低频超声辐照对前列腺癌细胞膜通透性影响的体外实验研究

目的探讨不同强度低频超声对前列腺癌细胞膜通透性的影响。方法应用不同声强的低频超声辐照前列腺癌PC-3细胞悬液,超声辐照5min,占空比20%。辐照后应用荧光显微镜检测FD500染色阳性率及细胞死亡率。结果 5mW/cm2组、20mW/cm2组及80mW/cm2组中细胞FD500染色阳性率分别为0.12±0.04、0.37±0.08、0.73±0.05,各组间比较均有统计学差异(P<0.05),同时随着声强增加,细胞死亡率也逐渐增加。结论低频超声能增加前列腺癌细胞膜通透性,其通透性与声强的强度有关。     

正交优化低频低功率超声联合微泡诱导前列腺癌DUl45细胞早期凋亡的实验研究

目的采用正交实验设计法,优化低频（20kHz）低功率超声联合微泡诱导人雄激素非依赖型前列腺癌DUl45细胞早期凋亡的条件。方法以超声功率、微泡／细胞悬液体积比及超声辐照时间为正交优化的3个因素,每个因素设定3个水平,分别为超声功率60、80、100mW,微泡／细胞悬液体积比10％、20％、30％,超声辐照时间30、60、90S,根据三因素三水平设计正交实验表,得到9个实验组,按相应条件采用连续波辐照,辐照后细胞继续培养24h,采用流式细胞术检测细胞早期凋亡。应用正交优化得到的最优组合条件超声辐照实验组DUl45细胞,对照组细胞不予超声辐照,采用流式细胞术、透射电镜检测、观察实验组及对照组细胞早期凋亡。结果3个因素对细胞早期凋亡的影响程度为：超声功率〉微泡／细胞悬液体积比〉超声辐照时间。各个因素不同水平对细胞早期凋亡的影响程度分别为：超声功率：80mW〉60mW〉100mW,微泡／细胞悬液体积比：20％〉30％〉10％,超声辐照时间：60S〉90S〉30S。最优组合条件下,实验组细胞早期凋亡率为10．41％,对照组细胞早期凋亡率为O．94％。透射电镜下可见实验组细胞较对照组细胞的体积变小变圆,空泡增多,可见明显的凋亡小体形成。结论低频超声联合微泡诱导人雄激素非依赖型前列腺癌DUl45细胞早期凋亡的最优组合条件为：超声功率80mW,微泡／细胞悬液体积比20％,超声辐照时间60S。在此条件下实验组早期细胞凋亡率与对照组相比有明显差异。     

不同辐照模式聚焦超声诱导人胰腺癌细胞凋亡的量效关系

目的 探讨不同辐照模式聚焦超声诱导人胰腺癌细胞凋亡的最佳辐照方案。方法 对人胰腺癌细胞系PaTu 8988t细胞悬液进行聚焦超声辐照:第1组为空白对照组,第2、3组采用脉冲辐照模式,第4、5组采用连续辐照模式,各组辐照剂量通过改变辐照时间来改变。以流式细胞仪检测辐照后24 h肿瘤细胞凋亡率及细胞死亡率。结果 超声辐照后各组的细胞悬液最高温度分别为28.00℃、(42.20±2.17)℃、(50.80±0.84)℃、(55.80±2.17)℃、(65.20±3.11)℃,各组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。各辐照组的细胞凋亡率为(0.56±0.15)%、(1.28±0.16)%、(1.84±0.29)%、(5.74±1.15)%、(2.00±0.84)%,细胞死亡率为(3.28±0.59)%、(4.60±0.47)%、(8.64±2.69)%、(41.12±15.91)%、(49.70±8.02)%,各组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 聚焦超声辐照剂量在接近热凝固温度阈值时,采用连续辐照模式可获得较高的细胞凋亡率及细胞死亡率。     

低强度超声增加前列腺癌细胞膜通透性的体外实验研究

目的探讨低强度超声照射下前列腺癌细胞的细胞膜通透性变化。方法频率为1MHz低强度超声以连续模式照射6孔板中的单层贴壁LNCaP前列腺癌细胞,以正常细胞膜非通透性荧光染料-钙黄绿素(Calcein)标记细胞膜通透性增加的细胞,以核酸荧光染料-碘化丙啶(PI)标记死亡细胞。在声强为160mW/cm2超声下照射5s,荧光显微镜观察细胞膜通透性改变,扫描电镜观察细胞膜的形态变化;分别在不同低声强(80mW/cm2、120mW/cm2和160mW/cm2)超声下照射5s,另外在声强为120mW/cm2超声下分别照射5s、10s和15s,流式细胞仪分析细胞膜通透性增加的细胞比例与声强及照射时间的对应关系。结果低强度超声作用后,荧光显微镜显示部分单层贴壁LNCaP前列腺癌细胞摄取Calcein而呈现绿色荧光,而对照组无细胞摄取Calcein;扫描电镜显示正常LNCaP前列腺癌细胞表面有密集微绒毛,而超声作用后细胞膜表面绒毛稀少、变平,少数细胞表面出现裂孔;流式细胞仪显示细胞膜通透性增加的细胞比例分别随声强和照射时间的增加而增加。结论低强度超声可以增加前列腺癌细胞膜通透性,细胞膜通透性增加的细胞表面变平,少数出现裂孔;细胞膜通透性增加的细胞比例与声强和照射时间均呈正相关。     

低频超声联合微泡增强脂质体介导Racl—shRNA质粒转染前列腺癌细胞及对其生物学行为的影响

目的研究低频超声联合微泡增强脂质体介导的Racl-shRNA质粒转染前列腺癌PC3、DUl45细胞,并探索其对前列腺癌细胞凋亡、侵袭能力的影响。方法基础情况下Westernblot检测RWPE-1细胞、PC3细胞和DUl45细胞的Rac1蛋白表达。根据不同处理方式将细胞分为四组：PC3细胞对照组（A组）、超声加微泡联合脂质体转染PC3细胞组（B组）、DUl45细胞对照组（c组）及超声加微泡联合脂质体转染DUl45细胞组（D组）。通过蛋白质体外结合实验技术检测各组Racl蛋白的活性及表达;流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡情况;细胞侵袭实验检测各组细胞侵袭能力。结果基础情况下前列腺癌PC3、DUl45细胞Racl蛋白表达均较正常前列腺细胞RWPE-1增加,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;低频超声携微泡介导Rac-1shRNA质粒转染细胞后,B组Racl蛋白表达量较A组表达减少,D组表达量较C组减少,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;早期细胞凋亡检测显示,B组高于A组,D组高于C组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;同期细胞侵袭力实验显示,B组穿膜细胞数少于A组,D组的穿膜细胞数少于C组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论低频超声联合微泡可促进脂质体介导的Racl-shRNA质粒转染人雄激素非依赖型前列腺癌细胞;通过抑制PC3、DUl45细胞中Racl蛋白表达可以促进癌细胞的早期细胞凋亡,同时可抑制癌细胞的侵袭能力。     

低频超声对Molt-4肿瘤细胞的生物学效应

目的研究低频超声对Molt-4肿瘤细胞的生物学效应,评价低频超声在肿瘤治疗中的应用价值.方法应用流式细胞术和共聚焦显微镜技术研究低频超声(20 kHz, 0.2 W/cm2)持续辐照Molt-4肿瘤细胞1分钟后的细胞凋亡率和细胞凋亡形态学改变,以及细胞凋亡增殖比(APR)的变化.结果对照和辐照组细胞凋亡率分别为(2.56±0.61)%和(11.06±1.99)%(P<0.01).细胞凋亡具有特征性形态学改变,APR上调.结论低频超声在体外可诱导Molt-4肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖,具有治疗肿瘤潜力.     

低频超声对大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的作用

目的观察低频超声波对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMCs）凋亡的影响。方法42.6kHz超声辐照大鼠主动脉平滑肌细胞,台盼蓝染色分析辐照后即刻细胞存活率,流式细胞仪观察24小时后细胞凋亡。结果低频超声辐照可以诱导培养的VSMCs凋亡,该作用在50秒内随辐照时间的增加有增加的趋势。结论低频超声在无明显杀伤细胞的情况下可在短时间内诱导培养的VSMCs凋亡,提示低频超声是一种潜在的治疗PCI术后再狭窄的手段。     

低频低能量超声联合微泡诱导人前列腺癌细胞PC-3凋亡及对Bcl-2/Bax mRNA表达的影响

目的 研究低频低能量超声联合微泡诱导人雄激素非依赖型前列腺癌细胞凋亡及可能分子机制.方法 以频率21 kHz、声强为46 mW/cm2超声,采用连续波,辐照人前列腺癌PC-3细胞悬液.实验分3组:对照组、单纯超声组和超声联合微泡组(加声诺维200 μl).辐照后,细胞集落实验检测对细胞增殖的影响;辐照后培养24 h,透射电镜及TUNEL染色检测细胞凋亡,实时定量PCR检测对Bcl-2/Bax mRNA表达的影响.结果 超声联合微泡组细胞集落数量明显少于对照组(153.33±10.80对313.33±25.82,P＜0.05),超声联合微泡能明显抑制人前列腺癌细胞的增殖.超声联合微泡组较对照组能明显诱导细胞凋亡(13.33±1.35对0.33±0.17,P＜0.05).超声联合微泡能够下调Bcl-2 mRNA的表达,上调Bax mRNA的表达(P＜0.05).结论 低频低能量超声联合微泡能够诱导人雄激素非依赖型前列腺癌细胞凋亡,并且可能通过下调Bcl-2 mRNA及上调Bax mRNA的表达来实现.     

正交设计法优化超声联合微泡诱导人前列腺癌细胞凋亡的研究

目的采用正交实验设计,探讨超声联合微泡诱导人前列腺癌细胞的凋亡的最优参数组合。方法选定超声功率、辐照时间、微泡/细胞悬液体积比三个因素,又分别按超声功率15、20、25、30 mW/cm2,辐照时间30、60、90、120 s和微泡/细胞悬液体积比10%、20%、30%、40%,每因素四个水平设定正交设计表,按正交设计表进行超声辐照,辐照后细胞继续培养24 h,用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。结果对细胞凋亡的影响因素,超声功率>微泡/细胞悬液体积>辐照时间;各因素水平影响:超声功率:15 mW/cm2>25 mW/cm2>20 mW/cm2>30 mW/cm2,辐照时间:30 s>60 s>120 s>90 s,微泡/细胞悬液体积:20%>10%>30%>40%。结论超声联合微泡诱导人前列腺癌细胞凋亡最佳组合为超声功率15 mW/cm2,辐照时间30 s,微泡/细胞悬液体积比20%。     

低频超声对体外培养肿瘤细胞的凋亡诱导和增殖抑制

目的研究低频超声对Molt-4肿瘤细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响,并评价低频超声在肿瘤治疗中的应用价值.方法应用流式细胞术研究低频超声(20 kHz,0.3 W/cm2)持续辐照Molt-4肿瘤细胞1 min后的细胞凋亡率和细胞周期分布的变化.结果对照组和辐照组细胞凋亡率分别为(2.56±0.61)%和(11.06±1.99)%,G0/G1期百分比分别为(59.78±3.49)%和(79.97±3.78)%,S G2/M期百分比分别为(40.22±3.49)%和(20.03±3.78)%(P＜0.01).凋亡增殖比(APR)上调.结论低频超声在体外能够诱导Molt-4肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖,提示低频超声在肿瘤治疗的临床应用中具有较好潜力.     

低频超声联合微泡影响前列腺癌DU145细胞血管内皮细胞生长因子表达的实验研究

目的探讨低频超声联合微泡对前列腺癌DUl45细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的影响。方法体外培养前列腺癌DUl45细胞,细胞呈对数生长时分为4组进行实验：对照组（细胞悬液1ml）、单纯微泡组（800μl细胞悬液加入200μl微泡剂SonoVue）、单纯低频超声组（1ml细胞悬液以频率80kHz、声强0．45W／cm2超声辐照30S）、低频超声联合微泡组（800μl细胞悬液加入200μl微泡剂SonoVue后立即以频率80kHz、声强0．45W／cm2超声辐照30s）。MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测凋亡率,Western印迹法检测细胞VEGF蛋白的表达。采用单因素方差分析比较对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞存活率、凋亡率、VEGF蛋白表达量差异,进一步组间两两比较采用SNK-q检验。结果对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞存活率分别为100％、（96．50±12．49）％、（93．20±5.31）％、（81．30±9．32）％;凋亡率分别为（1．10±0．26）％、（1．78±0．63）％、（5．85±0．45）％、（9．36±0．90）％;VEGF蛋白表达量分别为0．81±0．05、0．79±0．06、0．58±0．04、0．38±0．05。单纯微泡组、单纯低频超声组细胞存活率与对照组比较差异均无统计学意义,低频超声联合微泡组细胞存活率较对照组降低,且差异有统计学意义（q=5．88,P〈0．05）。单纯微泡组细胞凋亡率、VEGF蛋白表达量与对照组比较差异均无统计学意义;单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞凋亡率均高于对照组,VEGF蛋白表达量均低于对照组,且差异均有统计学意义（q=14．09、24．51、8．06、14．89,P均〈0．05）。低频超声联合微泡组细胞凋亡率高于而VEGF蛋白表达量低于单纯低频超声组,且差异亦均有统计学意义（q=10．42、6．83,P均〈0．05）。结论微泡能增强低频超声抑制前列腺癌DUl45细胞增殖及促进凋亡,其机制可能与其下调前列腺癌DUl45细胞VEGF表达有关。     

低频超声联合微泡造影剂诱导人前列腺癌PC3细胞及DU145细胞自噬的实验研究

目的：研究低频超声联合微泡造影剂对人雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞及DU145细胞自噬的影响。方法2种细胞均各分为空白对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组和低频超声联合微泡组4组,每组设3个复孔。单纯微泡组加200μl的微泡造影剂混匀,不进行超声辐照;单纯低频超声组以声功率80 mW的20 kHz低频超声,不加造影剂,连续波辐照60 s;低频超声联合微泡组加200μl的微泡造影剂,混匀后以声功率80 mW的20 kHz低频超声,连续波辐照60 s;空白对照组不进行任何处理,辐照后的细胞继续培养24 h,吖啶橙染色荧光显微镜与透射电镜观察细胞自噬泡。结果经吖啶橙染色后,荧光显微镜下,2种细胞低频超声联合微泡组的胞质内可见大量红色荧光的酸性囊泡,明显多于其余3组;单纯低频超声组红色荧光的酸性囊泡量亦多于空白对照组,空白对照组与单纯微泡组红色荧光的酸性囊泡量差异不大。透射电镜下,2种细胞的低频超声联合微泡组细胞细胞核基本正常,但胞质内出现大量由双层膜包裹的自噬泡或自噬体,而空白对照组内的细胞形态基本正常,胞质内未见到明显的自噬泡的形成。结论低频超声联合微泡造影剂能明显诱导人雄激素非依赖型前列腺癌PC3细胞及DU145细胞的自噬。     

薄荷醇抑制前列腺癌DU145细胞的增殖和迁移

目的探讨薄荷醇对雄激素非依赖性前列腺癌DU145细胞增殖和迁移能力的影响。方法通过RT-PCR、免疫组织化学和Western blot方法检测TRPM8和TRPA1的表达;MTT和划痕试验检测薄荷醇对DU145细胞的增殖和迁移能力的影响;流式细胞术检测TRPM8对DU145细胞周期和凋亡的影响。结果 RT-PCR、免疫组织化学和Western blot提示TRPM8在DU145细胞中高表达而TRPA1在DU145细胞中不表达;薄荷醇能诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,与未经薄荷醇处理的细胞相比,经100μmol/L薄荷醇处理的细胞培养24、48和72h后,G0/G1期细胞显著增加（49.12%±1.92%vs61.71%±2.70%、77.65%±1.63%、71.81%±2.46%,P〈0.05,P〈0.01）,进而抑制细胞增殖（P〈0.05）,并抑制细胞迁移（P〈0.05）,流式细胞术检测显示薄荷醇并不引起细胞凋亡。结论 TRPM8可能成为前列腺癌治疗的一个新靶点,对于高表达TRPM8的雄激素非依赖性前列腺癌针对TRPM8通道的药物治疗可能比TRPM8基因治疗更为实用,因此,薄荷醇作为一个潜在的抗肿瘤药物也拥有很大的发展前景。     

EB1089对前列腺癌DU145细胞生长和凋亡的影响

目的研究EB1089对前列腺癌DU145细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法体外培养DU145细胞,以1、10、50、100 nmol/L的EB1089分别作用24、48、72 h,MTT法和流式细胞技术检测EB1089对DU145细胞的增殖和凋亡,Western blot检测各浓度的EB1089作用48 h后,DU145细胞Gli蛋白的表达变化。结果 EB1089可以抑制DU145细胞的增殖,诱导DU145细胞凋亡。不同浓度EB1089作用48 h后,DU145细胞Gli蛋白表达下降。结论 EB1089可能通过Hedgehog信号通路抑制DU145细胞增殖、诱导其凋亡。     

Sorafenib对前列腺癌DU145细胞的抑制作用的研究

目的观察索拉非尼（Sorafenib）对雄激素非依赖性前列腺癌Du145细胞的抑制作用。方法用不同浓度Sorafenib处理前列腺癌DU145细胞24、48和72h后,MTT法检测Sorafenib对DUl45细胞的抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡变化,Westernblot检测不同浓度Sorafenib处理72h后DU145细胞内ERK和Bcl-2的表达。结果Sorafenib能显著抑制DU145细胞的体外生长,呈时间与剂量依赖性。DUl45细胞凋亡率随着Sorafenib剂量的增加而增大,具有良好的量效关系（P〈0．01）;Sorafenib处理DU145细胞72h后,ERK和Bcl-2蛋白的表达明显下调（P〈0．01）。结论Sorafenib抑制DU145细胞增殖、诱导细胞凋亡,可显著抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞的体外生长。     

腺病毒介导的NDRG2基因对前列腺癌细胞株DU145的影响

目的:探讨腺病毒介导的N-myc下游调节基因2(NDRG2)基因对前列腺癌细胞株DU145增殖抑制及诱导其凋亡的作用.方法:以携带人NDRG2基因的腺病毒载体转染体外培养的前列腺癌细胞株DU145.采用westernblot检测目的基因的表达,通过细胞生长实验、平板克隆实验检测NDRG2对DU145细胞增殖能力的影响.流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡的情况:光镜观察细胞形态学的改变.结果:DU145细胞经腺病毒转染后westernblot检测有NDRG2蛋白(40 kD)特异表达.MTT比色及平板克隆实验结果显示NDRG2对DU145细胞生长有明显抑制作用(P<0.05).流式细胞检测结果显示Ad-NDRG2组凋亡率明显高于对照组及Ad-LacZ组,差异有显著性(P<0.05).与对照组及Ad-LacZ组比较,光镜下观察可见Ad-NDRG2转染的细胞生长状态明显变差,细胞变圆,边缘模糊.结论:通过腺病毒载体使细胞表达NDRG2基因,可以明显抑制DU145细胞的生长和增殖,并可诱导细胞凋亡.     

低频超声辐照微泡造影剂增强米托蒽醌对乳腺癌细胞的毒性作用

目的 观察超声辐照微泡造影剂对米托蒽醌杀伤人乳腺癌细胞MCF-7作用的影响,并探讨其作用机制.方法 以MTT法检测米托蒽醌对MCF-7细胞的细胞毒作用,计算其24 h的IC_(50)值.将对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7分为单纯米托蒽醌组(D组)、超声+米托蒽醌组(U+D组)、超声+微泡+米托蒽醌组(U+M+D组)、空白对照组(C组).以MTT法检测各组细胞活性, 高效液相色谱法测定用药各组细胞内米托蒽醌的含量,采用透射电镜观察MCF-7 细胞形态学特征.结果 米托蒽醌对MCF-7细胞的IC_(50)值为2.87μg /ml.各组细胞经处理后培养24 h,细胞活性率C组＞D组＞U+D组＞U+M+D组,各组间差异有统计学意义(P<0.05).高效液相色谱法测定用药各组细胞内米托蒽醌的含量为U+M+D组＞U+D组＞D组,差异有统计学意义(P<0.05).透射电镜可观察到MCF-7 细胞凋亡的典型形态学改变.结论 低频超声辐照可促进化疗药物进入肿瘤细胞内,增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用,而低频超声辐照微泡可进一步增强该效应.