补肾活血含药血清对体外高磷刺激下血管平滑肌细胞钙化的抑制作用

目的:观察补肾活血含药血清对体外高磷刺激下A7r5细胞钙化的抑制作用。方法:用Na H2PO4高磷溶液对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)进行刺激,建立体外血管钙化模型。制备补肾活血含药血清,分别按含药血清在体外培养基中所占比例5%、10%、20%设立补肾活血含药血清低、中、高三个剂量组,进行体外干预10 d。实验结束后,光学显微镜下观察细胞形态;茜素红染色法观察细胞钙化情况,分别在实验第2、4、6、8、10天观察细胞层钙含量及ALP活性,实验第3、6、10天观察细胞VSMCs标记蛋白α-SMA蛋白及成骨细胞标记蛋白ALP蛋白表达。结果:(1)与正常组比较,第10天经茜素红特殊染色,高磷模型组出现明显的钙化结节;同时,细胞钙含量及ALP活性均随时间延长不断升高,α-SMA蛋白表达下调,ALP蛋白表达上调。(2)与高磷模型组比较,第10天经茜素红特殊染色,含药血清低剂量组细胞形态改善不明显,中、高剂量组红色颗粒物明显减少,正常形态细胞数目较多;含药血清组细胞钙含量、ALP活性下降,α-SMA蛋白表达上调,ALP蛋白表达下调。结论:补肾活血含药血清能够减轻高磷所诱导的A7r5细胞钙化及细胞层钙沉积、ALP活性的升高,下调ALP蛋白表达,上调α-SMA蛋白表达,抑制VSMCs向成骨样细胞表型转化。     

补肾活血含药血清对体外高钙刺激下血管平滑肌细胞钙化的抑制作用

目的:观察补肾活血含药血清对体外高钙刺激下A7r5细胞钙化的抑制作用。方法:用Ca Cl2高钙溶液对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)进行刺激,建立体外血管钙化模型。制备补肾活血含药血清,分别按含药血清在体外培养基中所占比例5%、10%、20%设立补肾活血含药血清低、中、高三个剂量组,进行体外干预10天。实验结束后,光学显微镜下观察细胞形态;茜素红染色法观察细胞钙化情况;分别在实验第2、4、6、8、10天观察细胞层钙含量及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,实验第3、6、10天观察VSMCs标记蛋白α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及成骨细胞标记蛋白ALP蛋白表达。结果:(1)与正常组比较,第10天经茜素红特殊染色,高钙模型组出现明显的钙化结节;同时,细胞钙含量及ALP活性均随时间延长不断升高,α-SMA蛋白表达下调,ALP蛋白表达上调。(2)与高钙模型组比较,第10天经茜素红特殊染色,含药血清低剂量组细胞形态改善不明显,中、高剂量组红色颗粒物明显减少,正常形态细胞数目较多;含药血清组细胞钙含量、ALP活性下降,α-SMA蛋白表达上调,ALP蛋白表达下调。结论:补肾活血含药血清能够减轻高钙所诱导的A7r5细胞钙化及细胞层钙沉积、ALP活性的升高,下调ALP蛋白表达,上调α-SMA蛋白表达,抑制VSMCs向成骨样细胞表型转化。     

复方补肾活血颗粒含药血清通过Trb3调控hBMSCs成骨成脂分化

目的 研究复方补肾活血颗粒含药血清通过Trb3调节人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cells, hBMSCs)成骨/成脂分化。方法 不同浓度复方补肾活血颗粒含药血清干预hBMSCs,通过CCK8法检测细胞活力，ALP活性、茜素红染色观察hBMSCs成骨分化，油红O染色鉴定脂肪分化。Western blot检测成骨/成脂标志物蛋白表达。Western blot和qPCR检测Trb3蛋白和基因表达。Trb3 siRNA转染hBMSCs后通过Western blot观察成骨成脂相关因子蛋白表达情况。结果复方补肾活血颗粒含药血清以浓度依赖性促进hBMSCs增殖。复方补肾活血颗粒含药血清增强hBMSCs中ALP活性及矿化结节，上调Runx2、Osterix蛋白表达并抑制PPARγ、FABP4蛋白表达和脂质积累。机制研究发现，复方补肾活血颗粒含药血清促进Trb3表达，当内源性Trb3敲低时，逆转了复方补肾活血颗粒含药血清促进成骨分化抑制脂肪分化的作用。结论 复方补肾活血颗粒含药血清通过Trb3以牺牲脂肪分化为代价，促进hBMSCs成骨分化。     

补肾活血方通过调节MGP、BMP-7因子对慢性肾脏病大鼠血管钙化的抑制作用

目的:观察补肾活血方通过调节基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)、骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)因子对慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)大鼠血管钙化(vascular calcification,VC)的抑制作用,探讨补肾活血方抑制CKD大鼠VC的作用机制。方法:60只SD大鼠随机分为正常组、模型组及中药组,每组20只,模型组与中药组大鼠实验第1~4周给予250 mg·kg-1·d-1腺嘌呤混悬液灌胃及含1. 8%高磷饲料喂养,第5~8周腺嘌呤改为隔日灌胃。中药组同时按55 g·kg-1·d-1剂量给予补肾活血方灌胃治疗,每日1次。正常组灌胃等量生理盐水。给药8周后,HE染色观察肾组织变化,茜素红染色观察主动脉钙化结节情况,检测主动脉钙含量及ALP活性,腹主动脉取血检测血清钙(Ca2+)、磷(P3-)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、全段甲状旁腺激素(i PTH),Western blot法检测主动脉α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)蛋白的表达,Real-time PCR法检测主动脉MGP、BMP-7mRNA表达。结果:HE染色观察提示:中药组较模型组正常肾小球数目增多,肾小管扩张程度降低,炎性细胞数量下降,腺嘌呤结晶减少。茜素红染色观察提示:与正常组比较,模型组主动脉出现钙化结节,广泛红色颗粒物沉着;与模型组比较,中药组钙化结节减少。与正常组比较,模型组主动脉钙含量及ALP活性升高,血P3-、Scr、BUN、i PTH水平升高,血Ca水平下降(P 0. 01),主动脉ALP蛋白表达明显升高、α-SMA蛋白表达明显下降(P 0. 01),模型组主动脉MGP、BMP-7 mRNA表达下调(P 0. 01);与模型组比较,中药组主动脉钙含量及ALP活性明显降低(P 0. 05),血P3-、Scr、BUN、i PTH水平均下降(P 0. 01,P 0. 05),血Ca2+水平升高(P 0. 01),中药组主动脉ALP蛋白表达降低、α-SMA蛋白表达升高(P 0. 01),且中药组MGP、BMP-7 mRNA表达上调(P 0. 01)。结论:补肾活血方能够改善CKD大鼠肾脏组织学、肾功能、改善钙磷代谢,上调MGP、BMP-7因子表达,这可能是其抑制CKD大鼠VC的作用机制。     

高镁对高磷诱导血管钙化的影响及其机制

目的 探讨高镁对高磷诱导血管钙化的影响及其可能的机制.方法 体外原代培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs),用β甘油磷酸盐(β-GP)诱导钙化.VSMCs细胞被分为4组:对照组、高磷组(10 mmol/L β-GP)、镁干预组(10 mmol/L β-GP+3 mmol/LMgSO4)、镁通道抑制剂(2-APB)干预组(10 mmol/L β-GP+3 mmol/L MgSO4+10-4 mol/L 2-APB).采用茜素红染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞钙化情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-PCR法和Western印迹法检测细胞核心结合因子α-1(Cbfα-1)的表达.24只雄性SD大鼠被随机分为3组:对照组(甲基纤维素灌胃+高磷饮食)、血管钙化组(硫酸腺嘌呤灌胃+高磷饮食)、高镁干预组(硫酸腺嘌呤灌胃+高磷高镁饮食).造模成功后测定大鼠主动脉脉搏波速率(PWV);采用yon Kossa染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测胸主动脉钙化情况;免疫组织化学方法检测胸主动脉Cbfα-1表达.结果 细胞培养14 d后,与高磷组相比,镁干预组VSMCs钙盐沉积明显减少,ALP活性降低(P＜0.05),Cbfα-1表达下调;2-APB可抑制高镁对VSMCs的保护性作用.Cbfα-1的动态观察结果显示,镁干预组第3天Cbfα-1的表达下调(P＜0.05),其抑制效应随时间延长呈增强趋势.体内实验中,大鼠慢性肾衰竭血管钙化模型制备成功.和体外实验一致,与血管钙化组相比,高镁干预组大鼠血浆镁离子水平明显升高,胸主动脉PWV明显降低(P＜0.05),血管钙盐沉积程度亦明显减轻.免疫组织化学结果显示高镁可明显降低高磷诱导的Cbfα-1表达(P＜0.05).结论 高镁可抑制血管钙化,其机制可能与其抑制VSMCs骨源性分化相关.     

补肾健脾活血方含药血清对UMR106细胞成骨分化和骨形成相关蛋白的影响

目的观察补肾健脾活血方含药血清对UMR106细胞成骨分化和骨形成相关蛋白的影响。方法将实验动物随机分成空白血清组、低剂量血清组、中剂量血清组、高剂量血清组、阳性对照组,分别予以灌胃制备含药血清,并对其细胞进行加药培养,测定UMR106细胞培养72 h后的检测增殖、ALP活性以及各组细胞OPN、RUNX2、BMP-2蛋白表达情况。结果与空白血清组比较,低、中、高剂量血清组和阳性对照组加药干预72 h后,细胞吸光度值均较低(P0.05),而细胞ALP活性均较高(P0.05),且随着中药血清水平升高,ALP活性提高;与空白血清组相比,经中药含药血清培养后UMR106细胞OPN、RUNX2、BMP-2均显著上调(P0.05),且呈浓度梯度性变化,各中药含药血清组以高剂量组表达最为明显。结论表明补肾健脾活血方(骨康方)含药血清有促进UMR 106细胞成骨分化和调节骨形成相关蛋白;且随着补肾健脾活血方(骨康方)水平的增高,成骨分化更明显。     

补肾活血含药血清对成骨细胞经典Wnt/β-Catenin通路的影响研究

目的:通过观察补肾活血含药血清对成骨细胞的经典Wnt/β-catenin信号通路的影响, 探究补肾活血颗粒防治骨质疏松症(osteoporosis,OP)的作用机制。方法:将20只健康SD雌性大鼠随机分为补肾活血组和生理盐水组, 每组10只, 分别给予补肾活血溶液和生理盐水进行灌胃1周, 按照药物含药血清制备方法得到补肾活血含药血清和生理盐水含药血清。采用体外分离乳鼠颅骨按照酶消法培养细胞, 通过瑞氏-姬姆萨(R-J)染色观察细胞形态及碱性磷酸酶(ALP)染色进行成骨细胞的鉴定, 鉴定成功后取第3代成骨细胞分为生理盐水含药血清组、正常培养基组及补肾活血含药血清组, 加入含15%相应的含药血清的培养基培养后检测成骨细胞的ALP含量及增殖率, 观察各组的矿化结节的情况, 采用RT-PCR检测β-catenin、Runx2、Osx mRNA的表达。结果:培养的细胞经过瑞氏-姬姆萨染色显示胞浆有蓝色颗粒, 细胞核呈紫褐色, 有的可见1～3个核仁, 呈现传代后的成骨细胞的形态, 且ALP染色可见胞浆内含紫红色颗粒, 表明培养的细胞是成骨细胞。补肾活血含药血清组细胞的ALP含量为(6.272±0.131)金氏单位/100 ml, 增殖率为(0.81±0.172)%,与生理盐水含药血清组比较能够明显增强成骨细胞的增殖分化活性(P<0.01);补肾活血含药血清组细胞经过茜素红染色可见4个不同大小的橘红色结节, 最大1.0 cm×1.0 cm,能够明显的促进成骨细胞的矿化功能;RT-PCR检测发现β-catenin、Runx2及Osx mRNA表达量分别为(1.782±0.944)、(1.935±0.994)、(1.610±0.811),与生理盐水组比较有明显的提高(P<0.01),但与正常培养基组比较无明显差异(P>0.05).结论:补肾活血含药血清能够明显促进成骨细胞的分化增殖及矿化功能, 并且推测激活经典Wnt/β-catenin信号通路可能是补肾活血颗粒防治骨质疏松症的作用机制。     

DMP1、E11和Sclerostin在高磷诱导钙化的血管平滑肌细胞中的表达

目的:观察DMP1、E11和Sclerostin在高磷诱导钙化的血管平滑肌细胞(VSMC)中的表达,探讨VSMC钙化的可能机制。方法:组织块贴壁法原代培养VSMC,倒置相差显微镜观察细胞形态及α-SMA免疫组化鉴定;3~8代VSMC用于实验,分为空白对照组、正常磷组和高磷组(Pi分别为0.9、1.3和2.6 mmol/L)。培养第6天,茜素红染色检测钙沉积,RT-PCR或Real-time PCR检测DMP1、E11、Sclerostin mRNA表达,Western Blot检测E11蛋白表达。结果:与空白对照组和正常磷组相比,高磷组VSMC钙盐沉积明显增多;DMP1、E11和Sclerostin mRNA表达明显上调(P0.05);E11蛋白表达明显增加(P0.05)。结论:骨细胞标志性蛋白DMP1、E11和Sclerostin在高磷诱导钙化的VSMC中表达增加,提示血管钙化过程中VSMC最终向骨细胞样细胞转分化。     

补肾健骨方含药血清对ROBs和rBMSCs增殖、分化和矿化的影响

目的观察补肾健骨方含药血清对大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROBs)和大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,r BMSCs)细胞活性及分化、矿化的影响。方法制备补肾健骨方含药血清,将ROBs和r BMSCs分为5%、10%、15%、20%、25%浓度含药血清组、无药血清组及传统诱导组,分别对各组ROBs和r BMSCs进行成骨诱导。MTT法检测ROBs和r BMSCs细胞的增殖情况;用试剂盒检测ROBs和r BMSCs的碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法检测矿化结节形成。结果不同浓度含药血清组与空白无药血清组、传统诱导组相比,均不同程度地促进ROBs和r BMSCs的增殖,使ALP活性提高,增加钙化结节数量和面积。其中含药血清浓度为20%时促进ROBs增殖分化作用最佳,浓度为10%时促进r BMSCs增殖分化效果最为显著。结论不同浓度补肾健骨方含药血清均能够促进ROBs和r BMSCs的成骨增殖、分化和矿化,分别在浓度为20%和10%时最佳。     

地塞米松对人牙髓细胞增殖分化影响的研究

目的观察地塞米松对体外培养的人牙髓细胞增殖和分化的影响。方法收集拔除的无龋坏、无牙周疾病的健康前磨牙及第三磨牙,获得牙髓,酶消化联合组织块法体外培养人牙髓细胞(Human dental pulp cells,hDPCs),扩增后取第4代生长状态良好的细胞用于实验。分为两组,实验组hDPCs在含2%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的αMEM培养基中加入10-8mol/L地塞米松(Dexamethasone,Dex)培养,对照组单纯使用含2%FBS的αMEM培养基培养。在细胞培养第1、3、5天检测细胞增殖情况;细胞培养的第1、5、10天分别进行ALP染色及ALP定量分析检测细胞分化情况;细胞培养第10天进行茜素红染色观察钙化结节形成情况。结果细胞增殖活性检测显示,实验组培养第3天及第5天可见hDPCs增殖活性得到显著抑制,与对照组相比有统计学差异;ALP染色及定量测定:培养10 d后,地塞米松实验组ALP活性明显高于对照组;茜素红染色结果:培养10 d后两组细胞茜素红染色均为阳性,表明实验组与对照组均有钙化结节形成,但是实验组钙化结节形成数量较多。结论酶消化联合组织块法可以成功体外培养hDPCs。10-8mol/L地塞米松可显著抑制hDPCs的增殖活性,提高hDPCs的ALP活性及矿化能力。     

补肾活血中药含药血清对滑膜细胞分泌TNF-α、IL-1β水平的影响

目的:探讨补肾活血中药是否可以抑制兔滑膜细胞分泌TNF-α、IL-1β等炎性因子。方法:制作补肾活血方含药血清,体外分离并培养兔滑膜细胞,并鉴定、传代。实验分含空白血清对照组、含10%西乐葆血清组、含5%、10%、20%中药血清组等5组。以西乐葆含药血清作为对照,将不同浓度的中西药血清加入培养传代的第3代滑膜细胞,继续培养。观察药物对滑膜细胞分泌TNF-α、IL-1β水平的影响。结果:补肾活血方含药血清具有和西乐葆含药血清类似的抑制滑膜细胞分泌TNF-α、IL-1β的作用,其抑制TNF-α分泌的作用随药物浓度的增加作用增强。结论:补肾活血中药可抑制滑膜细胞分泌TNF-α、IL-1β等炎性因子。     

补肾健脾活血方干预沉默DKK1、Sost骨细胞对细胞活性和相关蛋白的影响研究

目的用补肾健脾活血方干预沉默Dickkopf(DKK)1、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)转染的成骨细胞,观察其对细胞活性和相关蛋白的影响。方法将培养好的细胞分为空白对照组(NC组)、沉默DKK1(Ad-sh DKK1)组和沉默Sost(Ad-sh Sost)组,空载腺病毒转染NC组,沉默DKK1和Sost重组腺病毒转染其余两组,再分别给予空白血清和含药血清干预,观察细胞增殖、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性以及骨相关蛋白变化情况。结果 (1)三组含药血清干预后的细胞活性强于空白血清干预后的细胞活性。与空白血清干预的三组比较,含药血清干预后的三组细胞活性在24、48、72 h均增加,尤其在72 h时含药血清对Ad-sh DKK1组的细胞活性作用更强,与同组空白血清比较,差异有统计学意义(P0.05);(2)三组含药血清干预与空白血清干预比较ALP活性明显升高,差异有统计学意义(P0.01)。含药血清干预后,与NC组比较,其余两组ALP活性显著升高,差异有统计学意义(P0.01),Ad-sh DKK1组和Ad-sh Sost组比较,ALP活性升高不明显;(3)与空白血清干预比较,含药血清干预后三组的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)均升高,与NC组比较,Ad-sh DKK1组OPG、OPN差异有统计学意义(P0.05和P0.01),Ad-sh Sost组CTGF、OPG、OPN差异有统计学意义(P0.05)。结论补肾健脾活血方含药血清可显著促进沉默DKK1、Sost干预后细胞增殖和提高ALP活性,上调沉默DKK1、Sost腺病毒转染细胞CTGF、OPG、OPN的表达。     

SET8介导AKT信号通路在调控高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的 探讨赖氨酸甲基转移酶SET8介导AKT信号通路在调控高磷诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)钙化中的作用及机制。方法 (1)选取雄性SD大鼠进行体内实验并随机分为假手术组和慢性肾衰竭血管钙化组。取胸主动脉,采用von Kossa染色检测钙化情况;免疫组化法检测SET8和Caspase-3表达情况。(2)体外实验进行原代VSMCs培养,将细胞随机分为正常组和高磷组(10 mmol/L β-甘油磷酸)。采用邻甲酚酞络合酮比色法及茜素红染色检测细胞钙化情况;流式细胞法检测细胞凋亡情况;RT-PCR和Western印迹法检测SET8、AKT和Caspase-3的表达。(3)为进一步验证SET8在VSMCs凋亡中的作用,采用脂质体转染法,分3组:SET8-短发夹RNA(shRNA)组、空质粒组和正常对照组。采用邻甲酚酞络合酮比色法及茜素红染色检测细胞钙化情况;流式细胞法检测细胞凋亡情况;RT-PCR和Western印迹法检测SET8、AKT、Caspase-3的表达。结果 (1)体内实验中,慢性肾衰竭血管钙化组的血管钙盐沉积量明显高于假手术组(P<0.05);免疫组化结果提示,与假手术组相比,血管钙化组SET8表达明显降低,Caspase-3表达明显升高(均P<0.05);相关分析显示,血管组织SET8表达水平与钙含量、Caspase-3表达呈负相关(r=-0.948,P<0.01;r=-0.961,P<0.01)。(2)体外实验中,高磷组钙盐沉积明显高于正常组(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,高磷组VSMCs的凋亡率明显高于正常组(P<0.05);RT-PCR和Western印迹显示,与正常组相比,高磷组SET8和AKT的mRNA和蛋白表达下降,Caspase-3的mRNA和蛋白表达升高(均P<0.05)。(3)干扰SET8基因表达后,VSMCs钙化及凋亡率明显增加,AKT的mRNA和蛋白表达下降,Caspase-3的mRNA和蛋白表达升高(均P<0.05)。结论 SET8可以抑制血管钙化,其机制之一可能为通过促进AKT活化,抑制Caspase-3的表达,从而抑制VSMCs凋亡,进而参与调控高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化。     

加味阳和汤含药血清对MC3T3-E1与RAW264.7细胞共育体系的影响

目的 观察加味阳和汤含药血清对MC3T3-E1与 RAW264.7细胞共育体系的影响,探究其防治骨质疏松症（OP）肾阳虚证的可能作用机制。方法 制备加味阳和汤含药血清,于Transwell共培养板建立MC3T3-E1与RAW264.7细胞共育体系,设置肾阳虚血清组、空白组、含药血清+肾阳虚血清组及含药血清组。干预48 h后,通过碱性磷酸酶（ALP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察成骨、破骨分化;运用TRAP和ALP试剂盒分别检测细胞上清液中TRAP、ALP活性;通过Western blot检测各组OPG、RANKL、RANK蛋白表达。结果 与肾阳虚血清组比较,含药血清+肾阳虚血清组ALP活性增加（P<0.05）,TRAP活性及OC数目减低（P<0.05,P<0.05）,OPG蛋白表达上调（P<0.05）,RANKL、RANK蛋白表达下调（P<0.05,P<0.05）。结论 加味阳和汤对OP肾阳虚证有相应治疗作用,其机制可能与增加OPG及降低RANKL、RANK蛋白表达有关。     

Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用机制

目的从细胞层面探讨Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚(IS)诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用和相关机制。方法体外培养人主动脉血管平滑肌细胞(HASMC),以IS按0、200、500、1 000μmol/L的浓度梯度干预6 d,采用茜素红染色观察钙盐沉积,Real-time聚合酶链式反应(PCR)和Western印迹检测平滑肌细胞肌动蛋白α(α-SMA)、smoothin、骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)、核结合因子α1(Cbfα1)、Klotho和不同DNA甲基化转移酶(DNMT)的m RNA和蛋白表达水平,同时利用焦磷酸测序方法检测HASMC的Klotho基因甲基化率;在IS 1 000μmol/L组培养基中加入不同浓度梯度的5-氮杂脱氧胞苷(5Aza-2dc)进行干预,观察茜素红染色、各基因表达水平和Klotho基因甲基化率的改变。组间均数比较采用独立样本t检验,组间率的比较采用卡方检验。结果IS 1 000μmol/L组HASMC细胞外基质呈红色,细胞结节处浓染,为钙盐沉积染色阳性。IS可以下调HASMC的α-SMAm RNA和蛋白及smoothin表达水平,上调OPN、ALP的m RNA和蛋白表达水平,使HASMC逐渐丧失平滑肌细胞表型而发生成骨转化。与对照组比较,IS 200、500、1 000μmol/L刺激6 d可显著升高HASMC的Klotho基因甲基化率(9±1%与4±0.7%,t=5.38,P0.01;18±1.3与4±0.7%,t=6.92,P0.01;41±2%与4±0.7%,t=9.26,P0.001)。IS 500、1 000μmol/L可显著下调HASMC的Klotho m RNA和蛋白表达水平。同时IS 1 000μmol/L可显著上调HASMC的DNMT1 m RNA和蛋白表达水平。5Aza-2dc 10μmol/L干预可减轻IS诱导的细胞外钙盐沉积,上调α-SMA蛋白、smoothin表达水平并下调Cbfα1蛋白表达水平,同时减低HASMC的Klotho基因甲基化率(20±1%与41±2%,t=6.98,P0.01)、上调HASMC的Klotho蛋白表达水平。结论 IS可通过上调血管平滑肌细胞DNMT表达,启动Klotho基因超甲基化,进而下调Klotho基因转录和表达,诱导血管平滑肌细胞成骨转化。     

体外高磷环境下血管平滑肌细胞转分化过程的研究

目的 观察体外高磷培养条件下,血管平滑肌细胞（VSMC）向类似成骨样细胞转分化的动态变化特点。 方法 Western印迹和免疫荧光法观察不同磷浓度（1.0、2.5、3.5 mmol/L）培养条件下,人VSMC的标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及成骨细胞特异性的核转录因子Cbfα1、相关骨基质蛋白（骨桥蛋白、I型胶原和骨钙素）的动态变化过程。实时荧光定量PCR法分析上述指标的基因表达水平。在此基础上,以硝酸银染色和茜素红染色了解细胞的钙盐沉积状况,最后通过电镜观察不同培养条件下细胞超微结构的改变。 结果 在无血清的培养条件下,高磷（2.5、3.5 mmol/L）刺激细胞12 h时,胞内 Cbfα1的表达就明显增加（P ＜ 0.05）;3 d后高磷组（2.5、3.5 mmol/L）细胞中I型胶原和骨桥蛋白的含量显著上调（均P ＜ 0.05）;第6天骨钙素的产生开始增加;15 d时高磷组（2.5、3.5 mmol/L）α-SMA的含量才显著下降（P ＜ 0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,高磷环境培养1 d时,细胞中骨桥蛋白、I型胶原的mRNA水平显著升高（均P ＜ 0.05）;5 d时骨钙素的mRNA表达显著增加（P ＜ 0.05）;10 d时α-SMA的mRNA含量显著减少（P ＜ 0.05）。在高磷营养液中培养15 d时,细胞出现多处斑片状的钙盐沉积。电镜可见胞质内产生大量胶原纤维和钙化的基质囊泡。 结论 高磷可诱导VSMC向类似成骨样细胞转分化,这是一个复杂的、有多个环节、有序的动态变化过程。     

补肾方药干预过表达、沉默sFRP1的UMR106细胞增殖情况及β-catenin的影响

目的针对分泌型卷曲相关蛋白1(s FRP1)基因构建沉默及过表达重组腺病毒载体并结合补肾方药含药血清,观察其对大鼠骨肉瘤细胞(UMR106细胞)增殖和β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响。方法构建s FRP1沉默及过表达重组腺病毒载体,制备补肾方药含药血清,将培养好的UMR106细胞分为空白血清+空病毒组、含药血清+空病毒组、空白血清+SFRP1沉默组、含药血清+SFRP1沉默组、空白血清+SFRP1过表达组、含药血清+SFRP1过表达组6组,根据组别不同进行干预,并观察细胞增殖及检测β-catenin蛋白表达。结果与空白血清+空病毒组比较,含药血清+空病毒组、空白血清+SFRP1沉默组、含药血清+SFRP1沉默组的细胞增殖、β-catenin蛋白表达均显著升高。空白血清+SFRP1过表达组、含药血清+SFRP1过表达组的细胞增殖活性、β-catenin蛋白表达降低。其中含药血清+SFRP1沉默组、空白血清+SFRP1过表达组变化最明显。结论沉默s FRP1、补肾方药含药血清可提高UMR106细胞增殖以及β-catenin表达,尤以两者同时干预时的作用最强,而过表达s FRP1则降低UMR106细胞增殖活性,补肾方药含药血清某种程度上可抑制s FRP1的过表达。     

尿毒症血清诱导的磷酸钙晶体对人主动脉平滑肌细胞的钙化作用

目的 探讨尿毒症患者血清诱导的磷酸钙晶体对人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)钙化的影响.方法 尿毒症患者血清在37℃下孵育3d,超速离心法从尿毒症血清中分离磷酸钙晶体和无晶体血清,采用扫描电子显微镜和能量色散X射线光谱仪分析晶体的形态及化学特征.体外培养HASMCs,分为以下4组:对照组、尿毒症血清组、磷酸钙晶体组和无晶体血清组.茜素红染色及甲氧酚酞络合酮法检测HASMCs钙化结节的形成及细胞内钙含量.实时荧光定量PCR法检测骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨桥蛋白(OPN)、核结合因子α1亚基(Cbfα1)、碱性磷酸酶(ALP)、基质γ羧基谷氨酸蛋白(MGP)的mRNA表达.Cbfα1、OPN和BMP-2的蛋白表达用Westcrn印迹和ELISA法检测.结果 尿毒症血清可诱导磷酸钙晶体形成.与对照组相比,尿毒症血清明显促进HASMCs钙化结节形成,增加细胞内钙含量(P＜0.05),并上调细胞BMP-2、OPN、Cbfα1的mRNA和蛋白表达(均P＜ 0.01);而磷酸钙晶体亦促进HASMCs钙化结节的形成,增加细胞内钙含量(P＜0.05),上调BMP-2、OPN、Cbfα1的mRNA和蛋白表达(均P＜0.01).无晶体血清组的HASMCs胞内钙含量和上述成骨蛋白的表达与对照组差异无统计学意义(均P＞ 0.05).结论 尿毒症血清可能通过诱导磷酸钙晶体的形成促进血管钙化的发生.     

Par-3蛋白在转化生长因子?茁1介导的大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF)β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中细胞极性蛋白Par-3的表达及上调Par-3蛋白表达对TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1 (10 μg/L)刺激NRK52E细胞，采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Par-3 mRNA和蛋白的表达；应用Lipofectmine 2000将pKH3-HA-Par-3质粒瞬时转染NEK52E细胞，采用Western印迹观察上调表达Par-3对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后，NRK52E细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调，E-cadherin蛋白和mRNA的表达下调；Par-3蛋白表达呈时间依赖模式下调，72 h TGF-β1刺激组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。但Par-3 mRNA水平在各时间点差异均无统计学意义（P > 0.05）。脂质体转染外源性质粒pKH3-HA-Par-3上调表达Par-3可显著抑制TGF-β1诱导NRK52E细胞α-SMA蛋白的上调表达；逆转E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中细胞极性Par-3蛋白表达下调，基因转染上调表达Par-3可部分减轻EMT的程度，提示Par-3蛋白在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中可发挥保护性作用。     

补肾活血中药对体外培养成骨细胞增殖的影响

目的：探讨补肾活血中药对胎鼠颅盖骨来源成骨细胞增殖的影响，以进一步了解补肾活血中药改善骨代谢的作用机制。方法：取二次酶消化法培养的胎鼠颅骨第3代成骨细胞，随机分为5组：细胞对照组、空白血清组、含药血清组、原药组、阳性对照药(a D3)组，分别加入普通细胞培养液、含空白血清及不同浓度补肾活血中药含药血清、补肾活血中药原药液、阳性对照药(a D3)的条件培养液，在培养第3、6天用MTT比色法观察补肾活血中药含药血清及原药液对成骨细胞增殖率的影响。结果：补肾活血中药含药血清组成骨细胞增殖率较空白血清组、培养液组、a D3组显著增强，且存在剂量依赖关系，随培养期延长，促进作用持续存在。补肾活血中药原药液在一般浓度对成骨细胞增殖无显著影响，而过高浓度对成骨细胞增殖有抑制作用。结论：补肾活血中药含药血清能够直接作用于体外培养的成骨细胞，促进其增殖。