, termed virus-like particles, are synthesized with the use of microbial or cellular expression systems. Therefore, it can be concluded that the Iranian HPV16 full length L1 sequence is very similar to the other sequences in the GenBank and it can be used as a candidate gene in prophylactic vaccine for cervical cancer.     

宫颈癌妇女人乳头瘤病毒16E6/E7基因变异分析

目的了解宫颈癌妇女人乳头瘤病毒(HPV)16E6/E7基因变异的情况,为HPV防治提供流行病学数据。方法从大量样本中筛选出HPV16阳性标本180例,其中宫颈癌患者100例,宫颈不典型增生患者50例,宫颈炎症患者30例,对宫颈脱落细胞样本采用PCR方法扩增HPV16 E6/E7基因,然后对反应产物采用DNA测序法获得基因序列,在GeneBank进行经BLAST分析,寻找变异位点。结果宫颈癌患者中E6核苷酸变异率为82.00%(82/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);宫颈癌HPV16E6最频繁的序列变异为T178G(60/100),其他常见变异为T350G、C335T/A442C、T178G/G39T,年轻宫颈癌组E6核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但两者T178G变异率存在明显差异(=0.000)。宫颈癌患者HPV16 E7核苷酸变异率为74.00%(74/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);E7最频繁序列变异为A647G 32.00%(32/100),其他常见的变异为A647G/C749T/T843C/T846C、A647G/C749T/T846C、C749T/C790T、A647G/C749T;年轻宫颈癌组E7核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但A647G变异率存在明显差别(=0.03)。结论宫颈癌患者明显存在HPV16E6E7核苷酸变异,HPVE6 T178G、E7 A647G可能与宫颈癌年轻化密切相关,故对该人群的检测并及时尽早采取干预措施。     

宫颈癌组织中HPV16 E6、E7蛋白水平与患者临床病理特征及预后的关系

目的 探究宫颈癌组织中16型人乳头瘤病毒E6蛋白（human papilloma virus type 16 E6 protein,HPV16 E6）、16型人乳头瘤病毒E7蛋白（human papilloma virus type 16 E6 protein,HPV16 E7）水平与患者临床病理特征及预后的关系。 方法 选取行宫颈癌根治术87例患者的肿瘤组织、癌旁组织、正常宫颈组织标本进行研究,采用免疫组织化学法检测组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达情况,并结合患者临床病理特征进行分析,采用Kaplan-Meier生存曲线比较患者3年生存情况,采用COX回归分析各项因素对患者预后的影响。 结果 免疫组化结果显示肿瘤组织中HPV16 E6、HPV16 E7阳性率高于癌旁组织和正常组织（P＜0.05）; HPV16 E6及HPV16 E7蛋白阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者（P＜0.05）;多因素分析显示HPV16 E6、HPV16 E7阳性是宫颈癌患者预后不良的独立危险因素（P＜0.05）。 结论 HPV16 E6、HPV16 E7蛋白在宫颈癌组织中阳性表达,与患者临床病理特征和预后相关,可能作为治疗宫颈癌的新靶点发挥作用。     

宫颈癌癌前病变中人乳头状瘤病毒16整合状态的检测

目的　探讨宫颈癌癌前病变中人乳头状瘤病毒(HPV)16DNA整合入宿主基因组的发生情况。方法　选取 108例细胞学为宫颈癌癌前病变的患者,应用多重聚合酶链反应 (PCR)同时检测液基细胞标本中的HPV16L1、E_2和E_6基因。采用通用引物GP_(5+) /GP_(6+)扩增HPVL1基因保守区的一个长 150bp的片断,以检测HPV的存在。E_2PCR引物目标是HPV整合时最常缺失的E_2开放阅读框(ORF)的特殊区域,E_6引物目标是E6ORF。在游离型中,E_2、E_6拷贝数比例相等;在整合型中,E_2缺失;在游离、整合的混合型中,E2的拷贝数少于E_6。对E_2、E_6的PCR产物凝胶电泳条带的面积灰度值进行半定量分析,从而确定HPV16的整合状态。结果　HPV感染者 62例 (57. 41% );HPV16感染者 32例 ( 29. 63% ),其中 15例 ( 46 .88% )为纯游离型; 13例 ( 40 .62% )为混合型; 4例(12. 50% )为纯整合型。HPV16DNA整合和 /或混合型的比例随宫颈病变级别升高而增加,不同病变之间差异有统计学意义(P<0 .01)。结论　HPV16整合入宿主基因组在部分宫颈上皮内瘤变中即已发生。多重PCR同时检测HPVL1、HPV16E_2、E_6基因以及E_2 /E_6比值,是一种在宫颈细胞学标本中同时检测HPV感染、HPV16感染和HPV16整合状态的简便方法。它可以作为细胞学筛查的一种补充手段,以发现向宫颈高     

高危HPV16 E4基因的表达纯化及临床应用

目的:构建人乳头瘤病毒(HPV)16 E4重组表达体并表达纯化获得HPV16 E4重组蛋白,用于检测不同人群血清相应抗体,初步探讨本地区HPV16 E4血清抗体反应与宫颈癌的相关性.方法:将HPV16 E4基因与pRSET-A融合表达载体连接,获得E4表达重组体,转化大肠杆茵BL21(DE3)并用IPTG诱导表达.表达的包涵体变性后经Ni柱纯化,复性并经活性鉴定后,用以包被酶联免疫吸附实验(ELISA)板,检测正常女性、慢性宫颈炎和宫颈癌患者血清抗体.结果:pRSET-16E4表达重组体的工程茵经IPTG诱导后可表达M15×103的HPV16 E4组氨酸融合蛋白,表达量占菌体蛋白的30%.表达形式为包涵体,重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,纯度达95%以上,其活性经ELISA法证实.80例正常女性、46例慢性宫颈炎和32例宫颈癌患者中,其血清抗体阳性率分别为10.00%,39.13%和28.13%,宫颈癌患者HPV16 E4血清抗体阳性率显著高于正常人,且慢性宫颈炎患者HPV16 E4血清抗体阳性率也显著高于正常人,但宫颈癌组HPV16 E4血清抗体阳性率与慢性宫颈炎组间的差异无统计学意义.结论:在pRSET-A/BL21中表达获得的HPV16 E4融合蛋白,可用于宫颈癌相关HPV的血清学研究;宫颈癌和慢性宫颈炎患者HPV16 E4血清抗体阳性率均明显高于正常人.     

Encapsidating artificial human papillomavirus-16 mE7 protein

Background Human papillomaviruses （HPVs） can infect squamous or mucosal epithelia and cause cervical cancer or genital warts. Coinfection with multiple HPV types is a common finding of many epidemiological studies. Therefore, it is necessary to develop a vaccine, which can eradicate established HPV infections and prevent other HPV infections. In this study, we generated chimeric virus like particles （cVLPs） composed of HPV-6b L1, HPV-6b L2 and one artificial HPV-16 mE7 proteins. Methods The artificial HPV-16 mE7 gene was designed by codon modification, point mutation and gene shuffling then chemically synthesized and subcloned behind HPV-6b L2. HPV-6b L1 and L2-mE7 were expressed in insect cells by using Bac-to-Bac system. The generated cVLPs were purified by CsCI gradient ultracentrifuge and analyzed by immunoblot, electron microscope and haemagglutination assay. Results The HPV-6b L1 and L2-mE7 proteins were well expressed in insect cells and could selfassemble into cVLPs, whose diameter was about 55 nm and similar to that of HPV-6b L1/L2 VLPs. Intact cVLPs could be recognized by H6.M48 neutralizing monoclonal antibody and HPV-6b L2 polyclonal antibody, while the denatured cVLPs, but not the intact cVLPs, were reactive to HPV-16 E7 polyclonal antibody. HPV-6b LI/L2-mE7 cVLPs haemaggiutinated mouse erythrocytes as efficiently as HPV-6b L1/L2 VLPs did. Conclusions The insertion of the 158 amino acid HPV-16 mE7 protein behind L2 did not disrupt the correct assembling of cVLPs. The morphological characteristics and haemagglutinating activity of cVLPs were similar to those of HPV-6b LI/L2 VLPs. The cVLPs retained conformational B cell epitopes of HPV-6 VLPs and HPV-16 mE7 protein had an internal location in the cVLPs. Therefore, large modified E7 protein with higher immunogenicity could be incorporated into cVLPs by fusing to the C-terminus of L2, which would help to improve the therapeutic effects of LI/L2-E7 cVLPs.     

HPV致宫颈癌机制研究进展

人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是一类无包膜的具有嗜上皮特性的双链DNA病毒,由核酸及衣壳蛋白构成,其基因组可分为早期编码区（E区）、晚期编码区（L区）和长控制区（LCR）,研究表明高危型HPV的持续感染与宫颈癌的发生密切相关,当HPV病毒感染机体后,其基因组可随机整合到宿主细胞DNA中,随后沉默E2基因的表达,削弱E2蛋白对E6、E7基因的抑制,使E6、E7蛋白过表达,辅以E5蛋白的表达,促使感染细胞永生化甚至癌变。因此研究HPV的病毒结构及其致病机制对防治HPV感染及预防HPV相关恶性肿瘤,尤其是宫颈癌的发生、发展尤为重要。本文拟就HPV的病毒结构、致病机制研究进展进行综述。     

HPV16E6与吲哚胺2，3-二氧化酶在宫颈病变组织中的表达

  目的   检测高危HPV感染的正常宫颈组织、宫颈癌前病变组织、宫颈癌组织HPV16E6和IDO的表达,分析二者在宫颈病变组织恶化过程中的关系,探讨其作为宫颈癌肿瘤标志物的可能性。   方法   把经第二代杂交捕获（HC-2）法行HPV DNA检测为高危型HPV感染的宫颈病变者120例为实验对象,正常宫颈组织、宫颈癌前病变组织、宫颈癌组织各40例。免疫组化染色法检测各组织中HPV16E6和IDO的表达情况。   结果   40例正常宫颈组织中HPV16E6和IDO阳性表达率分别为7.5%、0%;40例宫颈癌前病变组织中HPV16E6和IDO阳性表达率分别为37.5%、22.5%。40例宫颈癌组织中HPV16E6和IDO阳性表达率分别为90%、80%。在宫颈病变组织恶化过程中HPV16E6和IDO的阳性表达呈正相关（r_s = 0.710,P = 0.000）。   结论   HPV16E6和IDO的表达随宫颈病变的进展而呈现出阳性程度逐渐递增趋势,HPV16E6和IDO可考虑成为预测宫颈病变组织恶化的肿瘤标志物。      

人乳头瘤病毒16型、18型DNA在涎腺肿瘤组织中的表达

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)16型、18型与涎腺肿瘤病因学之间的关系.方法采用特异引物PCR法为44例涎腺肿瘤组织标本中31例HPVs阳性组织DNA进行分型检测.结果检出HPV16E7阳性率为13.60%,HPV18E7阳性率为47.72%,涎腺肿瘤组织中HPV18E7阳性率明显高于HPV16E7阳性率;恶性肿瘤组中HPV16E7和HPV18E7阳性率显著高于良性肿瘤组(P＜0.05).结论HPV18型感染与涎腺肿瘤的发生密切相关;HPV16,18型E7基因在恶性肿瘤的发生中起重要作用.     

共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组非复制型痘苗病毒的构建

目的：构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E67蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法：以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果：该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插人;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E67蛋白。结论：非复制型重组痘苗病毒NTVJE67CKL IL2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗。     

宫颈病变患者人乳头瘤病毒16亚型E2基因多态性检测

目的分析宫颈病变中人乳头瘤病毒（HPV）16亚型E2基因的多态与宫颈病变的关系,了解E2基因变异情况及其与宫颈
病变的相关性。方法应用PCR和高分辨率熔解曲线方法针对379例HPV高危亚型阳性宫颈脱落细胞样本进行HPV16感染
情况及HPV16亚型E2基因68位点和133位点多态分布情况进行检测。结果379例HPV高危亚型阳性宫颈标本共检出78例
HPV16亚型阳性,其在宫颈癌、CINⅡ~Ⅲ、CINⅠ、炎症患者中的检出率分别为44.8%、31.5%、24.1%和9.6%;HPV16E2基因
68C和133G的频率在中重度宫颈内瘤样病变和宫颈癌中明显高于轻度上皮内瘤样病变和炎症患者（P<0.05）。结论HPV16是
导致宫颈恶性病变的重要致病因素;随着病理类型的进展,HPV16感染率也逐渐增加;同时基因位点改变说明HPV16E2基因
单核苷酸变异可能使致癌能力发生改变。
     

CD40L融合改造后的人乳头瘤病毒16型E7基因DNA疫苗的构建及其免疫原性测定

目的研究针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的DNA疫苗,测定其免疫原性,用于治疗HPV16感染及感染相关恶性肿瘤。方法联合采用基因切割重排、定点突变及密码子优化等策略改造HPV16的转化基因E7,基因合成法获得改造后的E7基因(mE7);PCR法将mE7基因与CD40L胞外区编码序列融合,然后以pVR1012为载体构建pVR1012-mE7(mE7)及pVR1012-mE7/CD40L(mE7/CD40L)表达质粒;经肌肉免疫C57BL/6小鼠;ELISA法检测E7特异性血清抗体水平,ELISPOT法分析E749-57(H-2b)特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞活化水平,胞内染色-流式细胞检测分析E7特异性CD4 Th细胞活化水平;并在C57BL/6小鼠体内进行疫苗抗瘤活性检测。结果与野生型E7基因(wE7)相比,mE7基因诱发产生的E7特异抗体水平(P<0.01)、分泌IFN-γ的CD8 T细胞数目(P<0.01)及CD4 Th细胞活化水平(P<0.05)均显著提高;与mE7基因相比,mE7/CD40L融合基因可进一步显著提高E7特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞数目(P<0.01),但对E7特异性抗体产生及CD4 Th细胞活化水平没有明显影响。疫苗小鼠体内预防性免疫实验中,经wE7免疫的小鼠接种瘤细胞后2周内全部形成移植瘤,而所有经mE7及mE7/CD40L免疫的小鼠在瘤细胞攻击后第7周仍未见移植瘤形成;疫苗体内治疗性免疫实验中,小鼠在接种wE7后第8天左右全部形成移植瘤,并呈渐进性生长,而接种mE7的小鼠移植瘤清除率为30%,接种mE7/CD40L的小鼠移植瘤清除率增高至45%。对移植瘤的组织学检查结果显示,mE7/CD40L及mE7免疫组小鼠瘤细胞间及瘤组织周围可见大量淋巴细胞浸润,而wE7组小鼠的瘤细胞呈编织状紧密排列,未见有淋巴细胞浸润。结论HPV16型mE7/CD40L融合基因疫苗免疫小鼠后可诱发较强的E7特异性细胞免疫及体内抗瘤活性,具有较强的免疫原性。     

人乳头瘤病毒16型E5基因在宫颈癌发生进程中的动态研究

  目的  观察人乳头瘤病毒(HPV)16型E5基因在宫颈癌发生发展过程中的动态变化情况,探讨E5 mRNA在宫颈癌早期筛查中的临床意义。  方法  收集2015年9月至2017年12月在四川省妇幼保健院宫颈门诊就诊或行宫颈癌机会性筛查人群的宫颈病变组织石蜡标本49例(HPV阳性),按照FIGO标准将收集的宫颈病变标本进行分期:宫颈炎13例,宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ 5例,CIN Ⅱ 18例,CIN Ⅲ 5例,宫颈癌8例。利用实时荧光定量PCR检测不同病理分级宫颈组织中E5基因的完整度及E5、E6、E7 mRNA的表达水平。  结果  在49例HPV16阳性感染患者中,CINⅠ宫颈病变组织中E5基因的完整度比宫颈炎、CINⅡ及宫颈癌组织更高(P＜0.05);CINⅠ宫颈病变组织中E5基因完整度虽高于CINⅢ组织,但差异无统计学意义。不同病理级别标本中E5、E6、E7 mRNA的表达水平均在CINⅢ组织最高。与E6、E7 mRNA相比,E5 mRNA在宫颈病变的全过程中均呈现出优势表达状态(P＜0.05),而E6、E7 mRNA的表达水平只在病变后期(CINⅢ和宫颈癌)有升高趋势。  结论  在HPV16阳性感染患者的病变组织中,E5基因的完整度可能与宫颈疾病的发生、发展有关。E5基因有望成为宫颈癌早期筛查的靶基因。     

人乳头瘤病毒6b型病毒样颗粒免疫活性的研究

目的：了解人乳头瘤病毒（HPV）6b型病毒样颗粒（VLP）的免疫活性及其诱导的保护性抗体对HPV11型VLP和牛乳头瘤病毒1型（BPV1）VLP的交叉免疫反应。方法：将HPV6b、HPV11和BPV1晚期基因L1的开放读码框架（ORFs）分别重组到杆状病毒中,该重组病毒在感染的昆虫细胞（Sf9细胞）中表达,表达的L1蛋白可自行组装成HPV6b、HPV11和BPV1 VLP。取50μg纯化的HPV6bVLP分别在第0天和第21天经肌肉免疫Balb/c鼠。第二次免疫后1周及3个月取血,检测血清抗HPV6b、HPV11和BVP1 VLP和BPV1 VLP IgG滴度;血凝集抑制试验检测HPV6bVLP免疫产生的抗血清是否能阻止HPV11 VLP和BPV1 VLP与鼠红细胞凝集。结果：免疫后1周,应用ELISA方法检测抗HPV6b VLP、HPV11 VLP和BVP1 VLP血清IgG滴度分别为1：6400、1：600和1：600。3个月后,抗HPV6bVLP、HPV11 VLP 和BVP 1VLP血清IgG滴度分别为1：800、1：400和1：100。血凝集抑制试验显示HPV6bVLP产生的抗血清能够阻止高度同源性的HPV6b VLP和HPV11 VLP与鼠红细胞结合。结论：HPV6b VLP具有很强的免疫原性,免疫后产生的抗血清具有阻止HPV6b VLP和HPV11 VLP与细胞结合的能力。HPV6b和11型间确实存在交叉反应的中和表位,HPV6b VLP有可能用于防治HPV6b及HPV11感染的疫苗。     

HPV16 E7"自杀性"DNA 疫苗的构建及其体外表达特性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因的"自杀性"DNA疫苗,并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32/E7质粒为模板,用PCR方法扩增HPV16 E7基因,构建真核表达重组质粒pSCA/E7,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转染BHK-21细胞,然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达,用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400 bp的目的基因片段,测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100%同源。免疫荧光技术检测证实,pSCA/E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实,pSCA/E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA/E7,该重组质粒可在BHK-21细胞中表达,并能诱导被转染的细胞发生凋亡。