人胎盘组织来源造血干/祖细胞及其特性

背景:近年来的研究表明,除已知的人骨髓、外周血和脐带血中存在造血干/祖细胞外,人胎盘组织中也有造血干/祖细胞存在.目前为止,还缺乏对人胎盘组织造血干/祖细胞的增殖分化特性及人胎盘组织淋巴细胞亚群组成和免疫原性等的深入研究.目的:探究人胎盘组织是否含有比脐带血更丰富的造血干/祖细胞,并对其造血祖细胞系增殖分化能力进行检测,同时对人胎盘组织淋巴细胞亚群组成及表型特征进行分析.设计、时间及地点:开放性实验,于2004-01/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.材料:经产妇知情同意,无菌采集遵义医学院附属医院产科健康足月分娩新生儿胎盘和脐带血共12份.淋巴细胞亚群检测试剂盒,CD34绝对计数试剂盒(Becton Dickinson公司):CD34磁珠分选试剂盒,FITC标记的CD38单克隆抗体,抗FITC磁珠和MS/LS免疫磁式细胞分选柱(Miltenyi Biotec).方法:脐带血与RPMI-1640培养基(含体积分数为0.1的胎牛血清)按1:1的比例混合,采用Ficoll-Histopaque分离液离心30min,吸取界面层细胞,PBS洗涤一次,获得脐带血单个核细胞.采用机械法加0.25g/L胶原酶消化制备胎盘组织单个细胞悬液,之后同脐带血单个核细胞分离步骤分离胎盘单个核细胞.流式细胞仪检测胎盘单个核细胞中CD34 CD38-, CD34 CD38 造血干/祖细胞(HSPCs)和淋巴细胞亚群的组成比例.免疫磁珠分选法分选人胎盘CD34 CD38-,CD34 D38 造血干/祖细胞,并分别进行粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位系集落形成培养,以评价其造血祖细胞系增殖分化能力.实验全程用脐带血作平行比较分析.主要观察指标:胎盘和脐带血CD34 造血干/祖细胞组成百分率、祖细胞系集落形成能力、淋巴细胞亚群表型及组成特点.结果:[1]胎盘CD34 造血干/祖细胞百分率是脐带血的8.8倍,差异有显著性意义(P<0.01).[2]胎盘中的淋巴细胞总数、T细胞(CD3 CD2 )、B细胞(CD19 )、Th(CD3 CD4 )细胞及Th/Ts比值均明显低于脐带血,而CD8 CD28-T抑制细胞则明显高于脐带血,差异有显著性意义(P<0.01).[3]胎盘CD34 CD38 造血干/祖细胞亚群培养形成的粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位集落数明显高于CD34 CD38-造血干/祖细胞亚群(P<0.01);胎盘与脐带血造血干/祖细胞中相同表型细胞亚群形成的各系集落数比较,差异无显著性意义(P0.05).结论:人胎盘组织富含CD34 造血干/祖细胞,其CD34 CD38 、CD34 CD38-两个造血干/祖细胞亚群均具有增殖分化为粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位的能力,并且人胎盘组织具有淋巴细胞亚群低比例和抑制性T细胞高比例的特点,使其有望成为造血干/祖细胞移植的新来源.     

间充质干细胞对脐血CD34^＋细胞扩增及其细胞特性变化的影响

本研究探讨脐带间充质干细胞（MSC）对CD34^＋细胞（HSPC）体外扩增的支持作用及对CD34^＋细胞表面标志、归巢黏附分子、集落形成能力等干细胞特征变化的影响。用免疫磁珠法从新鲜分离的脐血单个核细胞分离CD34^＋造血干祖细胞（HSPC）；用MSC饲养层（feeder）制备经^137Cs照射的间充质干细胞饲养细胞（MSC feeder cells）。将CD34^＋细胞接种在不同的培养体系中，实验分为3组：HSPC＋CK组为培养液中加入细胞因子组合（SCF、FL和TPO），HSPC＋MSC组为CD34^＋细胞接种在MSC feeder上，HSPC＋MSC＋CK组同时加入细胞因子组合及MSC饲养细胞。培养后4、7、10、14天计数有核细胞总数（MNC），计算细胞扩增情况；用流式细胞术检测不同处理组间CD34^＋细胞及亚群免疫表型、归巢黏附分子和集落形成能力。结果表明：在2周的培养时间里，3组MNC和CD34^＋细胞均明显增加，MNC扩增数依次HSPC＋MSC＋CK组〉HSPC＋CK组〉HSPC＋MSC组。体外扩增10天内HSPC＋MSC＋CK组MNC得到大量的扩增，同时CD34^＋细胞的扩增亦较高。培养4天3组细胞CD34^＋比例较0天有明显下降（P〈0．01）；扩增后CD34^＋细胞比例：HSPC＋MSC组〉HSPC＋MSC＋CK组〉HSPC＋CK组（P〈0．01）；各组CD34^＋细胞亚型细胞比例有所不同，HSPC＋CK组4天时CD34^＋CD38^-细胞有一过性升高（62．71％），之后迅速降低，7天时为0．05％；HSPC＋MSC组7天时CD34^＋CD38^-细胞比例为18．92％，与HSPC＋CK组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。从集落形成分析结果看出：MSC、细胞因子混合组扩增后细胞集落形成能力在不同时间点均维持在较高水平。结论：脐血CD34^＋细胞在体外短期培养（〈7天）下，MSC和细胞因子联合应用能同时使CD34^＋细胞得到明显的扩增并维持造血干祖细胞的生物学特征。     

人胎盘造血干/祖细胞及淋巴细胞亚群表型的研究

目的　探讨人胎盘组织中是否含有造血干 祖细胞 (HSPC) ,并分析其淋巴细胞亚群的表型特征。方法　将新鲜胎盘制成单个细胞悬液 ,用流式细胞仪分析其有核细胞中HSPC、淋巴细胞及其亚群的表型特征 ,并用流式细胞术 (FCM)或MiniMACS分选胎盘CD34 细胞。结果　胎盘CD34 细胞百分率是脐带血的 8.8倍 ,CD34 CD38- 细胞和CD34 CD38 细胞百分率分别为脐带血的 4 .6倍和 11.9倍 ;FCM分选胎盘CD34 细胞的回收率和纯度分别为 (6 3.0 5± 10 .14 ) %和 (86 .39± 11.2 7) % ;胎盘中的淋巴细胞总数、T细胞 (CD3 CD2 )、B细胞 (CD1 9 )、Th(CD3 CD4 )细胞及Th Ts比值均明显低于脐带血 ,而CD8 CD2 8- T抑制细胞则明显高于脐带血。结论　人胎盘富含HSPC ,在胎儿期具有重要的造血功能 ,可望成为HSPC移植的重要资源。CD8 CD2 8- T抑制细胞可能在胎 母免疫耐受中起重要作用。     

人胎盘与脐动、静脉血造血干/祖细胞归巢相关黏附分子表达的研究

为了评价人胎盘组织造血干/祖细胞(hematopoieticstem/progenitorcell,HSPC)的归巢能力,采用机械法制备人胎盘组织单个细胞悬液,用流式细胞术分析胎盘组织及脐动、静脉血有核细胞中CD34+细胞及其亚群的含量,检测三者来源的CD34+细胞表面归巢相关黏附分子CD44、CD11a、CD62L、CD49d、CD49e和CD54的表达水平。结果显示,胎盘组织CD34+细胞及CD34+CD38-细胞百分率明显高于脐动、静脉血;脐动脉与脐静脉血中HSPC百分率没有明显差异。胎盘来源CD34+细胞高度表达黏附分子CD11a、CD49d、CD44、CD49e及CD54,其中表达CD49e及CD54水平明显高于脐动、静脉血CD34+细胞。胎盘来源的CD34+CD62L+细胞百分率为(64.58±15.52)%,低于脐静脉血来源的表达。结论:人胎盘富含HSPC。胎盘来源的CD34+细胞多数黏附分子的表达水平近似或高于脐血,提示胎盘HSPC的归巢能力有可能强于脐带血。     

造血微环境决定脐血造血干/祖细胞的早期分裂行为

目的 在特定生长因子的培养体系中，观察模拟造血微环境及粘附因素对人类脐血造血干/祖细胞早期分裂行为影响。方法 （1）应用流式细胞仪（FACS）分选CD34^ CD38^-细胞；（2）细胞培养体系中应用干细胞支持性基质AFT024及单一粘附因素纤维结合素（Fn)。并观察其对细胞早期分裂行为的影响。结果 （1）在联合生长因子的条件下，人类脐血CD34^ CD38^-细胞早期分裂呈现固定比例的静止，慢分裂，快分裂以及不对称分裂状态；（2）未观察到单一粘附因子Fn对其早期分裂行为的影响；（3）干细胞支持性基质AFT024所模拟的体外造血微环境可促使脐血造血干/祖细胞广泛增殖并更多地进行不对称分裂。结论 （1）CD34^ CD38^-细胞群体具有异质性。由具有不同增殖行为的亚群组成，在体外培养早期存在不对称分裂；（2）体外模拟的骨髓微环境AFT024基质滋养层较细胞因子及单一粘附因素能够更好地支持造血干/祖细胞的增殖并保持其自我更新的特性。     

人胎盘CD133^＋细胞具有LTC-IC集落启动细胞特性

本研究从功能上评价人胎盘CD133^＋细胞是否具有长期造血重建功能。采用免疫磁殊激活分选系统（MACS）富集胎盘CD133^＋细胞作为测试细胞,采用有限稀释法（LDA）设置4种不同浓度的测试细胞,用胎儿原代骨髓基质细胞制备的饲养层细胞共培养于长期培养体系中,以检测测试细胞中长期培养启动细胞（LTC—IC）的发生率及其增殖分化能力。结果表明：人胎盘CD133^＋细胞群中含有LTC—IC,其发生率为1／645;LTC—IC具有增殖分化为粒-单集落形成单位（CFU—GM）和混合集落形成单位（CFU—Mix）的能力;在所有LTC—IC阳性孔中,产生CFU—GM的孔占总阳性孔的71．4％,产生CFU—GM和CFU—Mix的孔占总阳性孔的28．6％。结论：人胎盘组织CD133^＋细胞群中存在LTC—IC,并具有造血早期祖细胞集落形成能力。     

microRNA在人脐血CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞中的差异性表达

为进一步探讨microRNA（miRNA）在造血调控中的作用奠定基础,比较了miRNA在人脐血CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞中的差异性表达。从人脐血中分离单个核细胞（MNC）,应用FACSVantage分选流式细胞仪分选CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞;抽提miRNA后与miRNA芯片杂交,应用生物信息学技术分析miRNA芯片的表达结果。结果发现,miRNA在人脐血CD34^＋CD38^＋细胞的表达水平比在CD34^＋CD38^-细胞的表达水平降低至1／2以下者共11个,表达水平升高至2倍以上者共73个,以上84个miRNA被称为“干细胞性”miRNA。经比较Georgantas等和芯片表达结果,发现有12个（14、29％,12／84）相同的miRNA。部分miRNA经历了类似于CD34在造血细胞表面的发展历程。应用生物信息学技术可寻找到新的与造血调控相关的miRNA簇及miRNA的下游靶基因。结论：“干细胞性”miRNA在正常造血中发挥着重要作用,即miRNA的系统表达模式一造血干／祖细胞基因表达谱一造血干／祖细胞的自我更新和系列定向分化。     

人胎盘组织源造血干/祖细胞的初步研究

为了探讨足月胎盘组织源单个核细胞(human mature placenta tissue-derived mononuclear cells,hPTMNC)中CD34+细胞的体外增殖、分化能力,寻找新的造血干/祖细胞来源供临床应用,分别采用流式细胞术检测、造血干/祖细胞集落培养和体外无细胞因子长期培养的方法,测定胎盘组织源和脐血中的CD34+细胞及其亚群和集落形成单位的数量。结果表明:胎盘组织源CD34+细胞(2.74±0.61%)及其亚群CD34+/CD38-细胞(2.46±0.42%)、造血干/祖细胞集落CFU-GM(186.90±24.52)和BFU-E(101.40±13.35)水平都较脐血CD34+细胞(1.73±0·32%)、CD34+/CD38-细胞(0.80±0.25%)、CFU-GM(136.90±25.15)、BFU-E(49.20±8.13)高;前者在体外无细胞因子培养条件下存活时间长,且细胞数量增加约2倍。结论:胎盘是胎儿期的造血器官,胎盘细胞成分更幼稚,是一种造血干/祖细胞移植的新的种子细胞。     

正常人骨髓不同细胞群中WT1基因表达及其异构体比例研究

本研究探讨WT1基因在正常人骨髓不同分化阶段造血细胞中的表达程度及异构体间比例关系。采用实时荧光定量RT-PCR方法检测18例正常人骨髓标本中CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋、CD15^＋CD11b^＋、CD33＋CD14^＋、CD20^＋CD5^-和CD20^-CD5^＋细胞群中总WT1、WT1（＋17AA）及WT1（＋KTS）的表达。结果表明：与K562细胞相比,CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋、CD15^＋CD11b^＋和CD33^＋CD14^＋细胞群中均存在WT1基因的低表达,且依次逐渐降低;在CD20^＋CD5^-和CD20^-CD5^＋细胞群中未检测到WT1基因表达。在分化程度较低的CD34^＋CD38^-和CD34^＋CD38^＋细胞群中以＋17AA,＋KTS及WT1（＋/＋）异构体为主,而较成熟的CD15^＋CD11b^＋和CD33＋CD14^＋细胞群中以-17AA、-KTS及WT1（-/-）异构体为主。结论：在正常人骨髓细胞中WT1基因的表达随着细胞分化程度提高而降低,造血细胞可能通过其4种异构体比例的调整而发挥抑制或促进分化的作用。     

CD34^＋造血干细胞在“心肌样”微环境中转化为心肌样细胞的可能性

目的：一般认为CD34^＋细胞只能向血细胞分化，观察CD34^＋造血干细胞在“心肌样”微环境中转化为心肌样细胞的可能性。方法：实验于2004-01／12在大连医科大学附属第二医院实验中心完成。①选用成年健康SD大鼠30只及出生l-3dSD大鼠乳鼠。在体外分离、培养CD34^＋造血干细胞，并将CD34^＋造血干细胞与分离出的新生乳鼠心肌细胞共培养。②将新生乳鼠心肌细胞的培养环境模拟为在体心肌细胞的生活环境即心肌样微环境。③在细胞培养瓶内加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记CD34^＋细胞。在倒置显微镜下观察CD34^＋造血干细胞形态学变化，用免疫细胞化学法检测心肌特异性肌钙蛋白T。结果：①CD34^＋造血干细胞与心肌细胞共培养3d，CD34^＋细胞变成长杆状，即呈现较为一致的极性排列，靠近心肌细胞的CD34’细胞形态学改变更早、更明显。②共培养的细胞经免疫细胞化学染色，发现部分5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的CD34^＋细胞核在荧光显微镜下呈现红色，同时其细胞浆心肌特异性肌钙蛋白T表现阳性，说明确实有部分CD34^＋造血干细胞转化成幼稚心肌细胞。结论：将CD34^＋造血干细胞与心肌细胞共培养，CD34^＋造血干细胞可以分化为心肌样细胞，从而验证了体外“心肌样”微环境可以促使CD34^＋造血干细胞向心肌样细胞转化的潜能。     

脐血CD34+CD38-早期造血祖细胞的体外增殖和凋亡

为了从适龄产妇脐血中分离出CD34^ CD38^-细胞，在体外较长时间培养后观察分析CD34^ CD38^-细胞分裂增殖、凋亡以及干细胞因子对CD34^ CD38^-细胞增殖的影响，用流式细胞仪从10例健康产妇脐血中分选出CD34^ 和CD38^-标记的脐血原始细胞．在添加IL-3、IL-6、GM—CSF、EPO、IGF—1和SCF6种混合因子的干细胞培养基中培养6个月，观察细胞并绘制生长曲线，用单细胞凝胶电泳检测干细胞因子对CD34^ CD38^-细胞生长的影响和用流式细胞仪检测CD34’CD38细胞凋亡情况。结果表明：脐血CD34^ CD38^-细胞可在体外较长时间培养增殖，无异常或过度的细胞凋亡发生。结论：通过控制培养条件，脐血CD34^ CD38^-早期造血祖细胞可在体外较长时间培养增殖，以作为大量脐血原始细胞移植的细胞来源.     

人胚AGM区造血干／祖细胞的分离及其在含AGM区基质细胞体系中的培养

本研究分离人胚主动脉-性腺-中肾（AGM）区造血干／祖细胞（HSPC）并在含人AGM区基质细胞的培养体系中进行培养，以了解人AGM区基质细胞对HSPC的作用。以免疫组织化学方法检测人胎龄28—45天胚胎AGM区细胞CD34、Flk-1、VEGF的表达；分离AGM来源的HSPC，通过直接接种和经Transwell非直接接触两种方法接种于含人AGM区基质细胞系（hAGMS3和hAGMS4）饲养层的培养体系，观察HSPC生长情况和卵石区形成细胞（cobblestone area—forming cells，CAFC）并计数卵石区（cobblastone area，CA）；用间接免疫荧光方法检测培养体系中悬浮细胞和CAFC的cD34、Flk-1表达；收获细胞进行半固体造血集落培养以检测两种培养方法对AGM—HSPC的集落形成能力影响。结果表明：人AGM区造血细胞表达cD34和Flk-1。两种接种方法均显示有CFC形成，直接接触培养能形成CD34和Flk-1双阳性的CAFC，集落总数明显高于非接触培养（hAGMS3体系：1647-1-194VS389-1-31．P〈0．05；hAGMs4体系：1586±75VS432±35，P〈0．05）。结论：①人胚AGM区含有CD34^＋Flk-1^＋的HSC。②首次建立含人胚AGM基质细胞的AGM—HSPC培养体系，直接接触培养和非直接接触培养均能促进AGM—HSC的生长，AGM基质细胞与HSC直接接触发挥重要作用。     

人胎盘组织造血干/祖细胞的分离富集

为了探索从胎盘组织中分离富集造血干/祖细胞(HSPC)的标化流程,采用机械法加胶原酶消化法制备人胎盘组织单个细胞悬液,用羟乙基淀粉(6%HES)法从中分离出单个核细胞(MNC),再经免疫磁珠分选法分选出CD34-、CD34+CD38-、CD34+CD38+3个细胞亚群,用流式细胞术对各阶段分选细胞进行表型分析并计算分选细胞的富集度和回收率。结果表明:机械法加胶原酶消化法制备的人胎盘组织单个细胞悬液中单个核细胞(MNC)数达(12.30±3.51)×108,与脐血初始样品所含的MNC数(8.86±5.38)×108比较差异无统计学意义,而其CD34+细胞所占百分率[(3.93±2.31)%]则明显高于脐血[(0.44±0.29)%]。胎盘组织单个细胞悬液经6%HES分离后MNC和CD34+细胞的回收率分别为(45.3±11.7)%和(51.1±9.8)%;MNC经免疫磁珠分选后,其CD34+细胞的纯度和回收率分别为(73.4±14.1)%和(52.7±11.7)%。结论:本实验所建立的"机械法加胶原酶消化法-HES分离MNC-MACS分选目标细胞"的分离纯化方法可从胎盘组织获得高丰度、高富集度、高活性的HSPC,为进一步研究胎盘HSPC提供了比较经济、效果较好的分离富集方案。     

IL-15对MDS患者CD34+细胞诱导增殖分化和抗凋亡作用

为了研究IL—15对体外培养的MDS CD34^＋细胞诱导增殖分化及凋亡的抑制作用，应用MACS免疫磁珠分离系统分离高富集度MDS CD34^＋细胞，建立以造血生长因子为基础的体外培养体系，用不同浓度的IL-15作用于MDS CD34^＋细胞，采用流式细胞术检测和免疫细胞化学染色等方法观察培养后的细胞表面抗原表达、细胞周期、凋亡指数及细胞形态的变化情况，并进行了定量分析。结果表明，MDS CD34^＋细胞经IL—15作用后，MDS CD34^＋细胞出现明显增殖和分化，细胞周期变异，增殖指数和细胞计数增加，形态学向成熟转化，实验组各表面抗原水平CD71、CD33和CD19均较对照组为高，细胞凋亡率则较对照组下降。结论IL—15对MDS CD34^＋细胞有一定的诱导增殖分化和抗凋亡作用，在MDS治疗方面可能有一定的应用前景。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞与CD34+CD59-细胞生物学性能的研究

目的 探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患CD34^ CD59^ 细胞的特性及PNH克隆呈优势造血的可能原因，以探索PNH发病的内在机制。方法 用免疫磁珠吸附法富集纯化CD34^ 细胞，再用流式细胞仪分选出PNH患的CD34^ CD59^ 细胞、CD34^ CD59^ 细胞及正常对照CD34^ 细胞。分别进行体外扩增液体培养2周，并对扩增前、后的细胞进行半固体培养。结果 ①PNH患CD34^ CD59^ 细胞与正常对照CD34^ 细胞形成集落形成单位(CFU)均在第7天达到扩增高峰，并且扩增后的细胞仍能保持CD59抗原，无GPI锚连蛋白的丢失。②正常对照的CD34^ 细胞在生存、增殖、形成CFU及扩增能力上均明显强于FHN患的CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^-细胞.③PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞体外半固体培养，其形成CFU的能力无明显差异。④PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞在SCF IL3 IL6 FL Tpo及SCF IL3 IL6 FL Tpo Epo组合下液体培养，其生存、增殖、扩增等能力上均无明显差异。但在SCF IL3 IL6 FL Tpo Epo GM-CSF组合下液体培养，CD34^ CD59^ 细胞的生存、增殖、扩增能力均明显强于CD34^ CD59^ 细胞。结论 ①正常对照的CD34^ 细胞在生存、增殖、形成CFU及扩增能力上均明显强于PNH患的CD34^ CD59^ 细胞。②PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞体外半固体培养，以及在SCF IL3 IL6 LF Tpo及SCF IL3 IL6 FL Tpo Ep组合下液体培养，其生存、增殖、扩增等能力上均无明显差异，说明CD34^ CD59^ 细胞在造血能力上并无内在的优势。GM—CSF或许是使PNH克隆呈造血优势的原因之一。     

粒系集落刺激因子对外周血T淋巴细胞亚群的影响及与CD34+细胞动员效果的相关性

本研究观察粒系集落刺激因子(G—CSF)作为造血干细胞动员剂对外周血T淋巴细胞亚群的影响及与CD34^ 细胞动员效果的关系。对26例行自体造血干细胞移植患在G—CSF动员前后收集外周血标本，用流式细胞术检测动员前后CD3^ 、CD3^ CD4^ 、CD3^ CD8^ 、CD3^ CD4^ CD8^ 及CD3^ CD4^-CD8细胞绝对数量的变化并与外周血CD34^ 细胞的动员效果进行相关性分析。结果表明：GCSF动员后外周血CD3^ 、CD3^ CD4^ 、CD3^ CD4^ CD8^ 及CD3^ CD4^-CD8细胞的绝对数量分别增加2.23，2．62，2.99及10．96倍，而CD3^ CD4^ CD8^ 细胞的变化无统计学意义(P=0．243)。各亚群细胞的变化与CD34^ 细胞动员效果比较，仅CD3^ CD4 CD8细胞的变化与CD34^ 细胞动员效果间具有良好的相关性，r=0．796，P=0.000。结论：G—CSF将造血干细胞由骨髓动员到外周血的同时，使外周血中T细胞亚群的绝对数量发生不同程度的变化。在各T淋巴细胞亚群中CD3^ CD8^-细胞的增加与CD34^ 细胞的动员效果间具有统计学意义的相关性。     

抗小鼠CD122抗体促进脐血CD34^＋细胞在NOD/SCID小鼠体内的重建

本研究旨在探讨抗小鼠CD122抗体促进人脐血CD34^＋造血干细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内的重建能力。对NOD/SCID小鼠进行半致死剂量γ射线照射,照射后腹腔注射200μg同型对照抗体或者抗小鼠CD122抗体,6-8 h后经尾静脉注射人脐血CD34^＋细胞或者注入PBS作为对照。处理后第2、3、4周取仅注射抗小鼠CD122抗体或同型对照抗体的小鼠外周血,动态监测小鼠NK细胞比例变化。在经过脐血CD34^＋细胞移植的小鼠中,利用流式细胞术对移植后小鼠骨髓中人CD45^＋比例以及CD45^＋细胞亚群中人CD34,CD19和CD33比例进行分析,观察抗小鼠CD122抗体对人造血干细胞在小鼠体内重建能力的影响。结果表明,用抗CD122抗体处理后2周和3周时,小鼠外周血中NK细胞比例分别为（4.6±0.6）%和（5.7±1.7）%,与注射同型对照抗体的NOD/SCID小鼠（12.2±1.4）%和（13.3±1.2）%相比下降约60%。在移植了人脐血CD34^＋细胞的小鼠中,同时用CD122抗体处理组在移植后6周和8周时小鼠骨髓中h CD45^＋比例分别为（63.0±12.2）%和（53.2±16.3）%,明显高于同型对照抗体组中h CD45^＋比例（7.7±3.6）%和（6.1±2.4）%。此外,经过抗CD122抗体处理组的小鼠移植8周后骨髓中仍能够明显的检测到人CD34^＋细胞的存在。结论：抗小鼠CD122抗体通过降低NOD/SCID小鼠的NK细胞的比例,大大促进了人脐血CD34^＋造血干细胞在免疫缺陷小鼠体内的重建能力。     

骨髓腔内输注人造血干／祖细胞促进NOD-SCID小鼠体内造血功能的恢复

本研究比较经骨髓腔内输注（intra—bone marrow infusion,iBMI）及静脉输注（intravenous infusion,iVI）人脐血（cord blood,CB）造血千／祖细胞（HS／PC）对NOD～SCID受鼠体内造血重建的影响。将纯化的CB CD34^＋细胞移植到受亚致死剂量照射的NOD—SCID受鼠体内。受鼠随机分为3组：①iBMI组：骨髓腔内输注CD34^＋细胞5×10^5／只;②iVl组：尾静脉输注CD34^＋细胞5×10^5／只;③阴性对照组：输注PBS缓冲液。于异种移植后第3、5及第8周通过流式细胞术、聚合酶链式反应、免疫组织化学及造血祖细胞集落分析的方法比较人造血系统各系细胞植入率,通过二次移植实验比较NOD—SCID受鼠体内人HS／PC长期造血重建能力。结果表明：移植后第8周,iB—MI组受鼠骨髓、外周血及脾脏中人CD45^＋细胞比例均显著高于iVI组（P〈0．05）;iBMI组及iVI组移植的HS／PC均具有多向分化能力;移植后第8周,iBMI组受鼠骨髓中CD45^＋CD19^＋细胞、CD45^＋CD33^＋细胞、CD45^＋CD56^＋细胞及CD45^＋CD34^＋细胞比例均显著高于iVI组（P〈0．05）,CD45^＋CD14^＋细胞及CD45^＋CD41a^＋细胞比例亦高于iVI组（P〉0．05）。iVI组及iBMI组长期存活受鼠的肝脏、脾脏、肺脏、外周血、骨髓细胞中均可检测到人17号染色体α-卫星特异性片段。应用免疫组织化学法在移植后第8周的iBMI组受鼠的脾脏、肝脏和肺脏中均可检出人CD45抗原的表达.iBMI组受鼠的骨髓细胞各系集落总数于移植后第8周显著高于iVI组（P〈0．05）。二次移植后第6周,iVI组及iBMI组受鼠的各组织脏器中均可检出人17号染色体α-卫星特异性片段的表达。结论：与iVI相比,经iBMI移植人CBCD34^＋细胞至NOD—SCID受鼠可以促进HS／PC的造血重建及多向分化,提高植入率。     

人脐血CD34+CD38-细胞免疫表型和染色体核型特征分析

目的 分离脐血干／祖细胞(CD34^ CD38)进行体外长期培养，观察分析其增殖、细胞表面分子标志和染色体核型的特征。方法 用流式细胞仪分选CD34-FITC和CD38-PE标记的CD34^ CD38脐血原始细胞，在含细胞生长因子IL-3、IL-6、GM-CSF、EPO、SCF和胰岛素样生长因子的干细胞培养基中培养6个月，用流式细胞术检测体外培养30d的干／祖细胞表面标记，并用G显带方法分析其染色体核型。结果 在一定培养条件下，经7～12d培养，脐血干／祖细胞(CD34^ CD38)开始增殖。培养6个月后，每孔接种1个细胞，细胞数增殖至250～350个；每孔接种10个细胞，细胞数可增殖至400～500个。每孔接种1个细胞其细胞增殖峰持续时间(8～9代)比接种10个细胞(6～7代)长：经体外长期培养增殖，细胞仍强烈显示十／祖细胞表面分子标记(CD34^ CD38^-)；细胞染色体数目、结构未见异常。结论 脐血干／祖细胞(CD34^ CD38^ )经体外特异性培养增殖，可为大量脐血干／祖细胞移植提供细胞来源。     

异基因造血干细胞移植CD34^＋CD61^＋巨核系前体细胞与血小板植入的相关分析

本研究通过定量测定G—CSF动员后外周血及骨髓采集物的CD34^＋CD61^＋细胞，以探索巨核前体细胞CD34^＋CD61^＋亚群输注量与异基因外周血和／或骨髓移植后血小板恢复时间的相关性。24例不同血液病患者接受HLA全相合同胞、非血缘供者或单倍体相合同胞造血干细胞移植。20例可评估的患者依移植方法不同分为HLA全相合组和单倍体相合组，HLA全相合组采用PBSC移植方案，单倍体相合组采用PBSC＋BM联合移植方案，对外周血干细胞和骨髓样本CD34^＋CD61^＋亚群通过流式细胞仪立即测定或隔夜保存后测定。结果表明，单倍体相合组输注CD34^＋、CD34^＋CD61^、CD34^-CD61^＋细胞数中位值分别为6．24×10^6／kg（1．53—20．48）、66．19×10^4／k（8．16—493．83）、34．38×10^6／kg（14．71—109．16）；HLA全相合组中位值分别为4．88×10^6／kg（1．00—8．24）、14．16×10^4／kg（11．63—96．87）和13．50×10^6／kg（1．74—35．61）。中性粒细胞计数（ANC）〉0．5×10^9／L和血小板计数〉20×10^9／L的中位时间，单倍体相合组分别为18．5（11．00—29．00）和16．5（9．00—35．00）天；HLA全相合组为14．5（9．00—24．00）和10．5（6．00—37．00）天，血小板的植入时间在两组差别无显著性，中性粒细胞植入时间在HLA全相合组和单倍体相合组差异有显著性（p=0．048），对于两组中CD34^＋细胞量〉2×10^6／kg的受者血小板的植入时间分析，两组差别有显著性（p=0．006）。CD34^＋CD61^＋亚群与血小板植入的相关性明显优越于CD34^＋细胞，可评估20例（r=-0．449p=0．047CD34^＋细胞群），单倍体相合组12例CD34^＋CD61^＋亚群（r=-0．768p=0．004），HLA相同纽8例CD34^＋CD61^＋亚群（r=-0．747p=0．033），CD34^＋CD61^＋亚群与血小板的植入时间呈负相关关系，输注CD34^＋CD61^＋亚群细胞量大，血小板的植入时间缩短。结论