mdr1启动子调控胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因对卵巢癌裸鼠耐药移植瘤的抑制作用

目的:观察人多药耐药基因mdrl启动子调控的胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合自杀基因(CD::upp)对紫杉醇耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及对荷瘤裸鼠生存时间的影响。方法:建立卵巢癌耐药及非耐药细胞的裸鼠模型,将含mdrl-CD::upp的重组腺病毒0．1ml(1×10~9 pfu/ml)注入裸鼠皮下移植瘤体内,腹腔内注射5-氟胞嘧啶(5-FC),观察各组裸鼠肿瘤生长速度及存活时间。结果:实验组裸鼠移植瘤明显受到抑制,与对照组的差异有统计学意义(P＜0．05)。实验组荷瘤裸鼠的生存时间明显延长,对照组在69天内全部死亡,差异有统计学意义(P＜0．001)。结论:mdrl启动子调控的CD::upp基因能特异性地抑制卵巢癌裸鼠耐药移植瘤的生长并延长生存时间。     

谷胱甘肽S-转移酶P1启动子调控胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因对卵巢癌顺铂耐药细胞的体内杀伤作用

卵巢癌是恶性程度最高的妇科肿瘤之一，化疗药物顺铂作为卵巢肿瘤治疗的一线药物，价格低廉，疗效较好。但是，对顺铂存在耐药是卵巢癌治疗中的主要障碍，对晚期患者即使给予标准化化疗，也不能明显延长其生存时间，5年生存率低于30％。谷胱甘肽S-转移酶(glutathion Stransferases，GSTs)是一个多功能同工酶家族，与多种细胞内毒性复合物的毒性解除作用有关。在卵巢肿瘤细胞株的     

谷胱甘肽-S-转移酶P1启动子调控的胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因对卵巢癌顺铂耐药细胞的体外杀伤作用

目的　观察谷胱甘肽 S 转移酶P1(GSTP1)启动子调控的胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因 (CD UPP ,即自杀基因 )表达的腺病毒载体 ,对卵巢癌顺铂耐药细胞的体外杀伤作用。方法　采用细菌内同源重组法构建腺病毒载体 ,设立卵巢癌顺铂敏感细胞株A2 780和以其诱导的耐药细胞株A2 780 /DDP ,在体外用重组腺病毒转染两组细胞并联合应用前药 5 氟胞嘧啶 (5 FC) ,观察两组卵巢癌细胞对 5 FC的敏感性。将CD UPP阳性和CK UPP阴性的A2 780 /DDP细胞按不同比例混合后给予 5 FC ,观察 5 FC对混合细胞的杀伤作用。结果　当重组腺病毒滴度为 10 0感染复数(MOI)、5 FC浓度为 2 5 0 μg/ml时 ,对顺铂耐药的A2 780 /DDP细胞的存活率为 (3 6± 1 0 ) % ,对顺铂敏感的A2 780细胞的存活率为 (76 5± 2 8) % ,两者比较 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。此外 ,2 0 ? UPP阳性A2 780 /DDP细胞 ,即可引起 80 3%的混合细胞死亡 ,CD UPP / 5 FC系统表现出明显的旁观者效应。结论　由腺病毒介导的含有GSTP1调控的CD UPP/ 5 FC系统 ,对卵巢癌顺铂耐药细胞具有特异性杀伤作用 ,为临床上克服卵巢癌化疗耐药 ,提供了一条安全、高效的治疗途径。     

姜黄素对卵巢癌耐药细胞A2780/taxol凋亡诱导作用及其机制探讨

目的探究姜黄素对卵巢癌耐药细胞A2780/taxol凋亡诱导作用及其机制。方法体外培养卵巢癌耐药细胞A2780/taxol细胞株,实验分为:A组(紫杉醇100μg/ml)、B组(紫杉醇100μg/ml+姜黄素10μmol)、C组(紫杉醇100μg/ml+姜黄素20μmol)、D组(紫杉醇100μg/ml+姜黄素40μmol)、E组(紫杉醇100μg/ml+姜黄素80μmol)。导致显微镜下观察姜黄素作用A2780/taxol细胞后细胞形态;MTT法检测细胞增殖的影响,Western Blot检测P-糖蛋白(P-gp)、蛋白激酶C-α(PKC-α)表达情况,用流式细胞仪检测A2780/taxol细胞凋亡情况。结果紫杉醇与不同浓度姜黄素作用A2780/taxol细胞,较A组能够明显抑制细胞生长(P<0.05);Western Blot检测姜黄素干预组P-gp、PKC-α蛋白表达水平低于对照组(P<0.05);姜黄素组A2780/taxol细胞凋亡率高于常规培养组(P<0.05);姜黄素联合紫杉醇组A2780/taxol细胞凋亡率高于单独使用紫杉醇组(P<0.05)。结论姜黄素可通过抑制P-gp、PKC-α蛋白表达,提高紫杉醇对A2780/taxol细胞毒性,进而降低细胞耐药性,另外姜黄素可促进A2780/taxol细胞凋亡。     

IL-2基因转移对卵巢癌细胞系SKOV3粘附性的影响

目的：研究ＩＬ－２基因转移对卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞系粘附性的影响。方法：细胞对塑料基质、细胞基底膜成分的粘附实验,流式细胞术测定ＣＤ４４Ｈ的表达。结果：ＥＤＴＡ介导的细胞分离实验表明,ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２细胞对塑料基质的粘附能力明显下降（Ｐ＜０．０１）;对基质及基底膜成分的粘附实验表明,ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２细胞对Ⅳ型胶原和ｍａｔｒｉｇｅｌ的粘附能力下降,但对ＬＮ、ＦＮ的粘附能力无明显改变;粘附分子ＣＤ４４Ｈ的表达：ＳＫＯＶ３、ＳＫＯＶ３／Ｎｅｏ、ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２组细胞粘附分子ＣＤ４４Ｈ阳性细胞百分率分别为７６．２％、６６．７％和３７．８％,ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２组明显降低（Ｐ＜０．００１）。结论：ＩＬ－２基因修饰可使卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３粘附能力下降。     

多药耐药基因反义寡脱氧核苷酸对卵巢癌细胞株SKOV3多药耐药性逆转的作用

目的 探讨多药耐药基因（ｍｄｒ１）反义寡脱氧苷酸（ＡＳＯＮ）对卵巢癌细胞多药耐药性的逆转作用。方法 以人ｍｄｒ１基因转导产生的耐药卵巢癌ＳＫＯＶ３／ｍｄｒ１细胞为模型,采用２５０μｇ／ｍｌ ｍｄｒ１－ＡＳＯＮ,作用于ＳＫＯＶ３／ｍｄｒ１细胞,采用流式细胞术及罗丹明１２３排出试验,检测ＳＫＯＶ３／ｍｄｒ１细胞ｍｄｒ１基因产物Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）的阳性率及其功能。并进行ＳＫＯＶ３／ｍｄｒ１细胞集落培养,观察耐药性。结果 ｍｄｒ１－ＡＳＯＮ作用后,ＳＫＯＶ３／ｍｄｒ１细胞的Ｐ－ｇｐ阳性率由３８．９％减少至２１．３％（Ｐ〈０．０１）,ＳＫＯＶ３／ｍｄｒ１细胞内罗丹明的潴留率,由３２．１％增加至５０．７％（Ｐ〈０．０１）。ＳＫＯＶ３／ｍｄｒ１细胞加ｍｄｒ１－ＡＳＯＮ和空白对照细胞形成抗性细胞集落的相对百分数,在泰素浓度     

双氢青蒿素对人卵巢癌耐药细胞SKOV3/CDDP的体外作用

目的:观察双氢青蒿素对SKOV3/CDDP细胞的体外作用,分析双氢青蒿素抗肿瘤和逆转耐药的效果.方法:采用MTT法观察顺铂、双氢青蒿素以及顺铂联合双氢青蒿素对SKOV3及SKOV3/CDDP细胞的体外影响.结果:①顺铂对SKOV3/CDDP细胞的IC50为34.12 mg/L,是对SKOV3细胞的(IC50为7.52mg/L)4.54倍.②不同浓度的双氢青蒿素对两种细胞的抑制作用随浓度的增加而增强,呈明显的剂量依赖性,组间比较差异有统计学意义(P<0.05).双氢青蒿素对SKOV3细胞的IC50为27.45 μmol/L,对SKOV3/CDDP细胞的IC50为29.22 μmol/L.③不同浓度的双氢青蒿素联合顺铂作用于SKOV3细胞,顺铂Ic50由单用时的7.52 mg/L,下降到联用时的5.30 mg/L和2.16 mg/L.对SKOV3/CDDP细胞,顺铂Ic50由单用时的34.12 mg/L,下降为到联用时的15.25 mg/L和4.83 mg/L.结论:双氢青蒿素对人卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/CDDP具有体外抑制作用,对顺铂具有化疗增敏的作用,并能逆转SKOV3/CDDP对顺铂的耐药.     

KDM5B基因在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌耐药能力的影响

目的:检测组蛋白去甲基化转移酶KDM5B(JARID1B/PLU-1)在正常卵巢、卵巢癌组织及细胞株中的表达,以及其对卵巢癌细胞株耐药能力的影响。方法:RT-q PCR法检测KDM5B在36例卵巢癌、15例正常卵巢、6例术后化疗耐药复发患者组织及卵巢上皮细胞株IOSE和5株卵巢癌细胞中的表达情况;构建p MSCVpuro-KDM5B过表达质粒和p GIPZ-sh1、p GIPZ-sh2干扰质粒,并筛选得到稳定过表达的SKOV3和稳定干扰的Caov3细胞株,RT-q PCR和Western blot法鉴定调控效果;用浓度梯度递增的顺铂处理SKOV3过表达和Caov3干扰细胞株,CCK-8法检测顺铂半抑制浓度(IC50)变化。结果:RTq PCR结果示,正常卵巢组织中KDM5B相对表达量(1.950±0.3003)低于卵巢癌组织(4.924±0.2989),差异有统计学意义(t=5.909,P0.0001)。KDM5B表达量与卵巢癌患者的FIGO分期、病理分级、转移和耐药发生明显相关,与患者年龄、CA125水平不相关。6例复发患者中,5例KDM5B表达明显升高(P0.001)。KDM5B的mRNA和蛋白水平在卵巢上皮性细胞株IOSE中最低,在卵巢癌细胞株SKOV3、HO-8910、ES-2、A2780、Caov3中表达逐渐增加。RT-q PCR结果示,SKOV3过表达组的KDM5B表达量为对照组的27.4倍,Caov3干扰sh1和sh2组分别为对照组的0.38和0.41倍,Western blot也显示过表达和干扰有效。用浓度梯度递增的顺铂处理Caov3细胞株,KDM5B表达量随顺铂浓度增加而逐渐升高;检测SKOV3细胞株KDM5B过表达组IC50为3.666(95%CI为3.067~4.382)μg/ml高于对照组[1.676(95%CI为1.553~1.810)μg/ml],Caov3细胞株干扰sh1组和sh2组分别为3.359(95%CI为2.875~3.925)μg/ml、2.881(95%CI为2.49~3.324)μg/ml,均低于对照组[6.972(95%CI为6.182~7.864)]。结论:组蛋白去甲基化转移酶KDM5B在卵巢癌中表达升高,并且具有促进卵巢癌细胞株耐药的作用。     

融合型自杀基因Fcy::Fur联合5-氟胞嘧啶对人卵巢癌细胞株HO-8910体外杀伤作用的初步研究

卵巢癌基因治疗的研究备受关注，而自杀基因疗法被认为是最有希望的策略之一，其具有一个独特的杀伤机制，即“旁观者效应”，转染了自杀基因的肿瘤细胞被杀死，且周围大量未被转染的肿瘤细胞也被杀死，此效应的意义在于只需少量的肿瘤细胞转染自杀基因，就可产生广泛的杀伤作用。近年研究较为广泛的自杀基因是胞嘧啶脱氨酶(CD)基因与5-氟胞嘧啶(5-FC)系统。     

miR-17～92基因簇过表达调控PTEN、BIM蛋白对卵巢癌SKOV3细胞紫杉醇耐药的影响

目的:分析miRNA-17~92基因簇过表达与卵巢癌SKOV3细胞紫杉醇耐药的关系,为卵巢癌化疗耐药的研究提供理论依据。方法:脂质体法将构建的p EGFP-N1-miR-17~92质粒转染入卵巢癌SKOV3细胞。Real time-PCR法及Western blot法分别检测转染前后miR-17~92及BIM、PTEN表达。结果:与SKOV3细胞相比,空质粒p EGFPN1转染的SKOV3-p EGFP-N1细胞miR-17~92含量0.970,与对照组比较差异无统计学意义(t=0.581,P=0.620);过表达质粒p EGFP-N1-miR-17~92转染的SKOV3-p EGFP-N1-miR-17~92细胞miR-17~92含量2.082,与对照组比较差异有统计学意义(t=-5.602,P=0.030);SKOV3-p EGFP-N1-miR-17~92细胞组的miR-17~92 mRNA相对表达量与SKOV3-p EGFP-N1细胞组比较,差异有统计学意义(t=-8.473,P=0.014)。不同浓度紫杉醇作用于转染p EGFP-N1-miR-17~92质粒后细胞,miR-17~92过表达使BIM蛋白表达下降,对PTEN蛋白表达的影响不明显。结论:miR-17~92基因簇与卵巢癌SKOV3细胞紫杉醇耐药有关。miR-~92基因簇过表达影响卵巢癌耐药的机制是通过下调BIM蛋白而非PTEN蛋白参与。     

半胱天冬酶3前酶增强胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶融合双自杀基因系统治疗人卵巢癌的体外研究

目的探讨半胱天冬酶3前酶(procaspase3)能否增强胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶/5氟胞嘧啶+更昔洛韦(CDTK/5FC+GCV)系统对人卵巢癌细胞的体外杀伤作用。方法构建procaspase3的表达载体pcDNA3casp3和人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控下的CDTK融合双自杀基因表达载体pBTdel279CDTK。应用蛋白印迹法检测pcDNA3casp3和pcDNA3质粒转染后的3AO细胞(3AOpcDNA3casp3、3AOpcDNA3细胞)中procaspase3蛋白的表达情况;应用RTPCR技术检测pBTdel279CDTK和pBTdel279分别转染的3AOpcDNA3casp3和3AOpcDNA3细胞中CD和TK基因的表达情况;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪技术、蛋白印迹法和荧光底物分析法分别检测4种细胞在CDTK/5FC+GCV系统作用后的细胞存活率、细胞周期及半胱天冬酶3(caspase3)活性。结果3AOpcDNA3casp3细胞有明显的procaspase3蛋白表达,而3AOpcDNA3细胞则无表达。3AOpcDNA3casp3和3AOpcDNA3细胞在pBTdel279CDTK转染后均可检测到CD和TK基因,但在pBTdel279质粒转染后则CD和TK基因表达均为阴性。在5FC+GCV作用下,3AOpcDNA3casp3+pBTdel279CDTK细胞的存活率显著低于3AOpcDNA3+pBTdel279CDTK细胞。在5FC(2mmol/L)+GCV(10μg/ml)作用48h后,3AOpcDNA3casp3+pBTdel279CDTK细胞的凋亡率为37.98%,S期比例为49.67%,分别高于3AOpcDNA3+pBTdel279CDTK细胞的21.34%和35.76%,两者分别比较,差异有统计学意义(P<0.05)。在5FC(1mmol/L)+GCV(1μg/ml)作用48h后,3AOpcDNA3casp3+pBTdel279CDTK细胞中的caspase3活性值为189.7,高于3AOpcDNA3+pBTdel279CDTK细胞的44.9,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论procaspase3可显著增强CDTK/5FC+GCV系统对人卵巢癌细胞的杀伤作用。     

小分子干扰RNA对卵巢癌紫杉醇耐药株的多药耐药性逆转的研究

目的 探讨小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNA）对A2780／Taxol细胞多药耐药性的逆转作用：方法 2005-07—2005-12华中科技大学同济医学院附属协和医院根据多药耐药基因1（MDR1）序列设计2条siRNA，将siRNA包装入质粒，经转化、克隆、扩增、纯化，与pEGFPN-1质粒一起共转染A2780／Taxol细胞，流式细胞仪、MTF、RT-PCR和Western blot分别检测转染效率、紫杉醇的半数抑制浓度（IC50）、细胞P-gp蛋白及MDR1 mRNA表达。结果 两种重组质粒与EGFP质粒转染效率无明显差异，P-gp表达水平明显下调。两条siRNA对紫杉醇敏感性的相对逆转率分别达63．8％及51．2％。MDR1基因不同程度的沉默，MDR-A能更有效封闭MDR1基因,MDR1 mRNA相对水平下降（67．3±0．8）％.结论 siRNA能有效逆转MDR1基因编码P-gP介导的A27801Taxol细胞多药耐药．     

IL-2基因转移对卵巢癌细胞系SKOV3致瘤性的影响

目的：探讨ＩＬ－２基因转移对卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３致瘤性的影响。方法：通过贴壁集落形成检查、软琼脂集落形成检查和裸鼠皮下成瘤试验，测定ＩＬ－２基因转移对卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３致瘤性的影响。结果：ＳＫＯＶ３、ＳＫＯＶ３／Ｎｅｏ和ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２细胞贴壁集落形成率、软琼脂集落形成率分别为５２％、４５％、０．７％和３１．４％、２８．５％、２．４％，ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２细胞所形成的集落内细胞少，结构松散；裸鼠皮下成瘤实验显示，３组细胞皮下成瘤率分别为１００％（１２／１２）、９１．７％（１１／１２）及５６．３％（９／１６）；成瘤潜伏期平均分别为６．７±０．９ｄ、１１．４±４．０ｄ、１５．１±６．４ｄ，肿瘤终体积平均分别为１６０４．３±１４６９．４ｍｍ３、１１３０．３±１１５９．７ｍｍ３及２３３．３±１２６．４ｍｍ３；ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２细胞皮下瘤增殖较ＳＫＯＶ３／Ｎｅｏ和ＳＫＯＶ３细胞明显缓慢（Ｐ＜０．００１）。镜下见ＳＫＯＶ３及ＳＫＯＶ３／Ｎｅｏ组肿瘤呈浸润性生长，并于皮下和肌肉间形成转移病灶，ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２组肿瘤呈假包膜状生长，瘤内见大量单个核细胞浸润。结论：ＩＬ－２基因转移可降低细胞系ＳＫＯＶ３的致瘤?     

IL-2基因转导对卵巢癌细胞化疗药物敏感性的影响

目的:探讨IL-2基因转导能否改变卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。方法:用MTT法测定导入人IL-2基因的卵巢癌细胞对化学治疗药物顺铂、阿霉素、泰素及足叶乙甙治疗的敏感性及IC_50,以导入新霉素基因的卵巢癌细胞系及野生型卵巢癌细胞系为对照。结果:IL-2基因转移使SKOV3细胞对上述化疗药物治疗的敏感性有所提高,但仅对VP-16治疗敏感性的提高差异有显著性（P<0.05）。结论:IL-2基因导入SKOV3细胞没有降低其对实验药物治疗的敏感性。     

Gene therapy of adenovirus mediated CD ::upp/5-FC directed by GSTP1 promoter in cisplatin-resistant ovarian cancer

PURPOSE: To evaluate the specific killing effect of the adenoviral vector in which CD ::upp genes were directed by the GSTP1 promoter on cisplatin-resistant ovarian cancer cells. EXPERIMENTAL DESIGN: Cisplatin-sensitive (A2780) and cisplatin-resistant (AD6) ovarian cancer cells were infected with recombinant adenoviral plasmid carrying the CD ::upp gene driven by the GSTP1 promoter and followed with 5-FC administration. RESULTS: In vitro, when MOI was 100 and 5-FC was 250 microg/ml, relative survival rate of the AD6 cells was only 3.63 +/- 1.01%, while under the same conditions, A2780 cells were 76.50 +/- 2.81%. Significant bystander effect was caused by the CD ::upp gene and 20% of gene-transferred AD6 cells caused death to 80.3% of the total cells. Furthermore, a significant anti-tumor effect of the Ad.GST-CD ::upp/5-FC was observed in nude mice bearing tumors of AD6 cells. CONCLUSIONS: These results indicated that adenovirus-mediated Ad.GST-CD ::upp/5-FC directed by GSTP1 promoter is an effective approach to overcome cisplatin-resistant ovarian cancer.     

脂质体转染白介素-12基因至卵巢癌SKOV3细胞检测VEGF表达及抗肿瘤作用探讨

目的:观察含mIL-12基因的质粒转染至SKOV3卵巢癌细胞,效应细胞存在情况下对卵巢癌细胞株血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:用脂质体转染技术将基因质粒及空质粒转染至SKOV3卵巢癌细胞(SKOV3/IL-12)及SKOV3/neo;用ELISA法检测IL-12及INF-γ的表达;用逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)半定量法测定SKOV3/IL-12+S(脾细胞)0,12,24,36,48,60hVEGFmRNA含量;用ELISA法测定细胞培养上清液中VEGF蛋白含量及其抑制率。结果:基因转染至SKOV3可检测到IL-12蛋白表达;分泌的IL-12蛋白具有活性,使脾细胞产生INF-γ,12h时迅速出现,作用后24h表达量最高;SKOV3/IL-12细胞与脾细胞作用12h后即出现VEGFmRNA表达抑制,24h达到高峰,与对照组有显著差异(P0.05);培养24h后上清中VEGF蛋白含量减少,与对照组有显著差异(P0.05)。结论:将IL-12基因转染至SKOV3卵巢癌细胞并表达IL-12;分泌的IL-12蛋白具有活性,使脾细胞产生INF-γ;SKOV3/IL-12与效应细胞脾细胞作用后产生INF-γ能在核酸水平下调VEGF并能抑制VEGF蛋白的表达。     

白细胞介素-2基因转导对卵巢癌细胞SKOV3形态及增殖的影响

OBJECTIVE: To study the effect of interleukin-2 (IL-2) gene transfer on the proliferation and morphology of ovarian cancer cell line SKOV3. METHOD: IL-2 gene was introduced into ovarian cancer cell line SKOV3. The morphologic changes, mitosis, proliferation curve, 3H-uptaking and cell cycle were studied. RESULTS: IL-2 cDNA, 490 bp, was transduced. IL-2 gene expression was detected. IL-2 activity was 30-318 U/10(6) cells/24hr. IL-2 gene modified cell is squamas like with smaller nucleus/cytoplasm ratio, larger cell area and more homogeneous. The ultrastructural study showed that the cytoplasma of IL-2 gene modified cells is markedly vacuolized and the chromatin is condensed. There was less mitosis found in SKOV3/IL-2 cells. SKOV3/IL-2 cell proliferate more slowly, the doubling time prolonged from 38.40 hr to 65.36 hr, 3H-uptaking decreased 52.3% of the parent cell. The cell cycle study showed that SKOV3/IL-2 cell was blocked to phase G1/G0. CONCLUSIONS: The retrovirous vector can transduce Il-2 gene into ovarian cancer cell line SKOV3 effectly. IL-2 gene transfer can induce morphologic changes of SKOV3 cells, which may indicate the biologic behavior changes of the targets. IL-2 gene transfer can induce the proliferation inhibition of SKOV3 cells.