乙型肝炎病毒基因型与YMDD基因区序列突变及BCP突变关系探讨

目的 对湘潭地区HBV感染者的基因型、YMDD基因区序列突变及BCP区突变情况进行研究,并对三者之间的关系进行探讨.方法 针对湘潭地区952例不同类型的HBV感染者的样本同时进行基因型、YMDD基因区序列突变及BCP区突变检测,并对检测结果进行统计分析.结果 湘潭地区HBV各种基因型分布比例为:B型698例、占73.32%,C型115例、占12.08%,B、C型混合感染139例、占14.60%.YMDD基因区序列突变结果显示:YMDD野生型844例、占88.66%,其余为YMDD突变型,其中YVDD 54例、占5.67%,YIDD 53例、占5.57%,1例为YMDD与YVDD混合感染.BCP区突变结果显示:1762A/1764G(野生型)672例、占70.59%,1762T/1764A(突变型)188例、占19.75%,其余92例为1762T/1764A和1762A/1764G混合型、占9.66%.基因型、YMDD基因区序列突变及BCP区突变三者相关性分析显示:HBV B型和C型YMDD基因区序列突变率分别为10.04%、10.43%,差异无统计学意义(χ2=0.017,P＞0.05),HBV B型和C型YMDD基因区序列突变类别差异有统计学意义(χ2=4.836,P＜0.05),HBV C型YVDD突变率(9.57%)要高于B型(5.88%).HBV B型和C型BCP区突变率分别为27.36%、46.09%,差异有统计学意义(χ2=16.478,P＜0.01),C型BCP区突变率要高于B型.HBV YMDD野生型和突变型的BCP区突变率分别为2 8.67%、35.51%,差异无统计学意义(χ2=2.139,P＞0.05),但YVDD BCP区突变率(61.11%)要高于其他类别.结论 (1)湘潭地区流行的HBV基因型主要为B型和C型,其中B型为优势基因型,具有南方地区的特点.(2)拉米夫定治疗前通过HBV基因型检测来预测抗病毒应答可能并无实际意义.(3)HBV基因分型、YMDD基因区序列突变、BCP区突变检测的应用,将有助于临床上对乙肝患者的预后和转归进行正确评价,为及时合理的实施干预措施提供了重要依据.

Abstract：

Objective To investigate the relationship between HBV genotypes and YMDD motif mutations or BCP mutations in Xiangtan of Hunan Province. Methods HBV genotypes, YMDD motif mutations and BCP mutations were analyzed in 952 HBV infected patients. Results HBV genotyping showed that 698 HBV type B patients and 115 HBV type C patients accounted for 73.32% and 12.08% respectively of all the participants. The rest 139( 14.60% )were genotype B and C mixed infection( B + C ). The analysis of YMDD motif mutations showed that 844 YMDD wild-type which accounted for 88.66% of all the subjects and the remainder were YMDD mutation types, of which 54( 5.67% ) carried YVDD, 53( 5.57% ) YIDD,and 1 YVDD and YIDD mixed infection. Basic Core Promoter mutations showed that 1762A/1764G ( wild type )accounted for 70.59% and 1762T/1764A( mutant ) accounted for 19.75%. The rest 92 patients were 1762T/1764A and 1762A/1764G mixed infection. This study showed no significant difference in the rate of YMDD mutation( 10.04% vs 10.43% ,χ2 =0.017,P＞0.05 ) ,but a significant difference in the types of YMDD mutation(χ2 = 4.836, P ＜ 0.05 )between HBV types B and C. The YVDD mutation was more commonly seen in genotype C( 9.57% ) than in genotype B( 5.88% ). The BCP mutation rate showed a significant difference( 27.36% vs 46.09%, χ2 = 16.478, P ＜ 0.01 ). Genotype C was more frequent than genotype B. The BCP mutation rate showed no significant difference between YMDD Wild-type and YMDD mutation types( 28.67% vs 35.51%, χ2 = 2.139, P ＞ 0.05 ), but most of BCP mutations happened in YVDD mutant type( 61.11% ). Conclusions ( 1 ) The predominant HBV genotypes in Xiangtan were genotype B and genotype C, the major genotype was type B, which display the characteristics of epidemiology in Southern China. ( 2 ) Determination of HBV genotypes before lamivudine therapy was probably not an important pretreatment investigation to predict antiviral responses. ( 3 ) Detection of HBV genotypes, YMDD motif mutations and BCP mutations will contribute to the correct evaluation of prognosis and timely proper management of HBV patients.     

乙型肝炎病毒核苷类似物交叉耐药株RT区变异分析

目的研究多种核苷类似物(NAs)序贯治疗产生交叉耐药的患者体内乙型肝炎病毒(HBV)RT区变异位点和变异类型。方法筛选6例临床上对两种或两种以上NAs产生交叉耐药的患者,并从患者血清中获取HBV交叉耐药株DNA,进行全基因克隆和测序,从而分析其变异特点和规律。结果经测序鉴定,6位患者体内HBV基因型均为C型,产生交叉耐药的相关性变异以rtM204V/I(YMDD)变异为主(50%),部分YMDD变异株伴有rtL180M变异(16.7%)、其他伴随变异包括rtV173L(16.7%),rtL80I(16.7%)。此外,还发现RT区次要变异伴随位点rtL269I(40%)、rtQ333K(56.7%)、rtH337N(56.7%)。结论RT区次要变异伴随位点rtL269I、rtQ333K、rtH337N的出现可能增强了HBV YMDD变异株在体内的复制能力,并对交叉耐药准种所占比例起到了放大的效果,从而导致本研究中6例患者出现对拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦和替比夫定产生多重耐药。     

乙型肝炎病毒逆转录酶区多位点预存耐药变异研究

目的研究宁德地区乙型肝炎病毒(HBV)预存耐药变异情况及相关影响因素,为临床制订个体化抗病毒治疗方案提供理论依据。方法采用基因芯片法,对未经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎患者及慢性HBV携带者进行多位点耐药突变检测,分析预存耐药变异与年龄、性别、谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、HBV-DNA载量之间的关系。结果 401例患者共检出预存耐药变异79例,检出率为19.70%。突变位点主要集中在rtN236T、rtM204I、rtL180M。突变模式以rtN236T、rtN236T+rtM204I+rtM204V、rtN236T+rtM204为主。相关药物前3位为阿德福韦(15.96%)、拉米夫定(7.48%)、恩曲他滨(7.48%)。年龄20岁及60岁,肝酶10ULN,病毒载量10~7 IU/mL,HBeAg阳性的患者,其预存耐药变异检出率较高。结论宁德地区慢性乙型肝炎患者及慢性HBV携带者的预存耐药变异率较高,以rtN236T突变最为常见,相关药物阿德福韦应慎用。替诺福韦、恩替卡韦的预存耐药变异检出率低,抗病毒治疗时可首选。抗病毒治疗前进行多位点耐药突变检测,对指导个体化用药具有重要的临床意义。     

基因芯片技术在乙型肝炎病毒耐药和分型检测中的价值

目的通过基因芯片技术快速检测临床血清样本中乙型肝炎病毒的基因亚型和耐药突变情况。方法同时用荧光定量PCR和基因芯片2种方法检测211例临床慢性HBV感染血清样本,并用DNA测序对基因芯片HBV分型和耐药结果进行验证。结果211例样本荧光PCR定量结果均大于或等于5．0×10^2IU／mL,基因芯片检出阳性210例,未检出的1例样本定量值小于1．0×10^3Iu／mL。210例基因芯片检测阳性的样本,基因芯片检测显示耐药突变病例67例,占31．9％;基因亚型2种,其中B型137例,占65．2％,c型69例,占32．9％,B、C混合感染4例,占1．9％。上述210例样本经DNA测序验证,基因亚型和耐药突变类型完全符合。结论基因芯片技术具有准确、灵敏、高通量的特点,适用于临床乙型肝炎病毒基因分型和耐药突变检测。     

某地区乙型肝炎病毒基因型分布和P区耐药突变模式分析

目的探讨十堰地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布和P区耐药突变模式及两者的相关性。方法将在该院进行治疗的224例慢性乙型肝炎患者纳入本研究,提取患者血液标本中的HBV DNA,利用ABI 3730型遗传分析仪对DNA进行测序,通过SeqMan软件实施序列比对,分析HBV DNA的基因型和P区耐药突变的情况。结果检出HBV基因型为B型者136例,占60.71%;为C型者62例,占27.68%。二者比例均高于D型、B+C型及未分型者,差异有统计学意义(P0.05)。78例明确出现耐药突变,其中B基因型对于拉米夫定以及阿德福韦的耐药率分别为18.38%与9.56%,与C基因型对于二者的耐药率16.13%与9.68%相比,差异均无统计学意义(P0.05)。B基因型患者M204V、M204I耐药突变的发生率分别为38.60%、17.54%,C基因型患者则分别为28.57%与38.10%,两种基因型患者比较差异无统计学意义(P0.05)。B、C型基因突变患者间YMDD突变(M204V、M204I)及非YMDD突变所占比例比较,差异均无统计学意义(P0.05)。B基因型及C基因型分别与M204V及M204I两种突变均呈正相关。结论十堰地区HBV的基因型主要是B型及C型,发生的HBV耐药突变则以M204I和M204V为主,在临床治疗时应按照基因分型以及耐药突变情况合理选择药物进行慢性乙型肝炎的治疗。     

乙型肝炎病毒耐药基因研究进展

核苷(酸)类似物抗病毒药物的开发和应用,为慢性乙型肝炎(CHB)的治疗带来了极大的帮助.然而在临床治疗的过程中,乙型肝炎病毒(HBV)耐药变异地产生增加了治疗失败的风险.近年来,在全球范围内对HBV耐药变异毒株的研究正在大规模的进行.该文将围绕HBV耐药基因的特点、HBV基因分型与耐药、检测耐药基因的技术和方法等方面的研究进展进行综述.     

乙型肝炎病毒耐药突变与HBV-DNA量和HBeAg之间的相关性研究

目的:探讨乙型肝炎病毒耐药突变与HBV-DNA量和HBeAg之间的相关性.方法:收集131例慢性乙肝患者的血清,采用基因芯片技术检测HBV拉米夫定及阿德福韦酯相关耐药突变位点(包括180、204、181、236位点),采用PCR-荧光探针法检测血清HBV-DNA量,采用化学发光微粒子免疫分析技术对血清HBeAg进行定性检测,分析HBV耐药突变与HBV-DNA量和HBeAg之间的关系.结果:乙肝病毒耐药突变率在不同性别及年龄间无统计学差异(P＞0.05),汉族和维族在180位点的突变差异有统计学意义(P＜0.05),但在其余3个位点的突变无统计学差异(P＞0.05).乙肝病毒的耐药突变率在不同HBV-DNA水平及不同HBeAg状态间的差异有统计学意义(P＜0.05).但在HBV-DNA中水平(105 ～ 107 IU/mL)及高水平(≥107 IU/mL)之间HBV突变率无统计学差异(P＞0.05).结论:乙肝病毒耐药变异与患者的年龄及性别无关,180位点的突变与患者的族别有关,而其余3个位点的突变与患者的族别无关.乙肝病毒耐药变异与血清HBV-DNA水平及HBeAg状态有关,HBV-DNA水平高者,HBeAg阳性者,其HBV耐药突变率较高.而当HBV-DNA达到中等以上复制水平时,其耐药突变率与HBV-DNA量无关.     

慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒耐药基因型研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)基因型与耐药病毒株产生的相关性。方法收集85例接受拉米夫定治疗1年以上的慢性乙型肝炎(CHB)患者为研究对象。采集血样经离心分离血浆,进行HBVDNA定量检测,再进行基因测序和基因分型。结果基因测序和基因型分析结果为A型4例(4.7%),B型28例(32.9%),C型37例(43.5%),D型11例(12.9%),B/C混合型5例(5.9%)。其中发生YMDD耐药突变的基因型突变率分别是A型1例(25.0%),B型5例(17.9%),C型16例(43.2%),D型2例(18.2%),B/C混合型1例(20.0%)。结论 HBV基因型C型发生YMDD耐药突变的频率较高,HBV基因型与YM-DD突变可能存在相关性。     

鸭乙型肝炎病毒耐药株的慢性感染研究

目的:建立鸭乙型肝炎病毒(DHBV)耐药株的慢性感染动物模型。方法:将DHBV野生株及耐药株质粒转染细胞,培养上清接种雏鸭。连续定量检测血清DHBV DNA;印迹杂交检测肝内病毒复制中间体;观察肝组织病理变化。结果:野生株组的病毒滴度和慢性感染率均高于耐药株组;肝组织中检测到DHBV的复制中间体与cccDNA,可见轻度炎症病理改变。结论:DHBV耐药株可形成慢性感染。     

乙型肝炎病毒基因型的国内研究进展

乙型肝炎病毒基因型分布有地理差异,并与肝病的发生、发展,以及抗病毒药物的疗效,都有一定的相关性。对近年来国内乙型肝炎病毒基因型的有关研究作一综述。     

310例接受拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者HBV RT区全长测序及结果分析

目的对接受拉米夫定(LAM)治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV P基因RT区全长测序并分析结果。方法选择接受拉米夫定治疗6个月以上的慢性乙型肝炎患者310例,收集LAM治疗后患者的血清,采用直接PCR产物基因测序法对HBV RT区碱基进行测序,后对测序数据用Chromas 223软件进行分析,找出HBV P基因RT区基因的变异位点和相应的氨基酸,进一步分析HBV耐药突变模式。结果 1)310例患者出现位点变异的有135例(43.5%),变异位点24个;2)基础变异位点和频率:rtM204 v/I 111例(82.20%),rtS213T 8例(5.92%),rtC256S 4例(2.96%),3位点差异有统计学意义(P0.05);3)变异模式和频率:rtM204I 39例(28.89%),rtM204V+rtL108M 25例(18.51%),rtM204V+rt204I+rtL180M 11例(8.15%),rtM204I+rtL180M 6例(4.44%),rtM204V+rtL180M+rtV173L/M 5例(3.70%),rtS213T 5例(3.70%),rtM204V+rtL180M+rtV207M/L/I 4例(2.96%),rtM204V 4例(2.96%)等;4)rtM204V还可伴随rtT184 I/S/M、rtA181T、rtC256S、rtS213T、rtL229V等位点变异。结论拉米夫定长期治疗可引起主要耐药位点rtM204 v/I突变,并常有rtL180M、rtV173L、rtS213T、rtC256S、rtV207M/L等一系列补偿性耐药位点伴随;单位点突变除rtM204I一种外,还存在rtS213T、rtM204V等突变模式;联合突变模式多数包含rtM204位点,但也存在rtS213T+rtL187I、rtC256S+rtF221Y等突变模式。     

DNA微阵列芯片法检测慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变

目的 评价一种新研制的DNA微阵列芯片HBV基因型耐药检测试剂盒的临床应用性能.方法 收集2008年12月至2010年6月224份CHB患者血清标本,提取HBV DNA,应用DNA微阵列芯片法和直接测序法平行检测HBV逆转录酶区(rt区)位点rtL180、rtA181、rtM204和rtN236的耐药突变.对结果不一致的标本进行克隆测序,以验证检测的准确性.结果 芯片法和直接测序法均成功检测224份标本全部896个位点的耐药基因型,214份标本结果完全一致,其中82份检测到突变,132份为野生型HBV.2种方法检测HBV耐药突变结果的完全符合率为95.5%(214/224).其余10份标本只用芯片法检测到突变:2份rtL180M突变、2份rtA181V突变、3份rtM204I突变、2份rtM204V突变、1份rtN236T突变,但是直接测序未检测到相应突变.包含突变序列的克隆所占比例为5.0%～15.0%.经克隆测序验证结果与芯片法完全一致.结论 DNA微阵列芯片法检测HBV耐药突变与直接测序法相比符合率高,并可检出低比例耐药突变毒株,有助于早期提示耐药的发生.     

P基因片段测序分析HBV基因分型及耐药位点

目的 建立一种高效、准确的HBV基因分型及核苷类药物相关耐药突变位点分析的新方法.方法 2011年7至8月在太原市第三人民医院收集48份乙型肝炎患者血清标本,利用商品化核酸提取试剂盒提取标本DNA,然后分别进行HBV全基因组和P基因片段扩增,最后对产物进行测序分析,通过构建系统发生树和Genotyping软件分析两种方法进行基因分型,并对两种扩增产物的分型结果进行比较.结果 共得到48条HBV全基因组序列,通过构建系统发生树和Genotyping软件分析两种方法确定12条B型序列和36条C型序列;对HBV P基因片段测序产生的序列进行分型,结果与全基因组测序分析完全一致.通过对HBV P基因序列进行分析,共发现7种核苷类药物耐药突变形式,所测标本突变比例达27.1％ (13/48),其中所有突变均与拉米夫定或阿德福韦酯相关,未检测到其他核苷类药物相关耐药突变位点.另外,利用荧光定量PCR法对同样48份标本进行分型检测,共得出B型11例,C型35例,BC混合型2例.结论 乙型肝炎病毒P基因片段测序可能是一种新型乙型肝炎病毒分型方法.同时,该方法还可对核苷类药物相关耐药突变进行分析,为乙型肝炎临床治疗提供依据.     

慢性乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床意义

近年来,随着核酸及核酸类似物、聚乙二醇干扰素α等抗病毒药物的问世,使得慢性乙型肝炎临床抗病毒治疗取得了明显发展,同时对乙型病毒肝炎的实验室检测也提出了新的要求,促进了实验室诊断技术的发展.本研究着重讨论临床抗病毒治疗中乙型肝炎病毒DNA定量检测的应用和重要性,指出HBV DNA的定量检测病毒学应答对于判定抗病毒疗效、调整临床抗病毒治疗方案、停药后随访及预测预后等有重要意义.     

飞行时间质谱检测HBV耐药位点变异及其影响因素探讨

目的 建立PCR-MALDI-TOF MS检测乙型肝炎病毒针对核苷类药物耐药突变位点的检测方法,探讨PCR-MALDI-TOF MS技术的影响因素,为正确应用该技术提供参考.方法 采用PCR-MALDI-TOF MS检测10份HBV质粒标准品及100份HBV阳性临床标本(均单独或者联合使用过拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定等核苷类药物),并用PCR产物测序进行验证.结果 100份HBV阳性的临床标本,PCR-MALDI-TOF MS检测耐药阳性结果31份,阴性结果69份.与测序结果相比完全一致的有94份(94%),6份检测结果不一致,其中3份质谱与测序结果均为耐药阳性,但质谱检测结果耐药位点多于测序.PCR-MALDI-TOF MS检测灵敏度为100 copies/μl,突变型的检出阈值为5%.结论 PCR-MALDI-TOF MS技术检测HBV耐药位点变异具有高灵敏度,高准确率,高通量和自动化的特点,适合用于临床对HBV耐药位点进行基因检测.

Abstract：

Objective To establish a rapid method for detection of drug-resistance mutation in HBV, based on PCR-MALDI-TOF MS, and to explore the influential factors on this method. Methods One hundred blood serum samples, which were collected from chronic HBV patients with single drug-resistance or multiple drug-resistance of Lamivudin, Adefovi, Entecavir and Telbivudine, and 10 kinds of mutant HBV plasmids were analyzed using PCR-MALDI-TOF MS and confirmed by PCR-based sequencing. Results Of 100 samples detected, thirty-one samples were positive for drug-resistance and 69 samples were negative. The PCR-MALDI-TOF MS results of 94 samples were completely consistent with PCR-based sequencing. Six samples were inconsistent , of which three samples were positive by the two methods, but more mutation loci were detected by PCR-MALDI-TOF MS than sequencing. The consistent rate of two methods was 94%,detection sensitivity was up to 100 copies/μl, and the cut off value of detectable mutation level was 5%.Conclusion PCR-MALDI-TOF MS could be used for rapid and simple analysis of the drug resistance for the clinical application with features of high sensitivity and accuracy, high throughput and automation.     

加强HBV耐药的认识和监测

抗病毒治疗是慢性乙型肝炎的最关键的治疗.HBV的突变与HBV耐药密切相关.免疫选择和药物治疗对于耐药的产生具有显著的影响.基于PCR的检测技术是监测HBV耐药的主要技术.定期规律的HBV DNA病毒载量的检测是监测HBV耐药的主要技术手段.拉米夫定联合阿德福韦酯治疗拉米夫定耐药的患者,疗效优于单用阿德福韦酯的治疗策略.     

应用液相芯片技术检测拉米夫定耐药相关性HBV变异

法较     

HBsAg阳性血清HBV DNA与HBV标志物定量测定的相关性特征

目的分析HBsAg阳性血清HBV DNA与HBV标志物（HBV M）含量之间的量化关系,揭示两种HBVM血清学模式HBV DNA与HBV M含量的相关性特征。方法对225例血清标本采用PE7000型FQ-PCR仪和AXSYM免疫分析仪分别进行HBV DNA和HBVM的定量测定,以HBV M血清学模式进行HBV DNA分组并分析比较各组的相关性及特点。结果HBsAg/HBeAg/抗-HBc阳性模式的HBV DNA含量54.5%分布在107拷贝/ml以上,HBV DNA的C~G组及抗-HBs、HBeAg、抗-HBe的F~G组含量分别与A组比较差异有统计学意义,且HBV DNA含量与抗-HBs呈负相关（r=-0.670）、与HBeAg和抗-HBe则呈正相关（r=0.524、r=0.814）;而HB-sAg/抗-HBe/抗-HBc阳性模式的HBV DNA含量82.2%分布在105拷贝/ml以下,HBV DNA的B~G组分别与A组比较差异有统计学意义,且仅与抗-HBs呈负相关（r=-0.569）。结论不同HBV M血清学模式HBV DNA与HBV M含量之间存在不同的相关性特征。