人胚脊髓神经干细胞的分离培养和鉴定

目的:探讨人胚脊髓神经干细胞的体外培养和分化的方法,观察其增殖和分化特点。方法:利用无血清培养和单细胞克隆技术从人胚脊髓组织中分离培养出神经干细胞并用血清诱导其分化,应用免疫荧光细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定。结果:从人胚脊髓组织分离的细胞在EGF单独存在时无法形成神经球,在bFGF单独存在时只形成少量神经球,在EGF和bFGF共同存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球,表达神经干细胞的标志物Nestin,经血清诱导后分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞并表达特异性抗原NSE、GFAP和CNP。结论:在体外培养条件下可从人胚脊髓组织中培养出神经干细胞,它可为神经干细胞的基础研究和临床应用提供材料。     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

人胚神经干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨人胚神经干细胞的体外培养和诱导分化的条件。方法 从药物流产的12周到16周的人胚胎海马组织中分离神经干细胞，在EGF、bFGF和LIF联合作用下使其稳定增殖，并用10％的胎牛血清诱导其贴壁分化，应用免疫荧光染色方法行Nestin、NSE、MAP-2、GFAP和GalC免疫荧光染色，对神经干细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果 体外培养的神经干细胞增殖成神经干细胞球并传代，鉴定为Nestin染色阳性细胞，并可诱导分化为神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论 利用无血清培养技术和特定生长因子，可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的人胚神经干细胞。     

人类神经干细胞的长期培养和传代

目的 探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。方法 采用机械方法从胎脑中分离神经细胞，应用N2培养基进行培养，bFGF和EGF刺激细胞扩增；传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养；应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果 从胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞，培养条件下呈悬浮状态生长，形成神经球，绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashil两种神经干细胞的标志物；这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞，早期的培养有少量的少突胶质细胞；在这种培养条件下，神经干细胞生长速度较慢，而采用切割神经球的方法保持了细胞间的，神经干细胞可获得较大的扩增速度。结论 在体外的培养条件下，可从胎脑组织中培养出神经干细胞，它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。     

人胚胎神经干细胞的体外培养

目的：从人胚胎皮层分离神经干细胞，寻找其在体外培养的适合条件，方法：使用具有丝裂原作用的多种细胞生长因子。结合无血清细胞培养技术。从人胚胎皮层分离具有增殖能力的细胞群，在连续传代过程中，验证其自我更新能力和多分化潜能，免疫荧光染色检测Nestin抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达，并且流式细胞仪检测神经干细胞分化结果。结果：协同使用bFGF和EGF从人胚胎皮层分离的细胞群，具有自我更新能力和多分化潜能，表达胚胎早期细胞抗原-Nestin，加入LIF后细胞增殖速度加快，分化为神经元的比例增高，而单独采用bFGF、EGF或LIF培养的细胞迅速衰退，仅能培养3-5代。结论：协同使用丝裂原生长因子从人胚胎皮层分离的细胞时中枢神经系统的干细胞；bFGF、EGF和LIF协同使用是体外培养神经干细胞的较佳条件。     

人胚脑与脊髓神经干细胞体外生物学特性的差异

目的:探讨人胚脑源性神经干细胞和脊髓源性神经干细胞的体外培养和分化的差异。方法:从人胚脑组织和脊髓组织中分离培养神经干细胞,分为EGF组、bFGF组、EGF±bFGF组,在连续传代过程中观察并比较神经干细胞体外培养特性的差异:用血清诱导神经干细胞分化,观察其分化状况的不同。结果:从人胚脑组织分离的细胞在bFGF 单独存在时无法形成神经球,在EGF或EGF±bFGF存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球;从人胚脊髓组织分离的细胞在EGF单独存在时无法形成神经球,在bFGF单独存在时只形成少量神经球,在EGF±bFGF存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球。同样在EGF±bFGF存在的情况下,脑源性于细胞的增殖速度较快。经血清诱导后,脑组织来源的干细胞分化为NSE阳性细胞数明显多于脊髓组织来源的干细胞,二者之间的差异具有显著性(P<0．05)。结论:脑源性和脊髓源性神经干细胞在生长和分化方面有明显差别:脑源性神经干细胞可在bFGF或EGF士bFGF存在的情况下长期传代,而脊髓源性神经干细胞只能在EGF±bFGF存在的情况下长期传代,脑源性干细胞的增殖能力明显高于脊髓源性干细胞;脑源性干细胞较脊髓源性干细胞更易分化为神经元。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 原代培养．培养细胞生长状况观察用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）检测以作细胞鉴定。结果 成功培养出大鼠胚胎神经干细胞，了解其生长规律，并对其进行传代、冻存及复苏，培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论 大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏，并具有多向分化潜能。     

1101/神经干细胞超顺磁性氧化铁标记及对体外诱导分化的影响

目的 研究超顺磁性氧化铁（Superparam agnetic iron oxide）体外标记人神经干细胞的效果,为将来临床上应用磁共振成像（MRI）追踪标记细胞奠定基础。 方法 取孕13周人胚胎脑组织,制备成单细胞悬液,用添加表皮生长因子（EGF,20ng/ml）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF,20ng/ml）的体外培养人神经干细胞球,并做传代及诱导分化。利用Feridex标记分散成单细胞的神经干细胞,行普鲁士蓝染色检测标记阳性率,5%胎牛血清（FBS）诱导标记后的神经干细胞分化,并用免疫荧光染色检测分化细胞。 结果 培养一周即可见大量的神经干细胞球,Feridex标记神经干细胞行铁染色显示胞浆中含有铁颗粒,Feridex标记的神经干细胞阳性率达90%。标记后的神经干细胞经5% FBS诱导分化能够分化为神经元和星形胶质细胞 。 结论 Feridex 能够标记神经干细胞,标记不影响神经干细胞的生物学特性,标记后能够正常体外扩增培养和定向诱导分化,本研究为神经干细胞临床移植追踪提供了新的方法。     

胚胎大鼠嗅神经干细胞的培养及分化特性

目的建立胚胎大鼠嗅神经干细胞(NSCs)体外培养方法,研究其增殖和分化特性.方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养胚胎14 d(E14)大鼠嗅球NSCs,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSCs及自然分化为特异性神经细胞的类型,测定NSCs的生长曲线.结果从E14大鼠嗅球分离、培养出表达nestin,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSCs.嗅NSCs的增殖依赖表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF.结论从E14大鼠嗅球培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSCs.     

丝裂原在海马神经干细胞培养中的作用

目的 研究表皮生长因子(epidemal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)在海马神经干细胞培养中的作用，确定适合海马神经干细胞体外培养的丝裂原。方法 应用EGF和bFGF刺激海马神经干细胞增殖，观察神经干细胞生长、增殖和分化等特性。结果 EGF和bFGF都能刺激神经干细胞扩增，bFGF反应性神经干细胞团增殖缓慢，细胞团中部分细胞迁出，迁出的细胞形成新的细胞团或分化成神经细胞或神经胶质细胞，而且bFGF反应性神经干细胞贴壁很紧，不易传代；相反，EGF反应性神经干细胞快速增殖，易于传代，较少迁移和分化。结论 EGF可促使海马神经干细胞快速增殖，是体外培养海马神经干细胞比较合适的丝裂原。     

不同促细胞分裂因子对人神经干细胞定向分化的影响

目的观察不同促细胞分裂因子对人神经干细胞(NSCs)增殖及定向分化的影响。方法对人NSCs用无血清DMEM培养基行原代培养的同时,分别加入表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、维甲酸(RA)等因子,观察其对NSCs定向分化的作用。结果EGF培养的NSCs,克隆球形成慢且较松散,经血清诱导分化后,主要为星形胶质细胞,仅有少数神经元。而bFGF培养的NSCs则生长良好。在加血清诱导分化后,不同浓度bFGF培养的NSCs分化的细胞不同。bFGF与EGF共同培养的NSCs,其生长及神经球形成良好。在加血清诱导分化后,分化的神经细胞比例更接近脑内神经细胞的组分。NGF对神经球的形成无明显影响,但可促使其向神经元分化。RA使神经克隆球形成,可使NSCs直接分化为神经元细胞的比例明显增加。结论不同促细胞分裂因子对人NSCs的增殖及定向分化均有一定影响。     

Comparative analysis of in vitro conditions for rat adult neural progenitor cells

Various protocols have been published for in vitro expansion and maintenance of adult neural progenitor cells (ANPC). However, there are only few data comparing these protocols regarding their influence on proliferation, migration and differentiation. Freshly isolated ANPC from olfactory bulb (BO) and dentate gyrus (DG) of adult rat brains forming neurospheres and expressing the neural stem cell markers nestin and Sox-2 were used in a comparative analysis of five different medium combinations. Medium containing N2 and fetal calf serum (FCS), but no additional cytokines was unsuitable for an effective long-term expansion of ANPC due to a significantly reduced proliferation rate. Media containing BIT, basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor AB (PDGF-AB) and leukemia inhibitory factor (LIF) or B27, bFGF and EGF are recommendable for the cultivation of DG-derived ANPC as neurospheres only. Unlike, culture media containing BIT, bFGF, EGF and PDGF-AB or N2, bFGF and EGF were suitable for all applications tested as they responded similarly regarding proliferation, migration and expression of differentiation markers. The results of the present study might help to improve the effective in vitro expansion of ANPC derived from rare human tissue samples.     

大鼠胎脑神经干细胞的培养分化及鉴定的实验研究

目的建立大鼠胎脑皮质神经干细胞的培养、扩增、诱导分化及鉴定的方法。方法选取孕14d胎鼠的大脑皮质作为细胞来源,在无血清培养基中添加B27、碱性成纤维细胞因子、表皮生长因子,建立胚胎神经干细胞的体外培养体系,用5%的胎牛血清诱导神经干细胞分化,用免疫荧光染色技术进行对神经干细胞及诱导分化细胞的鉴定。结果原代培养的神经干细胞折光性强,培养第2d开始形成细胞集落,第3d形成大的神经球。3～5代传代的细胞生长稳定。经胎牛血清诱导后第3d开始,神经球开始向周边发出突起,悬浮的细胞开始贴壁生长。原代及传代培养的神经球表达Nestin阳性,分化细胞分别表达NSE、GFAP和GALC阳性。结论应用无血清培养技术可在体外培养、扩增出神经干细胞。5%的胎牛血清可以诱导神经干细胞向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等成熟细胞分化。     

Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells

Human fetal neural stem cells (hNSCs) can be expanded in vitro by mitogens or growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), and/or leukemia inhibitory factor (LIF). Their effects on proliferation rate and differentiation pattern of hNSCs, however, have not been fully characterized. In this study, we cultured hNSCs in seven regimens, including bFGF, EGF, and LIF, either alone or in combinations. Cells were maintained as neurospheres in treatment media for various periods, up to six passages. A combination of bFGF, EGF, and LIF expanded hNSCs more efficiently than any other treatment as determined by counting total cell numbers using a trypan blue exclusion assay, a WST-1 cell viability assay, and a bromodeoxyuridine incorporation flow cytometric analysis. Differentiation patterns of hNSCs expanded under different conditions were also analyzed. We reported previously that hNSCs primed in vitro with a combination of bFGF, heparin, and laminin (FHL) induced neuronal differentiation toward a cholinergic phenotype. In this study, we show that the FHL priming increases neuronal differentiation while decreasing astroglial generation in all treatment groups as determined by immunostaining. However, cells proliferated under different growth factor conditions do vary in their phenotypic differentiation patterns. Particularly, significant generation of cholinergic cells was observed only in hNSCs expanded with EGF/bFGF or EGF/bFGF/LIF, but not with other treatment regimens, even when they are exposed to the same priming procedure. Our results indicate that hNSCs are highly plastic, with their proliferation and differentiation potential dependent on different growth factor treatments.     

新生小鼠端脑组织神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的研究

目的探讨新生小鼠端脑组织神经干细胞是否能够分化成胆碱能神经元。方法取新生小鼠端脑组织．用无血清方法分离培养神经干细胞；用克隆培养的方法检验培养细胞的干细胞特性；用免疫荧光细胞化学的方法检测神经干细胞标志巢蛋白（nestin）及干细胞诱导分化后神经元标志微管相关蛋白2（MAP2）、星形胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、胆碱能标志胆碱乙酰转移酶（CHAT）；比较不同的诱导分化条件（5％胎牛血清、5％胎牛血清＋碱性成纤维细胞生长因子）对胆碱能神经元分化的影响。结果从新生小鼠端脑组织分离培养出具有自我更新、扩增能力的神经球；各培养基中神经球均为nestin阳性。诱导分化后均能够产生MAP2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞以及ChAT阳性的胆碱能神经元。分化培养中加入碱性成纤维细胞生长因子能够提高胆碱能神经元分化的比例。结论新生小鼠端脑组织神经干细胞能够分化成胆碱能神经元。