联合应用以MRP和bcl-2为靶标的siRNA对鼻咽癌细胞耐药和凋亡的调节

[摘要] 目的 研究联合转染以MRP和bcl－2为靶标的siRNA后,鼻咽癌细胞株CNE2和耐药细胞CNE2/DDP的药物敏感性和凋亡率的改变。方法 以MRP和bcl－2为靶标的siRNA(均为100 umol/L)分别或联合转入顺铂处理的CNE2和CNE2/DDP以单纯化疗处理组和未处理组为对照。转染后24,48,72 h MTT法检测各组生长抑制率,计算IC50值。RT-PCR检测转染12 h各组细胞相应靶基因mRNA表达水平,流式细胞仪检测转染48 h各组MRP和bcl－2蛋白表达率和细胞凋亡率。结果 细胞分别转染以MRP和 bcl－2为靶标的siRNA后,相应靶基因的mRNA及蛋白的表达明显减低,细胞的凋亡率生高,IC50均较单纯化疗组低,有统计学意义（P<0.05）,两者间也有统计学差异（P<0.05）;联合转染两种siRNA后细胞的IC50进一步显著下降,细胞凋亡率显著升高,与各组相比均有统计学差异（P<0.01）。结论 联合以MRP和bcl－2基因为靶标的siRNA,通过降低靶基因蛋白表达,产生协同作用,明显增加耐药和亲本肿瘤细胞药物敏感性和凋亡率。 [关键词] Bcl-2 MRP siRNA 鼻咽肿瘤     

联合应用以MRP和bcl-2为靶标的siRNA对肺癌细胞耐药和凋亡的影响

目的研究联合转染以MRP和bcl-2为靶标的siRNA,肺癌细胞株SW1573和SW1573／R20药物敏感性及凋亡的改变。方法以MRP和bcl-2为靶标的siRNA（均为100μmol／L）分别或联合转入柔红霉素处理的SW1573和SW1573／R20与单纯化疗处理组和未处理组对照。转染后24、48、72h MTT法检测各组生长抑制率,计算IC50值。RT-PCR检测转染12h各组相应靶基因mRNA表达水平,流式细胞仪检测转染48h各组MRP和bcl-2蛋白表达率和细胞凋亡率。结果细胞转染siRNA后,相应靶基因mRNA及蛋白表达明显减低,细胞的凋亡率升高,IC50均较单纯化疗组低,有统计学意义〈0．01）;联合应用两种siRNA后细胞IC50进一步下降,细胞凋亡率显著升高,与各组相比均有统计学差异俨〈0．05）。结论联合以MRP和bcl-2基因为靶标的siRNA,通过降低靶基因蛋白表达,产生协同作用,明显增加耐药和亲本肿瘤细胞药物敏感性和凋亡率。     

SiRNA逆转人红白血病细胞株(K562/ADM)阿霉素耐药性的实验研究

目的:研究小分子干扰RNA片段(small inteffering RNA,siRNA)对人红白血病细胞株K562/ADM细胞mdr1基因表达及药物敏感性的影响,探索新的耐药逆转途径.方法:siRNA根椐GeneBank已知序列设计,在脂质体介导下转染K562/ADM细胞;用流式细胞仪检测K562/ADM细胞Pgp的表达;用MTT检测其对阿霉素ADM的敏感性;用PCR-ELISA法检测K562/ADM细胞的端粒酶活性.结果:siRNA转染后K562/ADM细胞Pgp的表达明显下降,对阿霉素ADM的IC50从8.7μg/ml降到5 μg/ml,端粒酶活性明显下调.结论:siRNA有效逆转了mdr1介导的耐药性,不失为一种新型、有效的肿瘤耐药逆转途径.     

汉防己碱对白血病K562细胞生长的促进耐药作用

目的考察汉防己碱(Tet)对白血病K562细胞生长的影响。方法采用体外细胞培养,即在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,培养液为含10%热灭活NBS的完全RPMI1640细胞培养基。待K562细胞与药物作用48 h后,收集并处理细胞,结合MTT和Western blot法研究Tet对K562细胞生长的作用特点。结果 Tet在0.33～1.00μg/ml仅使K562及K562/ADM细胞的存活率降低至75%～80%,低浓度Tet(0.33μg/ml)使阿霉素(ADM)和顺铂(cDDP)对K562细胞生长的IC50增加(P<0.01),1.0μg/ml Tet则降低IC50,使ADM对K562/ADM细胞的IC50增加,cDDP的IC50无明显变化。0.33μg/ml Tet有提升2种细胞的P-gp和MRP1表达的作用(P<0.05)。Tet各浓度对LRP表达无明显影响。结论 Tet对K562及K562/ADM细胞生长抑制作用具浓度依耐性,低浓度具加速耐药的作用,其促进耐药细胞发展的机制至少与提升P-gp和MRP1表达有关。     

葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系

目的观察葡萄糖神经酰胺合酶（GCS）基因在人红白血病多药耐药细胞株K562/AO2的表达及其与肿瘤多药耐药性（MDR）的关系。方法运用Alamar Blue^TM多功能细胞染色法证实K562/AO2的多药耐药性;采用RT-PCR技术检测K562/AO2及其亲本K562细胞株的GCS基因、MDR1基因、bcl-2基因、bax基因的表达水平及其差异。结果（1）阿霉素（ADR）对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为75μg/ml和0.65μg/ml,耐药指数为115;长春新碱（VCR）对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为8μg/ml和0.22μg/ml,耐药指数为36。（2）K562/AO2细胞GCS基因和MDR1基因的表达明显强于K562细胞;K562/AO2细胞bcl-2基因表达强于K562细胞,而bax基因表达弱于K562细胞。结论GCS基因可能在白血病多药耐药中起着重要的作用,而细胞凋亡基因的表达异常可能是它导致肿瘤多药耐药的主要分子病理机制之一。     

汉防己甲素逆转白血病细胞株K562/A02耐药的机制

目的:研究汉防己甲素（TTD）对白血病细胞株K562/A02多药耐药(MDR)逆转的机理。方法：以白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为TTD作用的靶细胞。细胞水平检测实验分5组（K562组、K562/A02组、K562+ADM组、K562/A02+ADM组和K562/A02+TTD+ADM组）,采用MTT法检测TTD对K562和K562/A02细胞的非细胞毒性剂量,流式细胞术检测细胞内阿霉素(ADM)的浓度,基因、酶学、蛋白水平检测实验分3组（K562组、K562/A02组和K562/A02+TTD组）,采用RT-PCR法检测mdr1 mRNA的表达,免疫细胞化学方法检测谷胱甘肽S转移酶π（GST-π）和拓扑异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ）的表达水平,Western-blotting法检测P-糖蛋白（P-gp）和bcl-2表达。结果：1.562 5 mg•L^-1的TTD处理K562/A02细胞后,细胞内ADM的浓度较单用ADM组明显提高（P<0.01）;与空白对照组比较,K562/A02细胞内mdr1 mRNA/P-gp的表达量减少（P<0.01）;GST-π和TopoⅡ表达无明显变化;凋亡抑制基因bcl-2的表达量减少（P<0.01）。结论:TTD主要通过增加细胞内ADM浓度,下调mdr1/P-gp和bcl-2表达逆转耐药。     

RNA 干扰沉默同源异型基因A5 逆转K562/ADM 细胞耐药性的研究

目的 研究RNA 干扰（RNAi）技术沉默同源异型基因A5（HOXA 5）对白血病耐阿霉素细胞株K562/ADM 细胞耐药性的影响并探讨其机制。方法 Western blot 检测各组细胞中HOXA5、p38 和p-p38 的蛋白表达，qRT-PCR 检测HOXA5、p38 的mRNA 表达；CCK8 检测各组细胞对阿霉素的敏感性变化；流式细胞术（FCM）检测各组细胞的凋亡及周期变化。结果 K562/ADM 细胞中HOXA 5 基因的 表达高于K562 细胞，且其耐药性是K562 细胞的4.94 倍。转染后实验组K562/ADM 细胞中HOXA 5 基因的表达受抑制，而实验组细胞的IC50 较对照组降低2.55 倍。同时，实验组细胞中p38 的mRNA 及p-p38的蛋白表达高于对照组。与对照组比较，实验组的细胞周期G0/G1 期增高，S 期降低。经ADM（2.5μg/ml）诱导后，实验组细胞凋亡率高于对照组。结论 RNAi 沉默HOXA5 能在一定程度上逆转白血病耐药，其机制可能与p38MAPK 信号转导通路的激活有关。     

Embelin逆转白血病耐药细胞株K562/D对柔红霉素的耐药性

目的 证明酸藤子(embelin)可以逆转白血病耐药细胞株K562/D对柔红霉素(DNR)的耐药性.方法 应用MTT法求出embelin作用于K562/D 24 h后的IC10以及K562/D对DNR的耐药指数和逆转倍数;应用annexin V FITC/PI复染流式细胞仪检测细胞凋亡;应用JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位(△Ψm).结果 K562/D细胞对DNR耐药,耐药指数为7.72;小剂量embelin(5μg/ml)可以逆转K562/D细胞对DNR耐药性,逆转倍数为7.46;embelin(5μg/ml)与DNR(0.1 μg/ml)联合作用于K562/D细胞6 h后△Ψm即出现明显去极化,细胞凋亡率呈时间依赖性升高,与对照组比较有统计学差异.结论 embelin 可以通过促进细胞凋亡逆转K562/D对DNR的耐药性,并且在凋亡早期△Ψm已经出现明显去极化,说明凋亡不可逆转.     

bcr/abl基因特异性小干扰RNA对K562细胞增殖凋亡和SH2肌醇磷脂酶基因表达的影响研究

目的 通过小干扰RNA（siRNA）沉默K562细胞bcr/abl基因使SH2肌醇磷脂酶（SHIP）基因表达增加,探讨SHIP基因缺失对K562细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 构建bcr/abl基因的化学合成siRNA,并转染到K562细胞,分为转染特异性siRNA实验组、转染非特异性siRNA对照组、空白对照组。Western blotting法检测转染后K562细胞p210表达量,实时荧光定量PCR（FQ-RT-PCR）检测各组细胞中SHIP mRNA表达量;Western blotting法检测SHIP、磷酸化蛋白激酶B 308（p-Akt308）和磷酸化蛋白激酶B 473（p-Akt473）的表达量;MTT比色法检测K562细胞增殖率;流式细胞仪检测K562细胞凋亡率;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测核因子（NF）-κB活性。结果 转染特异性siRNA实验组K562细胞p210表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低,SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、细胞凋亡率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组升高（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞p210表达量、SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量、细胞凋亡率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第1天、第3天、第5天转染特异性siRNA实验组K562细胞增殖率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞增殖率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第3天、第5天转染特异性siRNA实验组NF-κB活性较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组NF-κB活性比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 SHIP基因表达受bcr/abl基因的调控,SHIP表达缺失可能是K562细胞过度增殖和凋亡减少的重要因素。     

siRNA对人红白血病细胞株（K562／ADM）阿霉素耐药性的影响

目的：研究小分子干扰RNA片段（small interfering RNA，siRNA）对人红白血病细胞株（K562／ADM）细胞mdr1基因表达及功能的影响，探索一新的耐药的逆转途径。方法：siRNA根椐GeneBank已知序列设计，在脂质体介导下转染K562／ADM细胞：用流式细胞仪检测K562／ADM细胞Pgp的表达及细胞周期的改变；用TUNEL法检测其凋亡；用MTTT检测其对阿霉素ADM的敏感性。结果：siRNA转染后K562／ADM细胞Pgp的表达明显下降，凋亡率明显提高，对阿霉素ADM的敏感性明显提高。结论：siRNA有效逆转了mdr1介导的耐药性，不失为一种新型、有效的肿瘤耐药逆转途径。     

Bcl-2反义核酸增强青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡

目的:研究bcl-2反义核酸增强青蒿琥酯对人慢性粒细胞白血病K562细胞株诱导凋亡效应. 方法:合成bcl-2反义核酸(ASON)导入K562细胞,应用Western blot法检测bcl-2蛋白的表达,TUNEL技术、流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡. 结果:bcl-2反义核酸(ASON)能明显抑制bcl-2蛋白的表达. 青蒿琥酯在1～7 mg/L浓度范围内能分别明显抑制K562细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性, 7 mg/L青蒿琥酯作用72 h的K562细胞株A值最低. 原位细胞凋亡检测可见细胞变小,核固缩为一个或多个染色质团块,与未经ASON转染的K562细胞株相比,经bcl-2 ASON转染的K562细胞株对青蒿琥酯的诱导凋亡作用更加明显;FCM法出现低于G1期DNA含量的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡主要发生在G1/S期,与未经ASON转染的K562细胞株相比,经bcl-2 ASON转染的K562细胞凋亡率显著增加. 结论:青蒿琥酯在体外一定浓度范围内可诱导K562细胞株凋亡,bcl-2反义核酸可增强青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡的作用.     

海生素对K562/ADM抑制作用及其机理的初步研究

目的探讨海生素对K562/ADM细胞的抑制作用及其对凋亡相关蛋白bcl-2、bax表达的影响。方法采用MTT法测定海生素对K562/ADM细胞的体外抑制作用,免疫细胞化学法检测bcl-2、bax蛋白的表达。结果海生素对K562/ADM细胞有抑制作用,可下调bcl-2蛋白表达,上调bax蛋白表达。结论海生素在体外能明显抑制K562/ADM细胞生长,并影响bcl-2、bax蛋白的表达。     

参芪扶正注射液对K562/ADM多药耐药的影响

目的研究参芪扶正注射液对K562耐药细胞株（K562／ADM）多药耐药的影响。方法采用MTT法检测参芪扶正注射液的细胞毒性；采用PI单染色流式细胞术检测ADM加以及不加参芪扶正注射液处理K562／ADM后的细胞凋亡率；采用直接免疫荧光法流式细胞术检测参芪扶正注射液处理K562／ADM细胞的Bcl-2基因表达水平。结果（1）参芪扶正注射液在10μL／mL时对K562／ADM增殖无抑制作用；（2）参芪扶正注射液明显增加ADM对K562／ADM的毒性作用（P〈0.05），参芪扶正注射液在10μL／mL时耐药逆转倍数为1．71；（3）参芪扶正注射液可明显增强ADM对K562／ADM的促凋亡作用（P〈0．05）；（4）参芪扶正注射液可明显抑制K562／ADM的Bcl-2基因表达（P〈0.05）。结论参苠扶正注射液可以逆转K562／ADM耐药性，其可能机制是促进细胞凋亡和下调Bcl-2表达。     

Reversal effect of bufalin on multidrug resistance in K562/VCR vincristine-resistant leukemia cell line

ObjectiveTo probe insights into the reversal effect of bufalin on vincristine-acquired multidrug resistance (MDR) in human leukemia cell line K562/VCR.MethodsProliferative inhibition rate and the reversal index (RI) of bufalin were determined by Methyl thiazolyl tetrazolium assay. The uptake of Adriamycin (ADM) in K562/VCR cells, cell cycle and apoptosis rate were determined by flow cytometry (FCM). Cell morphologic changes were observed with Wright-Giemsa staining. The expression of P-glycoprotein (P-gp), multidrug-associated protein-1 (MRP1), Bcl-xL and Bax protein were measured by immunocytochemistry.ResultsThe human leukemia multidrug resistant K562/VCR cells showed no cross-resistance to bufalin. The RIs of bufalin at concentrations of 0.0002, 0.001 and 0.005 μmol/L were 4.85, 6.94 and 14.77, respectively. Preincubation of 0.001 μmol/L bufalin for 2 h could increase intracellular ADM fluorescence intensity to 28.07% (P<0.05) and down-regulate MRP1 expression simultaneously, but no remarkable effect was found on P-gp protein. Cell cycle analysis indicated increased apoptosis rate and apparent decreased G2/M phase proportion after treatment with bufalin. When exposed to 0.01 μmol/L bufalin, typical morphological changes of apoptosis could be observed. Down-regulation of Bcl-xL and up-regulation of Bax expression in K562/VCR cells could be detected by immunocytochemistry.ConclusionBufalin could partly reverse the MDR of K562/VCR cells, with a possible mechanism of down-regulating MRP1 expression and activating apoptosis pathway by altering Bcl-xL/Bax ratio.     

Survivin反义寡核苷酸对K562细胞耐药性的影响

目的 探讨Survivin反义寡核苷酸(antisense oligodeoxg nucleotide,ASODN)与传统化疗药物对白血病K562细胞耐药性的影响.方法 实验分为反义核苷酸组(ASODN)、无义核苷酸组(SODN)、脂质体组(Lip)、空白对照组,以脂质体转染Survivin ASODN,用RT-PCR检验SurvivinmRNA表达;用MTT法检测K562细胞对阿霉素(driacin,ADM)、柔红霉索(daunorubicin.DAM)及联合用ASODN耐药性;用流式细胞仪检测单独用ADM、DAM和联合用ASODN时K562细胞内ADM和DAM的浓度.结果 ASODN组Survivin mRNA表达较对照组降低(P<0.05);ADM和ASODN ADM对K562细胞的半数抑制细胞(IC50)分别为0.5457 mg/L和0.1933 mg/L,DAM和ASODN DAM对K562细胞的IC5.分别为0.5408 mg/L和0.2027 mg/L,联合用药组ICso低于单用药组(P<0.05);用ADM和ASODN ADM时K562细胞内药物的荧光强度分别为51.64、89.92,DAM和ASODN DAM时K562细胞内药物的荧光强度分别为63.71、88.47,联合用药组细胞内药物浓度高于单用药组(P<0.05).结论 Survivin反义寡核苷酸可下调K562细胞Survivin mRNA的表达;Survivin反义寡核苷酸与阿霉素和柔红霉索联合作用可提高K562细胞内药物浓度,降低细胞生存率,降低细胞耐药性.     

Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins between K562 and K562/ADM cells

Background Multidrug resistance to chemotherapeutic agents is an important clinical problem during the treatment of leukemia. The resistance process is multifactorial. To realize the total factors involved in multidrug resistance, we analyzed the differentially expressed proteins of K562 and K562/ADM cells and we investigated one of the up-regulated proteins （CRKL） using siRNA to determine its role in K562/ADM cells. Methods Altered protein expressions between K562/S （K562 ADM-sensitive cell line） and K562/ADM （K562 multidrug resistant cell line induced by adriamycin） were identified by 2D-DIGE coupled with mass spectrometry. Meanwhile, we confirmed the differential expression of CRKL and Stathmin in both K562 and K562/ADM cells by Western blot analysis. Furthermore, we used RNA interference to silence the CRKL gene expression. Results Among the 9 differentially expressed proteins, 3 were up-regulated in K562/ADM cells, while 6 were down-regulated in the K562/ADM cells compared with its parent cell line. The expression of CRKL was up-regulated significantly in K562/ADM cells, and it can be decreased by recombinant lentivirus. Moreover, the multidrug resistance of K562/ADM cells was efficiently reversed by silence of CRKL gene expression. Conclusions The data provided the differentially expressed proteins in K562 and its resistant cell line and highlights the power of 2D-DIGE for the discovery of resistance markers in cancer. We found CRKL may be a new protein involved in the multidrug resistanse of leukaemia cells.     

三尖杉酯碱诱导慢性髓系白血商K—562细胞凋亡的实验研究

目的 阐明三尖杉酯碱（HT）作用于K562细胞的机制。方法 应用细胞形态，DNA凝胶电泳和流式细胞仪等检测，观察HT对K562细胞株的作用方式，进一步用RT-PCR方法研究bc/rlabl基因在转录水平的改变。结果 0.01-100.00μg/ml浓度HT可诱导K562细胞凋亡，并呈时间和剂量依赖性，随着药物作用时间的延长，bcr/abl基因的转录下调。结论 低浓度HT就可通过抑制bcr/abl基因的表达，诱导K562细胞凋亡。