等位基因测序的简便快速方法

目的：探索一种简便快速的等位基因测序方法。方法：用银染方法对待检个体的血样本进行简短串联重复（short tandem repeat,STR)基因分型，将需测序的等位基因条带从凝胶图上切下，PCR扩增，产物经纯化作为测序模板。采用循环测序法测序.结果：对D12S391、D11S554 STR基因座的等位基因Ladder及STR基因座（FGA、D12S391、D11S554）等位基因发生突变的19个家系的等位基因进行了测序。STR分型表现为杂合子或纯合子的等位基因用此方法测序都得到了清晰的信号。结论：此方法 不仅给等位基因测序提供了一种有效手段，而且对于只要能利用电泳分离的混合的DNA片段，就能用此方法将各DNA片段分别测序。     

Powerplex(R) 16TM System在中国人群中OL等位基因的研究

[目的]分析Powerplex(R) 16TM System中各基凼座的OL等位基因,探讨OL等位基因在中国人群中的分型及意义.[方法]用Powerplex(R) 16TM System试剂盒中15 STR基因座检测23 980个中国群体样本,通过STR分型数据对体系中各基因座的OL等位基因进行统计分析,找出频率较高的OL等位基因测序.[结果]在Powerplex(R) 16TM System中的15个基因座有11个基因座发现OL等位基因,以PentaE、PentaD和D7S820基因座中发现最多,分别有11、9和7个.D7S820的等位基因9.1、9.2、10.1;PentaE中的等位基因18.4,19.4,26;PentaD中的等位基因6;D21S11的等位基因30.3的频率均大于1‰.[结论]大样本基因频率调查能更好的发现STR基因座中的OL等位基因,OL等位基因正确分型对法医学中的个体识别和亲权鉴定有重要意义.     

中国海南黎族人群15个STR位点的遗传多态性

[目的]研究海南黎族族人群15个STR位点D3S1358、THO1、D21S11、D18S51、VWA、CSF1PO、D8S1179、TPOX、FGA、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、D2S1338的遗传多态性.[方法]通过人类短串联重复序列(shorttandem repeat,STR)复合扩增、基因扫描、基因分型调查了110名黎族无关个体15个STR位点等位基因分布情况.[结果]15个STR位点均符合Hardy-Weinberg平衡,共检出149个STR等位基因,其频率分布在0.0045～0.5045之间,杂合度(heterozygosity,H)为0.6716～0.8754,个体识别力(diserimination power,DP)为0.8770～0.9673,非父排除率(probabilities of paternity exclusion,EPP)为0.4383～0.7396,多态信息含量(polymorphic information content,PIC)为0.6265～0.8574.[结论]选用的15个STR位点均能检出等位基因遗传多态性,并具有较丰富的信息含量,为进一步研究中华民族STR遗传结构提供了基础资料.     

分子克隆技术制备D5S2845基因座的等位基因分型标准物及其法科学应用研究

目的:调查D5S2845基因座在华东汉族人群的群体遗传学数据,解决长期困扰短串联重复序列(shorttandem repeat,STR)分型上存在的准确性和标准化问题。方法:首先利用PCR结合聚丙烯凝胶电泳技术调查华东汉族群体的等位基因频率及基因型分布,再用PCR扩增出D5S2845基因座的8个等位基因片段,将其插入pUC重组质粒中,经DNA测序分析证实插入片段的结构及大小,用国际标准将插入的等位基因片段进行命名,最后经转染、扩大培养、扩增及再鉴定后,制备出标准的D5S2845等位基因分型标准物。结果:D5S2845基因座在华东汉族群体中均有较高的多态性,其非父排除概率及个人识别能力分别为0.558和0.896,应用分子克隆技术制备出大量的D5S2845基因座等位基因分型标准物。结论:D5S2845基因座是一个适合于群体遗传学研究和法科学应用的遗传标记。分子克隆方法制备的STR基因座等位基因分型标准物在法科学实践中应用价值较高。     

河南汉族人群D19S253、D12S391、D7S820基因座遗传多态性研究

目的 探讨D19S253、D12S391、D7S820基因座在河南汉族人群的法医学应用价值。方法应用PCR扩增、PAG垂直板电泳分离、银染技术,对河南汉族211例无关个体进行D19S253、D12S391、D7S820基因座分型。结果D19S253检出10个等位基因31种基因型,D12S391检出11个等位基因42种基因型,D7S820检出8个等位基因23种基因型。3个基因座的基因型分布与Hardy．Weinberg平衡吻合良好。3基因座的杂合度(H)观察值分别为0．7678、0．8323、0．7455。个人识别能力(DP)分别为0．9348、0．9566、0．9188。三联体非父排除率(PEt)分别为0．6229、0．6607、0．57460结论D19S253、D12S391、D7S820基因座在河南汉族人群具有很高法医学应用价值。     

分子克隆技术制备4个STR基因座等位基因阶梯及法医学应用研究

目的用分子克隆技术制备D5S818、D19S253、DYS447、DYS448等4个STR基因座等位基因阶梯，解决STR分型的准确性和标准化问题，建立制备STR基因座等位基因阶梯的新方法，并且应用自制的D19S253基因座等位基因阶梯，进行该基因座在所选样本中的群体遗传学调查，探讨等位基因阶梯的法医学应用价值．方法用一种改进的酚、氯仿、异戊醇方法提取DNA，采用PCR扩增，聚丙烯酰氨凝胶电泳，银染显带分析技术，分子克隆技术和DNA测序技术，对352例男性样本，135例女性样本，PCR扩增筛选出的4个STR基因座的等位基因片段，将其插入PGEM-T载体中，导入大肠杆菌，使其随大肠杆菌的无性繁殖而复制，获得每一个等位基因片段的大量拷贝，PCR扩增鉴定，测序分析，制备出4个STR基因座的等位基因阶梯．[第一段]     

基于二代测序平台的法医STR分型

目的探究二代测序(NGS)技术平台在法医短串联重复(STR)分型中的应用。方法采集402个广东汉族无关个体样本,基于Ion PGM测序平台,对15个STR基因座(D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、v WA、D2S1338和D19S433)进行序列测定和基因分型。分析基于STR重复序列多态性检出的STR等位基因,计算其等位基因频率,评估法医学应用效能。结果在15个STR基因座中共检测到202种不同重复序列的等位基因。在D3S1358、D5S818、D13S317、D21S11、FGA、v WA、TH01等7个基因座中检测到54种长度相同而重复序列不同的等位基因亚型,基于重复序列多态性分析的STR分型技术的杂合度、个体识别力、多态信息含量、非父排除率等法医学参数均大于基于片段长度检测的STR分型技术,随机匹配概率小于基于片段长度检测的STR分型技术。结论基于NGS技术平台的STR分型技术提高了STR基因座的多态性和检测效能,具有很好的法医学应用价值。     

D7S817、D10S1432、D10S1213及D18S865分型标准物的制备及其遗传多态性研究

目的 利用重组质粒制备四个新的STR基因座(D7S817、DIOS1432、D10S1213及D18S865)的分型标准物，并进行群体遗传学研究。方法 从聚丙烯酰胺凝胶中分离出经PCR扩增后的等位基因片段，二次扩增后纯化的等位基因片段被分别插入到PUC质粒载体中。利用DNA测序证实插入片段大小及结构的正确性后，用国际标准将插入的等位基因片段进行命名。再转染到适当的E．coli DH5α^TM细胞内选择培养，以纯化质粒为模板，扩增出各基因座的等位基因片段后混合。结果 得到四个STR基因座(D7S817、DIOS1432、DIOS1213及D18S865)分型标准物，应用所制备的分型标准物研究汉族和东乡族群体中的基因型分布频率．结论 制备出的四个STR基因座的分型标准物在法科学领域中有很高的应用价值，非常适合于群体遗传学的分析。     

D13S317基因座“off—ladder”等位基因分析

目的：确证在DNA数据库构建过程中一样本D13S317基因座出现的稀有分型标准物外off-ladder（OL）等位基因。方法：AGCU17＋1STR荧光检测试剂盒进行STR分型时,D13S317基因座检出OL等位基因;利用Chelex-100法提取血样DNA进行荧光PCR,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和ABI3130电泳检测并由上海生工进行测序。结果：OL等位基因只含有6个[TATC]重复,不在D13S317基因座AllelicLadder范围之内,是一个新的等位基因。结论：新的等位基因的出现,对扩大DNA数据库的覆盖范围及全面性和提高基因座个体识别能力等具有重要的借鉴意义。     

河南汉族人群11个STR基因座在排除父权方面的应用

目的 :分析 11个短串联重复序列 (shorttandemrepeats,STR)D12S391、vWA、D5S818、D16S5 39、D7S82 0、F13A0 1、D13S317、FESFPS、CSF1PO、TPOX、THO1在河南省汉族群体亲子鉴定事件中排除父权方面的应用价值。方法 :对 30 4例做亲子鉴定的河南汉族个体的DNA样本应用多位点复合PCR扩增技术及聚丙烯酰胺凝胶电泳分型方法 ,结合PowerStatssoftware软件 ,分析上述 11个STR的观察杂合度 (Ho)、个体识别率 (DP)、多态性信息含量 (PIC) ,并计算其参与联合排除父权的比率。结果 :11个STR参与 36例联合排除父权的比率依次为 6 9.4 % ,5 2 .8% ,4 7.2 % ,4 7.2 % ,4 4 .4 % ,33.3% ,33.3% ,33.3% ,2 7.8% ,2 2 .2 % ,16 .7% ,其中 6个 (D12S391、D7S82 0、vWA、D5S818D13S317、D16S5 39)Ho>0 .7、DP >0 .9、PIC >0 .7。结论 :短串联重复序列D12S391、D7S82 0、D5S818、vWA、D16S5 39可作为亲子鉴定的首选基因座 ,在法医学应用和群体遗传学研究中有较高的价值     

亲权鉴定中可疑FGA等位基因分析

目的 分析亲权鉴定中遇到的可疑FGA等位基因,确定属于稀有等位基因还是新等位基因.方法 结合STR-PCR分型结果对可疑FGA等位基因片段进行特异扩增,并克隆测序分析.结果 亲权鉴定中被检测父子二人的基因位点符合孟德尔遗传规律,且可疑FGA等位基因测序结果一致,为FGA-13.结论 亲权鉴定中遇到的可疑FGA等位基因属...     

Construction of nested set of unidirectional deletion of recombinant plasmid DNA for sequencing]

In order to rapidly sequence a batch of large DNA fragments, we developed a method for the construction of nested set of unidirectional deletions. A nested set of unidirectional deletions of the large DNA fragment of a c-type retrovirus gene was successfully constructed by the adoption of this method. The recombinant plasmid DNA was excised by BamHI and SphI at on end of the target DNA to create 5' and 3' overhanging ends. The DNA was digested with Exo III from 5' overhanging end to generate a set of unidirectional deletion. With the use of this method a set of deleted plasmid DNA and the deleted target DNA excised from the deleted constructs were observed on agrose gel electrophoresis. We sequenced all of 24 deleted DNA fragments (forward and reverse orientation). All of them contained overlapping sequences at their ends. These sequences were readily aligned. The results demonstrate this is an efficient method for sequencing large DNA fragment. The influential factors in this method were discussed in this report.     

利用RNA捕获法在全基因组进行egfr启动子片段的富集

目的以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,egfr)启动子片段为目标靶序列,用RNA捕获法在全基因组进行靶序列的富集,结合第二代测序技术,实现候选基因区段的深度测序。方法本研究以宫颈癌细胞系HeLa S3 egfr启动子为模型,提取基因组后用MboⅠ酶切,补平加PE接头,回收400 bp～1000 bp的DNA片段作为模板,并用egfr启动子RNA与制备的基因组模板杂交将egfr启动子片段富集,富集的DNA片段PCR扩增15轮后用Solexa高通量测序。结果通过生物信息学技术分析,从实验组中随机取总条数为106 reads,比对到egfr启动子片段reads条数为1 889条,而比对到随机挑选的notch 1、pdgf-B、src基因reads条数分别为2、3、3条。从人类全基因组随机取总条数为106的等长reads作为对照组,比对到notch 1、pdgf-B、src、egfr基因reads条数分别为3,2,3,2条。在本实验中egfr启动子片段通过RNA捕获法被富集了630倍。结论用本研究建立的RNA捕获法进行基因组靶序列捕获、富集、测序文库建立的技术路线可行,所建DNA文库可直接用于Solexa测序仪的测序。RNA捕获技术与第二代高通量测序技术结合能应用于靶区域的重测序,研究可变剪切、核小体分布,发现和分析新的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms,SNPs)位点,寻找许多复杂疾病相关基因及位点,针对性强,简便易行,节约成本。     

湖北汉族群体9个STR位点遗传多态性分析

目的 :应用荧光标记短串联重复序列 (shorttandemrepeat,STR)位点复合扩增方法 ,了解湖北汉族人 9个STR位点 (D3S135 8、vWA、FGA、D8S1179、D2 1S11、D18S5 1、D5S818、D13S317、D7S82 0 )的遗传多态性分布。方法 :选取2 2 0名无血缘关系的湖北汉族个体。采用Chelex法提取毛球和血液DNA ,将各STR位点引物用三色荧光标记后进行复合扩增 ,PCR产物经PE310遗传分析仪自动分析 ,并进一步进行遗传多态性研究。结果 :9个STR位点基因型观察数 19～ 5 0个 ,等位片段数 7～ 16个 ,多态信息含量介于 0 .7335～ 0 .84 5 2之间 ,个人识别率介于 0 .8971～0 .95 6 4之间。 9个STR位点在中国汉族人群中的等位基因频率分布与白色人种、黑色人种之间差异有显著性。结论 :采用荧光标记引物进行复合扩增 ,结合PE310遗传分析仪自动分析 ,可以有效地区分各位点的扩增产物。 9个STR位点的基因型分布均符合Hardy Weinberg平衡 ,所得到的基因频率等结果为人类群体遗传研究提供了数据     

脊髓小脑性共济失调12型的分子遗传学诊断及临床分析

[目的]研究分析脊髓小脑性共济失调12型(SCA12)的分子诊断及临床表现特征.[方法]对临床诊断为脊髓小脑性共济失调(SCA)的36个家系43例患者、38例散发患者、60名家系"健康"个体及44名正常对照,通过聚合酶链反应(PCR)对SCA12基因含有CAG三核苷酸重复片段进行扩增,并利用ABI 373测序仪对异常等位基因片段进行DNA测序,聚丙烯酰胺凝胶电泳并以图像分析软件计算其长度,推算所有正常和异常扩增等位基因内CAG重复次数.[结果]正常我国南方汉族人群SCA12等位基因CAG重复数目为22～27.检出1个家系患者1例,症状前患者2例,两个等位基因中一个异常等位基因内CAG重复数目为68次.[结论]SCA12比较罕见,CAG三核苷酸重复异常扩增是其致病原因,分子遗传学分析可确证临床诊断和症状前诊断,并可为遗传咨询提供依据.该例为国内首次报道.     

Y染色体STR基因座DYS385等位基因分型标准物的制备及群体遗传学研究

目的　采用分子克隆技术大量制备优质标准 STR基因座等位基因分型标准物 ,解决长期困扰STR分型上存在的准确性和标准化问题。方法　先用 PCR扩增出 Y染色体上 DYS385基因座的 9个等位基因片段 ,将其插入 p U C重组质粒中 ,经 DNA测序分析证实插入片段的结构及大小 ,按国际标准将插入的等位基因片段进行命名 ,最后经转染、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出标准的 DYS385等位基因分型标准物。结果　应用此法制备出大量的 DYS385等位基因分型标准物 ,并将其成功地应用于该基因座在中国成都地区汉族及德国美茵茨地区高加索人群体中的基因型分布频率调查。结论　该法制备的 STR基因座等位基因分型标准物在法科学实践中应用价值极高 ,DYS385基因座是一个适合我国群体分析和法科学应用的遗传标记     

脊髓小脑性共济失调7型的分子遗传学诊断及临床分析

目的 研究分析脊髓小脑性共济失调7型(SCA7)的分子遗传学诊断、应用以及临床表现特征。方法 对临床诊断为SCA的36个家系43例病人、38例散发SCA患者、60名家系“健康个体”以及44名非家系正常对照人员，通过PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术检测SCA7基因位点内CAG三核苷酸重复扩增次数，并利用AB1373测序仪对异常等位基因片段进行DNA测序。结果 我国南方正常人群SCA7等位基因CAG重复数为9～19。检出2个家族性、1个散发性共3例SCA7患者，测序证实其异常等位基因内CAG重复数目分别为65、65、63。结论 SCA7基因内部CAG三核苷酸重复异常扩增是该病致病原因，利用分子遗传学分析可进行基因诊断，为症状前诊断及遗传咨询提供依据。     

STR-PCR定量分析非清髓性干细胞移植后造血嵌合体

目的：建立对非清髓性造血干细胞移植术后造血嵌合体的STR-PCR定量检测技术，初步探讨该技术在监测非清髓性造血干细胞移植术后植入状态中的应用。方法：对3例非清髓性异基因造血干细胞移植术后的患者序列血样，在可区分供受者基因的STR位点上，应用凝胶图像分析技术进行供受者特异性等位基因的定量分析．结果：定量分析结果与DNA电泳条带法的定性分析结果，以及临床移植效果一致。在电泳条带已表现为供者源造血时，通过定量分析仍可检测出受者特异性等位基因。结论：STR-PCR定量分析技术较单纯电泳鉴定植入可观察到更为细微的变化，该法是检测非清髓性造血干细胞移植后供受者嵌合体更为有效的方法．     

ALLELE DISTRIBUTION OF FIVE X-CHROMOSOME SHORT TANDEM REPEAT LOCI IN EWENKE POPULATION OF NORTH CHINA

Objective To study the allele genetic polymorphism of five short tandem repeat （STR） loci on X-chromosome in Ewenke population of north China and to provide basic data for forensic identification. Methods Genomic DNA was extracted from EDTA-whole blood of Ewenke population by Chelex-100. The DNA samples were amplified by PCR and were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining. The sequence length variations of DXS6799, DXS8378, DXS101, HPRTB, and DXS6789 loci on X-chromosome in 98 unrelated Ewenke individuals were investigated. Results All five loci analyzed showed high polymorphism and genetic stability. The data of the five X-chromosome STR loci in Ewenke ethnic group of China was in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium by Chi-square test. Conchusion Allele polymorphism of five X-chromosome STR loci can be used as a genetic marker for forensic identification and population genetic research.