高糖对体外培养的视网膜Müller细胞增殖及细胞信号传导网络的影响

目的以体外培养的大鼠视网膜Müller细胞的变化入手探讨糖尿病性视网膜病变(DR)新生血管的成因。方法原代培养的大鼠视网膜Müller细胞在不同葡萄糖浓度的培养液中培养,培养72 h后,MTT法检测细胞增殖,利用Protein Pathway Array(PPA)技术检测细胞内146磷酸化和非磷酸化蛋白质的表达情况。结果 Müller细胞的增长呈葡萄糖浓度依赖性(50 mmol/L葡萄糖浓度是增殖最强)。50 mmol/L高糖条件下,在视网膜Müller细胞中检测出47种磷酸化和非磷酸化差异表达蛋白质(如XIAP,VEGF,HIF1α,NF-κB等),这些蛋白质涉及细胞生存、增殖、凋亡等几个重要信号传导通路。结论高糖能够刺激视网膜Müller细胞增殖,这种增殖作用是Müller细胞中多条重要信号传导通路共同参与的结果。     

高糖培养的视网膜Muller细胞中embelin对VEGF蛋白质表达的抑制作用

目的研究高糖培养的视网膜Müller细胞中embelin对血管内皮生长因子(VEGF)蛋白质表达的调控作用。方法原代培养的大鼠视网膜Müller细胞在不同糖浓度的培养液中培养,加入X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的特异性抑制剂emblin培养72 h后,利用Western印迹技术检测细胞内VEGF蛋白质的表达情况。结果高糖条件下,在视网膜Müller细胞中VEGF蛋白质表达上调。并且,XIAP的抑制剂emblin加入高糖培养环境后VEGF蛋白质表达下降。结论 XIAP的特异性抑制剂emblin对糖尿病性视网膜病变中VEGF引起的新生血管具有潜在治疗作用。     

色素上皮衍生因子对高糖环境下大鼠视网膜Müller细胞的影响

目的 探讨高糖环境下色素上皮衍生因子(PEDF)对大鼠视网膜Müller细胞的影响.方法将体外25 mmoL/L葡萄糖培养的大鼠Müller细胞以100 ng/ml PEDF或10 ng/ml白细胞介素-1β(IL-1β)孵育24 h,采用间接免疫荧光、Western印迹和实时定量PCR检测相关蛋白和mRNA表达,采用MTT检测Müller细胞活性.结果细胞免疫荧光组化、Western印迹和实时定量PCR检测显示在高糖环境下PEDF可以下调Müller细胞IL-1β蛋白和mRNA的表达,同样IL-1β也可以下调Müller细胞PEDF蛋白和mRNA的表达(P＜0.05);PEDF明显提高视网膜Müller细胞活性(0.48±0.09对0.64±0.17,P＜0.05).结论模拟糖尿病状态下,PEDF可以下调Müller细胞中IL-1β的表达,提高Müller细胞活性,可能对糖尿病炎症引起的病理改变起到一定抑制作用.     

高糖对培养的大鼠视网膜Müller细胞的影响

目的 探讨高糖对体外培养的大鼠视网膜Müller细胞的活力和谷氨酸代谢功能有否改变及其可能机制.方法 将体外培养的大鼠视网膜Müller细胞随机分为正常葡萄糖组(5 mmol/L)和高糖组(25 mmol/L),培养24 h后MTT自动比色法测定两组细胞的活力,采用间接荧光免疫组化法和Western蛋白印迹法检测两组细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和磷酸化的信号转导及转录活化因子3(pSTAT3)的表达情况;采用间接荧光免疫组化法实时PCR检测两组细胞谷氨酰胺合成酶(GS)和c-Jun的蛋白和mRNA表达变化.结果 MTT结果显示高糖状态下细胞活力提高,与对照组相比差异有统计学意义;与对照组相比,高糖组细胞GFAP、pSTAT3、c-Jun蛋白和mRNA的表达均升高,而GS蛋白和mRNA的表达降低.结论 经高糖处理的Müller细胞活力提高,其机制可能与GFAP和pSTAT3的表达升高有关;GS表达下降的可能机制为高糖激活了c-Jun基因.Müller细胞由于谷氨酸循环中的关键酶GS的表达减少而代谢谷氨酸的能力下降,这可能是糖尿病视网膜病变中导致神经节细胞死亡的机制之一.     

高浓度葡萄糖对视网膜Müller细胞超微结构和低氧诱导因子-1α表达的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖对大鼠视网膜Müller细胞超微结构和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响.方法 体外传代培养大鼠视网膜Müller细胞,分正常对照组、葡萄糖25 mmol/L组和50 mmol/L组,电镜观察不同组Müller细胞超微结构的改变,Western印迹检测不同组Müller细胞中HIF-1α的表达.结果 葡萄糖25 mmol/L组Müller细胞超微结构发生了明显的改变:细胞核缩小、不规则,核內染色质呈凝集边聚;胞质浓染,线粒体肿胀,可见空泡结构.葡萄糖50 mmol/L组,胞质内可见残余体,细胞表面绒毛减少变钝.Western印迹结果示正常对照组无HIF-1α蛋白的表达,葡萄糖25 mmol/L组和50 mmol/L组均有低氧诱导因子-1α蛋白的表达,50 mmol/L组蛋白表达量低于25 mmol/L组.结论 高浓度葡萄糖可以引起Müller细胞超微结构的改变,并引起HIF-1α的表达.     

铁皮石斛多糖对高糖状态下视网膜Müller细胞活力及凋亡的调控

目的通过检测高糖和铁皮石斛多糖培养对高糖状态下大鼠视网膜Müller细胞活力和凋亡的调控,探讨铁皮石斛多糖保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法大鼠视网膜Müller细胞用高糖(25 mmol/L)孵育48 h诱导损伤,同时用铁皮石斛多糖(100、200和400μg/ml)处理细胞48 h。实验分为正常对照组、铁皮石斛多糖(低、中、高剂量)组、高糖模型组、低、中、高剂量铁皮石斛多糖处理高糖组。采用MTT法和流式细胞术分别检测细胞活力和细胞凋亡,并计算细胞凋亡率。结果与对照组相比,高糖组Müller细胞活力显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P<0.05),铁皮石斛多糖(100、200和400μg/ml)没有显著影响Müller细胞活力和细胞凋亡(均P>0.05),与高糖组相比,高糖+铁皮石斛(100、200和400μg/ml)组Müller细胞活力显著增加(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。结论铁皮石斛多糖可能通过提高Müller细胞活性,减少Müller的凋亡,达到保护高糖状态下视网膜损伤的作用。     

低氧对大鼠视网膜Müller细胞低氧诱导因子1α和促红细胞生成素蛋白表达的影响

目的探讨低氧对大鼠视网膜Müller细胞低氧诱导因子(HIF)-1α和促红细胞生成素(EPO)蛋白表达的影响。方法体外传代培养大鼠视网膜Müller细胞,分为正常对照组(N组)、氯化钴浓度:50,100,150,200,300μmol/L(C50、C100、C150、C200、C300组),MTT检测不同浓度氯化钴对Müller细胞活力的影响。免疫细胞化学、细胞免疫荧光检测、Western印迹和酶联免疫吸附试验检测HIF-1α、EPO蛋白表达的情况。结果氯化钴浓度低于200μmol/L时,细胞活力不受氯化钴浓度的影响。从200μmol/L开始,细胞活力随氯化钴浓度增高而下降。氯化钴浓度高于50μmol/L时,HIF-1α、EPO蛋白免疫染色可见阳性表达。酶联免疫吸附试验检测,从50μmol/L开始HIF-1α蛋白的表达随氯化钴浓度升高而增加。Western印迹检测,EPO蛋白表达从50μmol/L开始增高,在150μmol/L时达到高峰,以后逐渐下降。结论低氧可引起细胞活性改变并诱导视网膜Müller细胞HIF-1α和EPO蛋白表达的变化。     

PI3K/Akt/mTOR信号通路对大鼠肾小球系膜细胞增殖的调控作用探讨

目的:探讨磷脂酰肌醇-3(PI3K)/蛋白激酶(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路对大鼠肾小球系膜细胞(MC)增殖的调控作用。方法:体外培养大鼠MC,随机分为正常对照组、表皮生长因子(EGF)(10ng/m L)组、PI3K抑制剂LY294002组(2μg/m L)、EGF联合LY294002组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测4组MC的增殖,流式细胞术检测MC周期,免疫荧光法检测系膜细胞m TOR的表达。结果:与正常对照组相比,EGF组能显著促进大鼠MC增殖,G0/G1期细胞减少,S期及G2/M期细胞增加,且m TOR表达增加;LY294002组大鼠MC增殖受抑制,G0/G1期细胞增加,S期及G2/M期细胞减少,且m TOR表达降低;与EGF组比较,EGF联合LY294002干预组MC增殖受抑制,G0/G1期细胞增多,S期及G2/M期细胞减少,且m TOR表达降低。结论:m TOR信号通路参与了大鼠肾小球MC增殖的调控,抑制该信号通路的活化可显著抑制MC的增殖和MC周期的进程。     

胰腺癌相关蛋白质的筛选及信号通路

目的探讨筛选与胰腺癌相关的蛋白质在胰腺癌发生、发展过程中的作用。方法使用蛋白质pathway array技术检测胰腺癌组织与正常胰腺组织内143种磷酸化和非磷酸化蛋白质的表达情况,找出其中差异表达的蛋白质。进一步采用信号传导网络分析(IPA)方法确定这些差异蛋白所涉及的信号传导通路。结果检测到12个差异表达的蛋白质,并确定了10条与胰腺癌相关的信号传导通路。结论这些差异表达的蛋白质及其涉及的信号传导通路与胰腺癌的发生、发展密切相关,对其进一步深入研究将有助于我们寻找胰腺癌诊断和治疗的靶点。     

基质细胞衍生因子-1对大鼠视网膜血管内皮细胞功能的影响及其与MAPK/Erk信号通路的关系

目的探讨基质细胞衍生因子(SDF)-1及MAPK/Erk信号通路抑制剂U0126对体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞(MRVEC)增殖的影响。方法体外培养的MRVEC采用0、25、50和100μg/L的SDF-1处理,100μg/L SDF-1处理体外培养的MRVEC细胞0、24、48和72 h,采用Western印迹方法检测MRVEC细胞中MAPK/Erk信号通路的磷酸化活化情况,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测MRVEC细胞的增殖情况。采用MAPK/Erk信号通路抑制剂U0126预处理MRVEC细胞,观察MAPK/Erk信号通路在SDF-1调控MRVEC细胞增殖中的作用。结果与100μg/L的SDF-1处理组相比,25、50和100μg/L的SDF-1均可显著上调MRVEC细胞中Erk的磷酸化水平,加强MRVEC细胞的增殖能力(P0.01),且这种作用具有剂量依赖性。采用Erk信号通路阻断剂U0126阻断MRVEC细胞中的Erk信号通路后,SDF-1促MRVEC细胞增殖的能力显著降低(P0.01)。结论胰岛素可通过激活MRVEC细胞中的MAPK/Erk信号通路,进而增强MRVEC细胞的增殖能力,从而在糖尿病视网膜病变中发挥一定的作用。     

视网膜Müller细胞在糖尿病视网膜病变中的作用

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病(DM)最为常见和严重的微血管并发症之一,发病率随DM病程的延长而增加,致盲率占眼科双眼盲的第一位.目前越来越多的研究表明Müller细胞在DM早期发生的一系列改变可能是视网膜血管改变的一个主要因素.近年来的临床和基础研究已证实动物模型和DM患者中Müller细胞超微结构和生理功能发生了变化,这种变化早于视网膜血管损伤.DM患者眼底尚未出现改变时,图形视网膜电图(P-ERG)的 b波已有所下降[1],而P-ERG b波起源与Müller细胞关系密切,反映了DM早期Müller细胞已发生功能障碍.     

小檗碱诱导体外培养PC3细胞凋亡的作用

目的观察小檗碱对体外培养人前列腺癌PC3细胞凋亡的作用。方法体外培养前列腺癌PC3细胞,分别用10、20和40μmol/L小檗碱处理细胞后,采用MTT法检测其对细胞增殖的影响,20μmol/L小檗碱处理细胞后流式细胞术检测细胞周期,吖啶橙染色法检测细胞凋亡情况,并通过Western印迹法检测Bcl-xL及前列腺特异性抗原(PSA)蛋白表达。结果小檗碱处理后,PC3细胞出现增殖抑制,细胞周期停滞于G2/M期,吖啶橙染色呈黄染,PSA及Bcl-xL蛋白表达明显下调。结论小檗碱可诱导人前列腺癌PC3细胞凋亡,其作用机制可能与Bcl家族信号通路有关。     

细胞周期调控因子在消化道肿瘤表达的研究进展

完整的细胞周期包括间期和有丝分裂期(M期),间期包括G1期、S期、G2期,细胞周期得以运行的机制在于一系列细胞周期素(cyclin)时相起伏的调控下,相应的周期素依赖性蛋白激酶( cyclin-dependend-kinase,Cdk)依次激活,驱动细胞由G0、G1、S、G2到M期.细胞周期主要有2个调定点:G1/S期、G2/M期.科学家已发现有几类调控因子在细胞周期中起着重要作用:第一类是对细胞分裂增殖有调控作用的细胞生长因子;第二类为细胞周期调控因子,又称内源性调节因子,是细胞内自己合成的蛋白质.细胞周期调控因子在细胞分裂增殖中发挥重要作用,异常表达致使肿瘤细胞过度分裂及增殖,导致肿瘤扩散及转移.细胞周期调控因子分2类:正调控因子(cyclin-Cdk)可促进细胞通过调定点,而负调控因子(Ckis)则可抑制细胞通过调定点.     

基于microRNAs调控的慢性HBV感染的分子机制

目的:从microRNAs(miRNAs)调控角度揭示慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的分子机制.方法:将符合标准的病例分为慢性HBV感染者组(含慢性乙型肝炎及慢性HBV携带者)与正常组,借助Agilent Human miRNA 8×60k微阵列芯片检测血浆中miRNAs表达谱,求得两组间的差异表达miRNAs谱(P0.05),借助miRNA生物信息学分析软件预测其靶基因并对靶基因进行GO功能富集分析和Pathway分析.结果:两组间的差异表达miRNAs共69条(P0.05),28条上调,41条下调;GO分析及Pathway分析得到其功能主要涉及生物黏附、转录正/负调控、生物合成过程的正/负调控、氮化合物的代谢过程的正/负调控、蛋白质定位、蛋白氨基酸的磷酸化、Notch信号传导途径、细胞凋亡、Wnt信号通路、Hedgehog信号通路、T细胞受体信号通路、MAPK信号通路、转化生长因子b信号通路、B细胞受体信号通路、ErbB信号通路、p53信号通路等.结论:慢性HBV感染受特异性mi RNAs调控,其调控涉及多个生命过程和信号通路.     

Janus激酶/信号传导子和转录激活子信号通路重建对MHCC97细胞干扰素α应答的影响

目的阐明原发性肝癌MHCC97细胞中Janus激酶/信号传导子和转录激活子信号通路对干扰素α抗肿瘤增殖作用的影响.方法用Dosper转染干扰素调节因子9（IRF9）表达质粒入MHCC97细胞;用Western blot和寡核苷酸迁移率实验分别检测肝癌细胞中IRF9、细胞周期调控蛋白和干扰素刺激基因因子3的表达;用四甲基偶氮唑盐和流式细胞术分别检测细胞的增殖水平及各期细胞的分布情况. 结果通过高表达IRF9因子可恢复MHCC97细胞对干扰素α抗增殖的应答能力,同时阻滞细胞由S期过渡到G 2期.结论完整的Janus激酶/信号传导子和转录激活子信号通路对介导干扰素α抗肝癌MHCC97细胞的增殖作用至关重要.     

视网膜Müller细胞在糖尿病视网膜病变发病中的作用及其研究进展

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病的重要并发症,其发病机制尚未完全明了。以往对DR的研究主要关注其血管病变,而近年来研究表明,在DR的视网膜血管病变发生之前,已有视网膜神经变性,包括视网膜神经元及神经胶质细胞的变性及丢失。Müller细胞作为视网膜最主要的神经胶质细胞,分布于整个视网膜,包绕视网膜上各级神经元的胞体、突起及视网膜血管。Müller细胞不但可以影响视网膜血管的病变,还能影响视网膜神经细胞的病变,     

RNA干扰ACLY表达对结肠癌SW480细胞周期、凋亡和AKT信号通路的影响

目的探讨RNA干扰ATP-柠檬酸裂解酶(ACLY)表达对结肠癌SW480细胞周期和凋亡的影响及其机制。方法将体外培养的SW480细胞分为Ctrl组、NC-siRNA组和ACLY-siRNA组,采用Western blot检测各组细胞中ACLY蛋白和蛋白激酶B(AKT)信号通路相关蛋白细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达以及AKT鳞酸化水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率。结果与Ctrl组相比,ACLYsiRNA组细胞中ACLY、CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达水平、细胞存活率、细胞在S期和G2/M期百分比以及AKT鳞酸化水平均明显降低,而细胞在G0/G1期百分比、细胞凋亡率和Bax蛋白的表达水平均明显升高(P 0. 05); NC-siRNA组与Ctrl组相比,差异无统计学意义(P0. 05)。结论 RNA干扰ACLY表达可诱导结肠癌细胞周期阻滞和凋亡,其作用机制可能与抑制AKT信号通路的活化有关。     

线粒体融合素2基因突变体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 研究大鼠线粒体融合素2基因的蛋白激酶A磷酸化位点两种突变体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其相关的信号通路.方法 利用两种携带蛋白激酶A磷酸化位点突变的线粒体融合素2基因重组腺病毒(Adv-Mfn2-alaPKA和Adv-Mfn2-asnPKA)和携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒(Adv-Mfn2),感染培养的大鼠血管平滑肌细胞.水溶性四甲基偶氮唑盐法比较各组细胞增殖的变化;流式细胞术比较各组细胞周期的变化;免疫印迹法比较各组线粒体融合素2基因和磷酸化细胞外调节激酶1/2蛋白表达变化.结果 感染重组腺病毒的三组细胞线粒体融合素2基因表达差异无显著性.与对照组相比,Adv-Mfn2-alaPKA和Adv-Mfn2组显著抑制细胞增殖(P<0.01),停滞于G_0/G_1期细胞比例显著增加(P<0.01),磷酸化细胞外调节激酶1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.01),且Adv-Mfn2-slaPKA作用更明显(P<0.01),而Adv-Mfn2-asnPKA组较对照组差异无显著性.结论 Mfn2-alaPKA通过细胞外调节激酶1/2信号通路抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用较线粒体融合素2基因更明显;而Mfn2-asnPKA对血管平滑肌细胞无抑制增殖的作用,对细胞外调节激酶1/2信号通路也无作用.蛋白激酶A磷酸化位点是调控线粒体融合素2基因抗血管平滑肌细胞增殖的重要功能位点.     

细胞外调节蛋白激酶信号通路在乙型肝炎病毒X基因调控c-met基因启动子中的作用

目的 明确在乙型肝炎病毒X基因(HBx)对原癌蛋白质(c-met)基因启动子区的调控中所涉及的信号传导通路及其在肝癌侵袭和转移中的作用.方法 用Western blot比较可能涉及的信号通路特异性阻断剂对HBx调控c-met表达的影响,分析在该调控过程中所涉及的信号通路.体外侵袭试验验证信号传导通路在HBx调控c-met表达中的作用.对数据进行析因设计的方差分析.结果 HBx引起c-met表达水平的增加,细胞外调节蛋白激酶信号通路抑制剂U0126能够降低该作用,而p38MAPK信号通路抑制剂SB203580、PI-3K信号通路抑制剂wortmanin则未显示出该作用.体外细胞侵袭试验也证实了U0126能够降低HBx引起的HepG2细胞的强侵袭性[(74.3±6.2)个与(34.6±5.2)个,F=113.45,P＜0.01].结论 HBx引起肝癌细胞的侵袭转移可能与其通过细胞外调节蛋白激酶信号通路对c-met基因启动子区(-183 bp～-100 bp)的调控有关.     

二黄糖肾康对糖尿病肾病大鼠肾脏细胞凋亡及PI3 K/AKT信号转导系统的影响

目的 观察二黄糖肾康对糖尿病肾病(DN)大鼠细胞凋亡及PI3 K/AKT信号转导系统的影响. 方法 SD大鼠单侧肾切除加腹腔注射链脲佐菌素(STZ)复制DN模型,每日二黄糖肾康灌胃,8 w后流式细胞术检测细胞凋亡数目及调控因子Bax、Bcl-2、Fas、Fas-L的蛋白表达,采用Western 印迹方法检测细胞内磷酸化Akt蛋白质的表达.结果 二黄糖肾康明显减少DN大鼠肾脏皮质细胞凋亡数目,降低Bax、Fas、Fas-L的的蛋白表达,增加Bcl-2的蛋白表达,激活PI3 K/AKT信号通路.结论 二黄糖肾康能有效降低肾脏细胞凋亡,激活PI3 K/AKT信号通路.