人β干扰素基因重组腺病毒载体的构建及在骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建人β干扰素(hIFN-β)基因重组腺病毒,观察重组腺病毒介导的hIFN-β转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后,细胞内hIFN-β表达情况以及重组腺病毒对MSCs生长的影响.方法 利用细菌内同源重组技术快速构建Ad-hIFN-β腺病毒重组质粒,经酶切及测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组Ad-hIFN-β腺病毒,并进行滴度测定.转染的MSCs行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内hIFN-β mRNA的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测培养液上清hIFN-β的分泌情况;噻唑蓝(MTF)比色法检测细胞活力并绘制转染后MSCs生长曲线.结果 经限制性内切酶检测、基因测序及和绿色荧光观察证实成功的构建了携带hIFN-β基因的重组腺病毒,且重组腺病毒滴度高达1×109pfu/ml.Ad-hIFN-β转染MSCs后在荧光显微镜下证实有绿色荧光;RT-PCR证明转染的MSCs内有hIFN-β mRNA的表达;ELISA检测转染组1、3、5、7、10、15、20 d上清液中hIFN-β蛋白分泌量分别为192、273.436、957、605、472、279 ng/L,明显高于对照组(P<0.01);Ad-hIFN-β转染的MSCs生长曲线与正常培养MSCs差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功构建了携带hIFN-β基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒转染对MSCs的增殖能力无明显影响,而且Ad-hIFN-β转染大鼠MSCs能够表达并分泌hIFN-β蛋白.     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因，插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV—hBMP2，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体，为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。     

抑瘤细胞运动和侵袭的鼠FRNK重组腺病毒的构建

目的应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建小鼠FRNK基因重组腺病毒，并在293HEK细胞中扩增制备重组病毒。方法把小鼠FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack—CMV中，构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV-FRNK，经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后，采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中，通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到293HEK细胞进行包装，获得FRNK重组腺病毒pAdFRNK。荧光显微镜下观察绿荧光的表达。结果经酶切和绿荧光表达证明了小鼠FRNK基因的重组腺病毒载体pAdFRNK构建成功，并制备出高滴度的重组病毒。结论成功构建携带小鼠FRNK基因的重组腺病毒pAdFRNK，为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

TGF-β3真核表达载体转染骨髓基质干细胞促进其向软骨分化的实验研究

[目的]构建生长转化因子(TGF-β3)含绿色加强绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2-EGFP-TGF-β3,然后用该质粒转染骨髓基质干细胞(Marrow stromal cells,MSCs)并促进MSCs向软骨方向分化。[方法]用RT-PCR法从大鼠的胚胎组织中提取TGF-β3的DNA全长,首先连接到pMDl8-T载体,扩增、纯化后经测序公司测序确定插入目的基因序列的正确性,然后再用带有EcoRI、PstI内切酶的引物,从pMD18-T将TGF-β3的全长再次扩增出来,最后将带有酶切位点的TGF-β3的全长插入到真核质粒pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-TGF-β3。体外培养大鼠MSCs,应用阳性脂质体将pIRES2-EGFP-TGF-β3转染到MSCs中,24h后在荧光显微镜下观察蛋白的表达,流式检测MSCs的转染效率;Westen Blot检测TGF-β3蛋白的表达;之后进行MSCs细胞球团培养,分别于第7、14、21、28d检测软骨基质胶原Ⅱ,胶原X和Aggrecan的表达,同时用甲苯胺蓝检测蛋白聚糖(proteoglycan)的表达。[结果]测序结果和酶切鉴定结果表明成功的构建了pIRES2-EGFP-TGF-β3质粒,转染MSCs之后,转染的效率达30%。Westen Blot结果表明TGF-β3获得了成功的表达,在接下来的细胞球团培养过程中,转染后MSCs被成功诱导向软骨分化。     

大鼠小肠转化生长因子β1重组腺病毒载体的构建和表达

目的构建可调控性大鼠小肠TGF-β1表达的重组腺病毒载体。方法按RNA提取试剂（TRIzol Reagent）说明书步骤从大鼠小肠组织抽提总RNA，克隆TGF-β1基因；经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接，鉴定后在HEK293细胞包装。获得高滴度病毒后。取上清检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达，观察目的基因的表达情况。结果扩增出与预期大小一致的cDNA片段，其中TGF-β1大小为1173bp；其基因序列与GenBank登录的大鼠TGF-β1基因序列完全一致。重组TGF-β1腺病毒获得的滴度约为10nPFU／ml；病毒包装后绿色荧光蛋白表达的检测结果显示，绿色荧光蛋白随着时间的延长，表达量逐渐增高；与预期结果一致。结论构建的可调控性大鼠小肠TGF-β1重组腺病毒载体得到了正确表达，为进一步研究TGF-β1干扰树突状细胞分化成熟诱导小肠移植免疫耐受提供了依据。     

转化生长因子-β1反义RNA腺病毒载体的构建

目的构建含转化生长因子β1(TGF-β1)反义RNA的重组腺病毒重组体。方法将TGF-β1的cDNA5＇端630bp片段反向插入穿梭载体pAdTraek-CMV,构建为TGF-β1反义RNA的重组体(pAdTrack-antiTGFβ1),将重组体pAdTrack-antiTGFβ1与包装质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌。用选择培养基筛选同源重组的阳性克隆,同源重组的腺病毒载体转染293细胞,在荧光显微镜下观察细胞中的绿色荧光蛋白(GFP)及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果构建了含rGF-β1反义RNA的重组腺病毒,其滴度为2.4×10     

大鼠小肠转化生长因子β1重组腺病毒载体的构建和表达

目的 构建可调控性大鼠小肠TGF-β1表达的重组腺病毒载体.方法 按RNA提取试剂(TRIzol Reagent)说明书步骤从大鼠小肠组织抽提总RNA,克隆TGF-β1基因;经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接,鉴定后在HEK293细胞包装.获得高滴度病毒后,取上清检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,观察目的 基因的表达情况.结果 扩增出与预期大小一致的cDNA片段,其中TGF-β1大小为1173 bp;其基因序列与GenBank登录的大鼠TGF-β1基因序列完全一致.重组TGF-β1腺病毒获得的滴度约为1012 PFU/ml;病毒包装后绿色荧光蛋白表达的检测结果显示,绿色荧光蛋白随着时间的延长,表达量逐渐增高;与预期结果一致.结论 构建的可调控性大鼠小肠TGF-β1重组腺病毒载体得到了正确表达,为进一步研究TGF-β1干扰树突状细胞分化成熟诱导小肠移植免疫耐受提供了依据.     

增强型绿色荧光蛋白基因转染小鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的：以重组腺病毒（Ad）为载体,将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染至小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）中,为MSCs体内示踪提供实验基础。方法：用全骨髓细胞贴壁法分离纯化小鼠MSCs并体外扩增、鉴定,以重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒（Ad-EGFP）转染,并用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染率,CCK-8法检测转染细胞的增殖活性。结果：转染后10h MSCs开始表达荧光,6～8天达高峰,转染率可达92.3%,28天仍有表达;转染细胞的增殖活性和未转染细胞无统计学差异。结论：Ad-EGFP能高效、安全的转染mMSCs。     

pAD-TGF-β1对骨组织工程种子细胞转归的转基因保护

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)真核表达载体质粒pAD-TGF-β1基因转染对骨组织工程种子细胞骨髓基质干细胞(MSC)体外转归的转基因保护价值.方法 采用荧光显微镜下观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达,噻唑蓝比色法检测细胞增殖情况,核酸原位末端标记法检测细胞凋亡指数.结果 荧光显微镜下证实质粒pAD-TGF-...     

低氧诱导因子-1的病毒载体制备及感染效果

目的 制备低氧诱导因子(HIF)-1腺病毒载体并评价其对表皮角质细胞的感染效果.方法 Ad/HIF-1质粒经酶切鉴定后,以4μg质粒转染1.2×106个HEK293细胞,2 d后荧光显微镜下观察转染效率.1周后收集细胞及上清并感染HEK293细胞进行病毒扩增,待扩增的细胞及上清量达300 ml时进行病毒纯化及滴度测定.最后用制备的病毒载体感染表皮角质细胞,流式测定其感染效果.结果 Ad/HIF-1质粒酶切鉴定正确;转染或感染HEK293细胞后有绿色荧光蛋白(GFP)表达;获得的腺病毒滴度为1.8×1011PFu/ml.病毒以MOI=50感染表皮细胞,2 d后GFP阳性细胞的比例为97.46%.结论 成功制备了HIF-1腺病毒载体,且感染表皮角质细胞后能得到较高的感染效率,从而为腺病毒介导的基因功能研究提供理论基础.     

BMP-12重组腺病毒载体转染外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化研究

目的探讨携带BMP-12基因的腺病毒载体转染诱导外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化的效果。方法取3~4月龄新西兰兔外周血,体外分离培养外周血MSCs至第3代。采用Ad Easy腺病毒载体系统制备BMP-12重组腺病毒载体。将BMP-12重组腺病毒体体外转染第3代外周血MSCs,转染后24 h通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测转染效率,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,转染后8、24 h在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达;转染后0、7、14 d,采用免疫组织化学染色观察I型胶原表达情况;实时定量PCR检测肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin m RNA表达水平,并设未转染细胞作为对照组。结果转染后24 h,倒置相差显微镜观察示细胞生长增殖缓慢,细胞形态清晰;FCM检测示,转染组转染效率为99.57%,未转染组为2.46%;转染后8 h,荧光显微镜下即可见GFP表达,随培养时间延长GFP表达逐渐增多,24 h时几乎所有细胞均可见GFP表达。免疫组织化学染色示,随转染时间延长,Ι型胶原表达逐渐增强;转染组转染后14 d,肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin m RNA表达水平分别为0.061±0.013、0.029±0.008、0.679±0.067,均显著高于未转染组的0.004±0.002、0.003±0.001、0.142±0.024,差异有统计学意义(t=—7.700,P=0.031;t=—5.741,P=0.020;t=—12.998,P=0.000)。结论 BMP-12重组腺病毒载体可明显促进外周血MSCs向肌腱/韧带成纤维细胞表型分化,并促进肌腱/韧带特异基因表达和细胞外基质产生,为外周血MSCs用于肌腱/韧带再生提供了依据。     

人TGF-β1基因腺病毒载体的构建及对骨髓基质干细胞的定向诱导分化作用

目的构建人转化生长因子β1(TGF-β1)基因腺病毒真核表达载体,并观察感染骨髓基质干细胞(MSCs)后目的基因的表达和对细胞生物学行为的影响。方法以复制缺陷的腺病毒Adeno-X为基因载体,制备携带TGF-β1基因的高滴度腺病毒液感染人MSCs,通过免疫细胞化学、原位杂交、己糖醛酸水平检测及甲苯胺蓝染色等方法鉴定外源基因的表达,分析TGF-β1基因转染对MSCs定向软骨分化的调控机制。结果腺病毒感染MSCs后免疫细胞化学染色证实外源基因编码蛋白的表达,通过原位杂交检测出Ⅱ型胶原蛋白基因mRNA,细胞培养液中己糖醛酸水平明显升高。结论成功构建人TGF-β1基因腺病毒表达载体,证实其在MSCs中的表达和具有向软骨细胞定向分化的诱导作用,为软骨缺损修复的局部基因治疗奠定实验基础。     

人前脑啡肽基因修饰人胚胎肾细胞的构建

目的 构建人前脑啡肽基因(hPPE)修饰的人胚胎肾细胞(HEK293细胞).方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/hPPE经限制性内切酶HindⅢ和Not Ⅰ进行双酶切获得hPPE基因,运用基因重组技术将hPPE基因与表达载体同源重组,转染293T细胞进行慢病毒包装、扩增、纯化,测定病毒滴度,再将重组的慢病毒载体转染HEK293细胞.用Western blot法检测hPPE基因在HEK293细胞中的表达.结果 重组慢病毒载体阳性克隆测序结果和基因库的hPPE基因序列完全一致.含有hPPE基因的慢病毒载体,滴度为2.07×108TU/ml.转染慢病毒载体后的HEK293细胞,在荧光显微镜下未见到GFP荧光.转染Ubc-GFP-L.V.空病毒载体的HEK293细胞,可见到较强的荧光.Western blot法检测到经慢病毒载体转染后的HEK293细胞中hPPE基因表达呈阳性.结论 成功构建了hPPE基因修饰的HEK293细胞,使hPPE基因可在HEK293细胞中稳定表达.     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

大鼠GSK3β基因RNAi腺病毒载体的构建与鉴定及其对肝卵圆细胞增殖的促进作用

目的构建并鉴定特异性大鼠糖原合成酶激酶3β(GSK3β)基因siRNA腺病毒载体,观察其对肝卵圆细胞系WB-F344增殖的影响。方法用DNA重组技术将针对GSK3β基因不同部位所设计的2对shRNA序列克隆到高效RNAi真核表达质粒载体pGenesil-1.1中,构建shRNA表达载体pGenesil-1.1-GSK3β。分别酶切重组质粒及pDC312载体,转化连接,构建腺病毒载体pDC312-GSK3β,PCR扩增与鉴定。脂质体法介导腺病毒载体与骨架质粒pPE3-F11共转染293细胞,包装产生腺病毒颗粒AdD C3 12-GSK3β并测定滴度。取病毒上清感染WB-F34 4细胞,荧光显微镜观察细胞荧光含量,Western blotting检测GSK3β蛋白表达。CCK-8测定转染前后WBF-344增殖变化。结果经PCR酶切及Western blotting技术证实成功构建了针对大鼠GSK3β基因RNAi质粒pGenesil-1.1-GSK3β及GSK3β基因RNAi重组腺病毒载体AdDC312-GSK3β。Western blotting证实该重组腺病毒载体可抑制WBF-344细胞GSK3β的表达。CCK-8结果显示干扰GSK3β可促进WBF-344细胞增殖。结论成功构建了针对GSK3β基因RNAi的腺病毒载体,并在大鼠肝卵圆细胞系WBF-344中稳定表达,促进细胞增殖。     

大鼠骨髓间充质干细胞与神经生长因子的体外构建的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的体外构建表达神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的能力,同时使MSCs被绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)稳定标记,通过病毒载体将NGF和GFP基因高效转染到MSCs中。方法取2月龄100～150 g Wistar大鼠,全骨髓法分离培养纯化大鼠MSCs,利用携带人NGFβ基因的修复缺陷性重组腺病毒(Ad- hNGFβ)和携带GFP基因的复制缺陷性逆转录病毒(Rt-GFP)转染MSCs,荧光显微镜观察GFP阳性的MSCs,免疫细胞化学和Western-blot检测hNGFβ的表达。结果Rt-GFP转染后,80%～90%MSCs可激发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。Ad-hNGFβ的转染MSCs中hNGFβ阳性率(90．17±2．14)显著高于阴性对照组(2．17±0．75)和空白对照组(1．83±0．98,P＜0．01),转染后MSCs中NGFβ表达量(188．67±8．71)显著高于阴性对照组(25．67±4．08)和空白对照组(27．50±3．33,P＜0．01)。结论大鼠间充质干细胞的体外构建中Ad-hNGFβ可以高效转染MSCs,实现NGF在MSCs中高效表达,Rt-GFP可以使MSCs获得长效标记。     

pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓间充质干细胞后对血管内皮生长因子表达的影响

目的 克隆构建绿色荧光蛋白(GFP)-Akt表达载体,观察其在鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达和定位及其对(VEGF)mRNA和蛋白表达的影响.方法 采用酶切法将Akt重组于GFP表达载体pEGFP-C1中,经酶切序列鉴定后,将该重组质粒GFP-Akt及GFP空质粒通过脂质体法转染骨髓MSCs.荧光显微镜观察其转染率及在细胞中分布.分别采用用Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测pEGFP-C1和pEGFP-C1/Akt转染MSCs后蛋白和VEGF mRNA的表达.结果 GFP-Akt基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在鼠MSCs中表达.荧光显微镜下pEGFP-C1转染后,绿色荧光均匀分布于细胞中,而pEGFP-C1/Akt转染后,绿色荧光分布于胞质中;与未转染组比较,pEGFP-C1转染组Akt mRNA和蛋白及VEGF mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05);而pEGFP-C1/Akt转染组Akt mRNA和蛋白及VEGF mRNA和蛋白表达显著增加(P＜0.05).结论 成功构建GFP-Akt融合基因表达载体在鼠MSCs中表达;并可诱导AktmRNA及蛋白和VEGF mRNA和蛋白的表达.     

共表达腺病毒载体构建鉴定及其转染骨髓间充质干细胞观察

目的：构建并鉴定绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）2和血管内皮生长因子（vascular endotheliel growth factor,VEGF）165双基因共表达的重组腺病毒,为研究该双基因对骨髓间充质干细胞成骨方向诱导和体内骨缺损修复作用奠定基础。方法：从cDNA文库中PCR扩增BMP2和VEGF165目的基因,并将其插入腺病毒穿梭质粒pAd-MCMV-GFP的多克隆位点,将构建的重组穿梭质粒pAd-MCMV-BMP2-VEGF165和腺病毒辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染细胞HEK293细胞内,经历腺病毒基因重组及出毒后收集细胞,多次冻融离心获取病毒溶液（Ad-BMP2-VEGF165）。进一步纯化并测定病毒滴度,随后通过转染兔骨髓间充质干细胞并检测BMP2和VEGF165双目的基因表达和倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果：基因测序、菌落PCR、Western blotting、Real-time PCR、绿色荧光蛋白表达均表明载体Ad-BMP2-VEGF165构建成功,可稳定转染骨髓间充质干细胞内并稳定表达,经测定腺病毒载体滴度达到1×10¹⁰ PFU/ml。结论：携带人BMP2和VEGF165双基因共表达重组腺病毒载体构建成功,并能获得高滴度的病毒感染液。     

免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。     

携带人VEGF_(165)和ANG-1双基因的腺病毒载体的构建及目的基因的表达

[目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pTrack-CMV中,构建携带双基因的腺病毒穿梭载体pTrack-CMV-VIA。进而使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒。通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测制备的腺病毒pAd-VIA感染的大鼠骨髓基质干细胞中外源基因VEGF165及Ang-1的表达。[结果]该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,证明基因序列正确。转染QBI-293A细胞后,可观察到GFP明显表达。重组合腺病毒载体pAd-VIA获得成功包装,扩增后病毒滴度为2×1010PFU/ml,大鼠骨髓基质干细胞转染48 h后,绿色荧光蛋白表达阳性,ELISA结果显示转染组在感染48 h后,培养细胞上清中的VEGF165浓度为(42.5±2.082)ng/105细胞,ANG-1浓度为(16.67±2.08)ng/105细胞,未转染组几乎未检测到外源基因的表达,有统计学差异(P0.05)。[结论]成功构建携带人VEGF165、ANG-1双基因共表达重组腺病毒载体,为组织工程人工骨血管化的研究奠定基础。