热毒宁注射液抗甲型H1N1流感病毒作用机制研究

目的 研究热毒宁注射液体内抗甲型H1N1流感病毒的作用及其机制。方法 采用甲型H1N1流感病毒滴鼻感染BALB/c小鼠制备肺炎模型,观察热毒宁注射液对甲型H1N1流感病毒感染小鼠平均存活时间、存活率、肺指数、病毒载量及细胞因子的影响。结果 与模型组比较,热毒宁注射液显著提高病毒感染小鼠的存活率、延长小鼠平均存活时间（P＜0.05、0.01）;显著降低病毒感染小鼠肺指数、肺组织病毒载量（P＜0.05、0.01）;提高肺组织γ干扰素（IFN-γ）水平,降低白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。结论 热毒宁注射液对甲型H1N1流感病毒感染小鼠具有一定的保护作用,其作用机制可能与提高IFN-γ水平,降低IL-6、TNF-α水平有关。     

北豆根总生物碱的抗病毒感染功能与机制

目的 探讨北豆根总生物碱的抗病毒感染作用及其与Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）信号通路的关系。方法 通过倒置荧光显微镜、流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）等方法检测北豆根总生物碱对甲型流感病毒（H1N1）、水疱性口炎病毒（VSV）和脑心肌炎病毒（EMCV）在细胞内复制的影响。构建H1N1病毒感染小鼠模型,将小鼠分为空白组、H1N1模型组、北豆根总生物碱组（10、20、30 mg·kg^-1）和奥司他韦组（40 mg·kg^-1）,研究北豆根总生物碱对感染小鼠的体质量和生存率的影响。Real-time PCR检测北豆根总生物碱对细胞中IFN-Ⅰ通路的激活作用,并在干扰素受体1（IFNAR1）敲除的A549细胞（IFNAR1^-/--A549）检测北豆根总生物碱抗病毒感染作用与IFN-Ⅰ通路的关系。结果 与空白组比较,病毒感染模型组中的病毒大量增殖（P<0.01）;与模型组比较,北豆根总生物碱在体外显著抑制H1N1、VSV和EMCV的复制（P<0.01）,在体内抑制H1N1病毒感染小鼠体质量降低,提升小鼠生存率（P<0.05）。此外,北豆根总生物碱激活IFN-Ⅰ通路并依赖该通路发挥抗病毒感染作用。结论 北豆根总生物碱通过激活IFN-Ⅰ通路发挥体内和体外的抗病毒感染作用。     

基于IRS-1/PI3K/AKT通路探讨枳葛口服液对酒精性肝病大鼠胰岛素抵抗的影响＊

目的 探讨枳葛口服液对酒精性肝病大鼠胰岛素抵抗的影响及可能机制。方法 SD雄性大鼠100只随机分为5组，正常组（蒸馏水）、模型组（52%老白干）、枳葛口服液高、中、低剂量组（52%老白干 + 不同剂量枳葛口服液）灌胃。各组大鼠每四周取尾静脉血测定FBG、FINS，持续16周后处死大鼠，取肝组织行HE染色、免疫组化，取肝脏总蛋白Western blotting检测IRS-1、PI3K、AKT、GLUT-2等IRS-1/PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平。结果 与正常组比较，模型组FBG、FINS明显升高（P < 0.05），IRS-1/PI3K/AKT通路相关蛋白水平均显著降低（P < 0.01），HE染色及免疫组化可见细胞内较多的脂肪空泡；与模型组比较，枳葛口服液高、中剂量组以上指标均有所改善（P < 0.05），低剂量组以上指标无明显改善（P > 0.05）。结论 乙醇诱导的酒精性肝损伤大鼠存在着胰岛素抵抗及IRS-1/PI3K/AKT通路的改变，一定剂量的枳葛口服液可能通过IRS-1/PI3K/AKT信号通路改善胰岛素抵抗状态。     

清营解表合剂对流感病毒感染小鼠外周血Th1, Th2型细胞因子动态表达的影响

目的: 探讨清营解表合剂对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响。 方法: 以流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株(A/PR/8/H1N1)感染小鼠为模型,灌服清营解表合剂16 g·kg^-1(0.8 g·mL^-1,0.4 mL/只),1次/d,连续ig给药12 d,应用流式细胞仪分析药后3,6,9,12 d特异性细胞因子γ-干扰素,肿瘤坏死因子-α,白细胞介素3,4,6,10的动态表达水平及Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)值。 结果: 流感病毒感染小鼠后3 d,细胞因子IFN-γ升高显著(P<0.05),6,9,12 d无显著改变,6,9 d较3 d均降低显著(P<0.05);3,6,9,12 d 细胞因子TNF-α均升高显著(P<0.01,P<0.05);3,6,9,12 d细胞因子IL-3均升高,3,6 d差异显著(P<0.05);3,6,9,12 d细胞因子IL-4,IL-6,IL-10 均显著升高(P<0.01),在早期3 d达到峰值;3,6,9,12 d外周血Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)明显降低(P<0.01,P<0.05),且6 d降到最低点,12 d较6 d升高显著(P<0.05)。经清营解表合剂治疗后,3 d细胞因子IFN-γ水平升高,较模型组无显著差异,6,9,12 d较模型组升高显著(P<0.01,P<0.05);3,6,9,12 d细胞因子 TNF-α水平表达较模型组均明显下降(P<0.01,P<0.05);3,6,9,12 d细胞因子IL-3 较模型组均有所下降,但差异无统计学意义;3,6,9,12 d细胞因子IL-4,IL-6,IL-10 水平较模型组均显著降低;3,6,9,12 d 外周血Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)均升高,差异显著(P<0.01),12 d清营解表组较3 d升高显著(P<0.01)。 结论: 清营解表合剂通过调节流感病毒感染小鼠外周血Th型细胞因子的表达水平,恢复机体的抗感染免疫平衡,提高机体免疫功能,以防治流感病毒感染。     

β-榄香烯对非小细胞肺癌细胞迁移的影响及其机制研究＊

目的 探究β-榄香烯对非小细胞肺癌细胞迁移的影响及其作用机制。方法 将人非小细胞肺癌A549细胞分为5组：空白对照组、β-榄香烯低、中、高剂量组（10 μg·mL^-1、25 μg·mL^-1、50 μg·mL^-1）、顺铂（Cisplatin，CDDP，20 μmol/L）组。根据分组，分别用对应的药物处理细胞。Hoechst 33258染色观察细胞凋亡；Transwell小室检测细胞迁移；Western blot检测E-钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase，p-PI3K）与磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylated protein kinase B，p-AKT）表达水平。结果 与空白对照组相比，β-榄香烯高剂量组A549细胞出现凋亡现象，各β-榄香烯组的A549细胞迁移数量均显著减少（P < 0.05），β-榄香烯中、高剂量组A549细胞E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P < 0.05），Vimentin、p-PI3K与p-AKT蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）。结论 β-榄香烯能诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡，抑制上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）过程，进而减弱迁移能力，其作用机制可能与干扰PI3K/AKT信号通路的激活有关。     

基于网络药理学和实验验证探索荆防合剂治疗甲型H1N1流感的作用机制

目的 预测荆防合剂治疗甲型H1N1流感的潜在靶点及作用机制，以期为荆防合剂临床应用提供参考依据。方法 通过中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP）、SwissTargetPrediction、TargetNet数据库筛选荆防合剂抗甲型H1N1流感的活性成分及作用靶点，通过GeneCards、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、DisGeNet数据库获取甲型H1N1流感靶点并统一使用UniProt KB数据库进行标准化，借助Venny 2.1.0在线平台获取两者交集靶点；采用Cytoscape 3.2.1软件建立“药物-成分-靶点”网络图并进行拓扑学属性分析；将交集靶点上传至STRING 11.5数据库获得蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）关系网络，并在Metascape平台中进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。最后通过Autodock vina软件将度值靠前的活性成分和关键核心靶点进行对接验证，并用PyMOL软件进行可视化分析。采用BALB/C雌鼠进行实验验证，苏木素-伊红（HE）染色观察肺组织病变情况，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）因子水平，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组动物肺组织mRNA和蛋白表达水平。结果 荆防合剂中共有活性成分144个，获得靶点基因421个，甲型H1N1流感靶点2 956个，两者交集靶点199个，拓扑学分析显示，荆防合剂治疗甲型流感的核心成分为槲皮素、木犀草素和山柰酚，核心靶点为人前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、雌激素受体1（ESR1）、诱导型一氧化氮合酶2（iNOS2）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、环氧合酶-1（PTGS1）等。GO富集分析中生物学过程（BP）得到697个条目（P<0.01），分子功能（MF）得到59个条目（P<0.01），细胞组成（CC）得到21个条目（P<0.01）。KEGG富集分析中共得到132条信号通路（P<0.01）如磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等，大多与调节免疫性炎症有关。分子对接结果显示，荆防合剂的活性成分与核心靶点的结合能均<-5.0 kcal·mol^-1，证明其具有较好的结合活性。HE染色显示给药组动物肺组织明显改善，Real-time PCR和Western blot显示荆防合剂可降低肺组织中PI3K和Akt的表达水平。结论 荆防合剂可通过多成分、多靶点、多通路发挥抗甲型流感病毒的作用，其中的活性成分槲皮素、木犀草素和山柰酚可能通过作用于PTGS2、ESR1、iNOS2、PPARG、PTGS1等靶点，进而对PI3K/Akt、MAPK等信号通路产生炎性控制及免疫调节作用。     

葶苈大枣泻肺汤通过Caspase-1诱导A549细胞焦亡与凋亡的机制

目的 探讨葶苈大枣泻肺汤诱导A549细胞焦亡和凋亡的机制。方法 将A549细胞随机分为空白组、葶苈大枣泻肺汤低、中、高质量浓度组（中药低、中、高质量浓度组），中药低、中、高质量浓度组分别以葶苈大枣泻肺汤20、40、60 mg·L^-1处理，空白组以等体积培养液处理。药物作用48 h后，划痕实验检测细胞迁移能力，流式细胞仪检测细胞凋亡，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、NOD样受体蛋白3（NLRP3）、消皮素D（GSDMD）、细胞凋亡抑制因子（Survivin）蛋白及核转录因子-κB（NF-κB）通路蛋白相对表达量，DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）水平，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞上清液肿瘤坏死因子-β（TNF-β）和白细胞介素-1β（IL-1β）含量。结果 与空白组比较，中药低、中、高质量浓度组细胞划痕愈合率明显降低，细胞凋亡率明显增加，Survivin蛋白相对表达量明显降低，Caspase-1、GSDMD、NLRP3相对表达量明显增加，ROS和NF-κB磷酸化水平明显上升，细胞上清液TNF-β和IL-1β含量明显增加（P<0.05）；与中药低质量浓度组比较，中药中、高质量浓度组细胞划痕愈合率明显降低，细胞凋亡率明显增加，Survivin蛋白相对表达量明显降低，Caspase-1、GSDMD、NLRP3相对表达量明显增加，ROS和NF-κB磷酸化水平明显上升，细胞上清液TNF-β和IL-1β含量明显增加（P<0.05）；与中药中质量浓度组比较，中药高质量浓度组细胞划痕愈合率明显降低，细胞凋亡率明显增加，Survivin蛋白相对表达量明显降低，Caspase-1、GSDMD、NLRP3相对表达量明显增加，ROS和NF-κB磷酸化水平明显上升，细胞上清液TNF-β和IL-1β含量明显增加（P<0.05）。结论 葶苈大枣泻肺汤可提高NLRP3蛋白表达，抑制Survivin蛋白表达，促进A549细胞凋亡；同时，可激活NF-κB通路和ROS系统，上调细胞焦亡因子Caspase-1，GSDMD的表达，介导A549细胞焦亡。     

基于SIRT1和PI3K/Akt信号通路探讨黄芪甲苷对慢性难愈性创面大鼠模型修复愈合的影响及作用机制

目的 探讨黄芪甲苷对慢性难愈性创面修复愈合的促进作用及其机制。方法 60只雄性SD大鼠背部构建全层皮肤缺损创面，除正常组外，其余大鼠构建难愈性创面模型，随机分为模型组、黄芪甲苷低、高剂量组、黄芪甲苷+ LY294002［磷酸肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂］组和黄芪甲苷+EX527［沉默调节蛋白1（SIRT1）抑制剂）］组。观察各组大鼠创面造模后第2、4、6、8天的伤口面积占比；免疫荧光检测创面组织Ⅰ型胶原α1（COL1A1）和α-肌动蛋白（α-SMA）表达；苏木素-伊红（HE）染色检测创面组织病理结构；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测创面炎症因子mRNA表达；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测创面SIRT1/核转录因子（NF）-κB和PI3K/蛋白激酶B（Akt）信号通路相关蛋白表达。结果 与模型组比较，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠术后伤口面积占比均随时间逐渐降低，且黄芪甲苷高剂量组疗效更佳。与正常组比较，模型组创面组织COL1A1荧光强度降低而α-SMA表达升高；上皮组织破损严重，厚度增加，可见大量炎性细胞浸润；肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的mRNA表达升高；NF-κB p65、磷酸化（p）-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表达升高，而SIRT1表达降低（P<0.05）。与模型组比较，黄芪甲苷治疗后COL1A1和α-SMA荧光强度增高；上皮细胞数量增多，厚度降低，炎性细胞减少，胶原数量增多；TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表达降低；NF-κB p65、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表达降低，SIRT1升高，且高剂量组效果更佳（P<0.05）。与黄芪甲苷高剂量组比较，LY294002和EX527抑制PI3K/Akt和SIRT1通路可阻止黄芪甲苷对慢性难愈性创面的治疗效力。结论 黄芪甲苷外用对大鼠慢性难愈性创面愈合有明显促进作用，其机制可能与激活PI3K/Akt通路和SIRT1/NF-κB通路有关。     

基于蛋白质组学探讨雾化吸入BD-77对呼吸道病毒感染的抑制作用及机制

目的 观察雾化吸入BD-77对多种呼吸道病毒感染动物模型的治疗作用,并利用蛋白质组学手段,探究BD-77广谱抗病毒作用机制。方法 流感病毒H1N1/FM1实验选用ICR小鼠分为正常组、模型组、达菲组、75、37.5 g·L^-1均分别吸入20 min组、25 min组;人冠状病毒229E和人冠状病毒OC43实验选用BALB/c小鼠正常组、模型组、磷酸氯喹组、BD-77的75、37.5、18.75、9.375 g·L^-1剂量组,每组10只,分别采用流感病毒H1N1/FM1、人冠状病毒229E和人冠状病毒OC43感染致肺炎模型,检测小鼠肺指数、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测肺组织病毒载量、酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肺组织中相关炎性因子,并对OC43感染小鼠肺组织进行蛋白质组学分析。结果 与正常组比较,各感染组小鼠肺指数显著升高（P<0.01）、人冠状病毒229E和人冠状病毒OC43小鼠肺组织内能检测到病毒核酸,且人冠状病毒229E感染小鼠肺组织中白细胞介素-6（IL-6）、IL-10、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量均显著升高（P<0.01）;BD-77能够明显降低流感病毒H1N1/FM1、人冠状病毒229E和人冠状病毒OC43感染小鼠的肺指数（P<0.05,P<0.01）;显著降低人冠状病毒229E和人冠状病毒OC43感染小鼠的肺内病毒载量（P<0.01）;显著降低人冠状病毒229E感染小鼠肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α的含量（P<0.01）。OC43感染小鼠肺组织蛋白质组学显示,BD-77调节了腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路、TNF信号通路、NOD样（NOD-like）信号通路、IL-17信号通路、叉头框蛋白O（FoxO）信号通路和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路等。结论 雾化吸入BD-77能够有效治疗流感病毒H1N1/FM1、人冠状病毒229E和人冠状病毒OC43感染小鼠所致肺炎,并且可能是通过调节细胞代谢平衡、增强宿主免疫功能、减轻炎症反应来发挥抗病毒作用的。     

对叶百部总生物碱对人肺癌A549细胞凋亡、PI3K/Akt和JNK/p38 MAPK信号通路的影响

目的 探讨对叶百部总生物碱对人肺癌A549细胞凋亡及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和c-Jun氨基末端激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶（JNK/p38 MAPK）信号通路的影响。方法 以人肺癌A549细胞为研究对象,设置空白组和不同质量浓度（100、150、200、250、300 mg·L^-1）对叶百部总生物碱组。利用噻唑蓝（MTT）比色法、平板克隆实验观察对叶百部总生物碱对A549细胞增殖的影响;采用Hoechst 33258染色法和流式细胞术膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（AnnexinV-FITC）/碘化丙锭（PI）双染法观察细胞凋亡;蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）和Bcl-2表达及PI3K、磷酸化（p）-PI3K、Akt、p-Akt、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表达。结果 与空白组比较,对叶百部总生物碱组（150、200、250、300 mg·L^-1）细胞增殖抑制率显著增高（P<0.01）;对叶百部总生物碱组（150、200、250、300 mg·L^-1）细胞克隆抑制率显著升高,细胞克隆形成率显著降低（P<0.01）。与空白组比较,对叶百部总生物碱组细胞出现染色质凝聚,荧光反应加强等典型的细胞凋亡特征。与空白组比较,对叶百部总生物碱组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）;对叶百部总生物碱（150、200、250、300 mg·L^-1）能够明显上调Caspase-3、Bax蛋白表达（P<0.05,P<0.01）,显著下调Bcl-2蛋白表达（P<0.01）;对叶百部总生物碱对PI3K、Akt、JNK、p38 MAPK总蛋白表达无明显影响,对叶百部总生物碱（150、200、250、300 mg·L^-1）能够明显下调PI3K、Akt磷酸化水平（P<0.05,P<0.01）;明显上调p38 MAPK磷酸化水平（P<0.05,P<0.01）;对叶百部总生物碱（200、250、300 mg·L^-1）能够明显上调JNK磷酸化水平（P<0.05,P<0.01）。结论 对叶百部总生物碱可抑制人肺癌A549细胞的增殖,并能诱导A549细胞凋亡,其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路和激活JNK/p38 MAPK信号通路有关。     

金银花、连翘对甲型H1N1流感免疫调节通路影响的生物信息学分析

目的:基于生物信息学方法分析金银花、连翘对甲型H1N1流感免疫调节通路的影响。方法:在台湾中医药资料库,Pub Chem及Gene公众网络平台数据库查找金银花、连翘的靶蛋白及甲型H1N1流感相关基因,运用生物信息软件对检索到的数据集进行分析,解读金银花、连翘单用和连用对甲型H1N1流感相关的免疫调节生物通路的影响。结果:金银花相关靶蛋白共16个,连翘相关靶蛋白共8个,甲型H1N1流感相关基因32个;生物信息分析发现金银花和连翘有各自作用的特异性的免疫调节通路;对于巨噬细胞中白介素-12信号的生成通路和白介素-8信号通路,二者作为药对使用后,代表药物靶蛋白与生物通路相联性的-log P大于单独使用金银花或连翘;金属蛋白酶家族(MMPs)参与了多数金银花特异性作用的通路,蛋白激酶C-α(PRKCA)参与了连翘特异作用的通路。结论:对于甲型H1N1流感相关的免疫通路,金银花和连翘有各自的调节特点,作为药对使用对对巨噬细胞中白介素-12信号的生成通路和白介素-8信号通路调节更有优势,MMPs和PRKCA可能是金银花和连翘分别作用于免疫通路的关键蛋白。     

麻杏石甘汤防治甲型H1N1流感分子机制的生物信息学分析

目的: 通过构建分子网络及解析生物学通路,探讨麻杏石甘汤防治甲型H1N1流感的分子机制。 方法: 查找麻杏石甘汤中药成分的有效化合物,在PubChem数据库中检索有效成分的靶蛋白,在Gene数据库中查找甲型H1N1流感的相关基因,运用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)软件对二者进行构图和解析。 结果: 查找到麻杏石甘汤的靶蛋白186个,甲型H1N1流感相关基因7个。二者的分子网络复杂,生物功能多样,在共同作用的8条生物通路中,有4条通路为细胞免疫相关通路:病毒模式识别受体信号通路、巨噬细胞白介素12(IL-12)信号和生产通路、蛋白激酶(PKR)在干扰素诱导的抗病毒反应中作用通路、肿瘤坏死因子受体I (TNFR1)信号通路。麻杏石甘汤可以调节细胞免疫相关通路中的Toll样受体9(TLR9)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、核苷酸结合的寡聚结构域2受体(NOD2)等多个位点。 结论: 麻杏石甘汤可以通过干预细胞免疫相关通路中的多个位点起到防治甲型H1N1流感的作用。     

喘可治注射液对甲型H1N1流感病毒FM1株致小鼠肺炎的影响

目的:评价喘可治注射液对甲型H1N1流感病毒FM1株致小鼠肺炎模型的药效作用。方法:将ICR小鼠随机分为正常组、模型组、达菲组(27.5 mg·kg~(-1)·d~(-1))、喘可治注射液组(1.5 m L·kg~(-1)·d~(-1))。除正常组外,其余各组采用甲型H1N1流感病毒FM1株滴鼻感染ICR小鼠造成病毒性肺炎模型,分别进行死亡保护实验、治疗性给药实验和预防性给药实验。死亡保护实验中每组20只小鼠,以2倍半数致死量(LD_(50))流感病毒液滴鼻感染,感染后当天开始给药,每天1次,连续4 d,观察感染后14 d内动物的死亡情况,并计算死亡率、死亡保护率;治疗性给药实验中每组10只小鼠,以0.8倍LD_(50)流感病毒液滴鼻感染,感染后当天开始给药,每天1次,连续4 d,于实验第5天处死小鼠,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测肺组织中白细胞介素-8(IL-8)含量及脑组织内发热介质前列腺素E_2(PGE_2),精氨酸加压素(AVP)的含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肺组织内相对病毒载量;预防性给药实验中每组10只小鼠,分组当天开始给药,每天1次,连续5 d,末次给药1 h后,除正常组外,其余各组以0.8倍LD_(50)流感病毒滴鼻感染ICR小鼠,感染后第4天称重后处死小鼠,计算各组肺指数、脾指数、胸腺指数及肺指数抑制率,Real-time PCR检测肺组织内相对病毒载量。结果:与正常组比较,模型组小鼠IL-8,PGE2含量,肺指数及肺组织内流感病毒株病毒载量均显著升高(P0.01);与模型组比较,治疗性给予喘可治注射液可明显降低感染后小鼠的死亡率、肺组织内IL-8含量、脑组织内PGE_2含量及肺组织中流感病毒病毒载量(P0.05,P0.01);预防性给予喘可治注射液可显著提高感染小鼠的胸腺指数(P0.01),明显降低感染小鼠肺指数及肺组织中流感病毒病毒载量(P0.05);两种给药方式均可明显减轻支气管、血管周围及肺泡间质等组织炎性细胞浸润,减少管腔内红细胞渗出。结论:喘可治注射液对甲型H1N1流感病毒感染所致病毒性肺炎小鼠模型有较好的治疗和预防作用,其作用机制可能与减轻炎症反应和抑制病毒复制有关。     

复方龙芩草微乳提取液体外抗H1N1流感病毒的作用研究

[目的]考察生物相容性微乳及复方龙芩草微乳提取液体外抗H1N1流感病毒的效果。[方法]运用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测微乳和复方龙芩草微乳提取液对A549细胞的最大无毒浓度(TC_0)及半数抑制浓度(TC_(50)),采用细胞病变效应(CPE)法表示药物对病毒感染细胞的作用,MTT法检测细胞病变抑制率(ER)。采用Probit回归法计算受试药物在体外抗H1N1流感病毒的半数抑制浓度(IC_(50))和治疗指数(TI)。[结果]微乳在一定程度上抑制H1N1流感病毒对细胞的感染作用,IC_(50)为769.178 mg/L(以含微乳量计),TI为9.078;复方龙芩草微乳提取液具有显著的抗H1N1流感病毒的效果,当浓度为1 250 mg/L(以含微乳量计)时,抗病毒效率达到91.37%,IC_(50)为314.808 mg/L,TI为20.889。[结论]复方龙芩草微乳提取液体外抗H1N1流感病毒的效果显著,微乳具有一定的抗流感病毒的效果,在复方龙芩草微乳提取液中或许起到辅助作用。     

一叶抗流感胶囊抑制甲型H1N1流感病毒感染的体内外研究

目的:研究一叶抗流感胶囊体内外抗甲型H1N1流感病毒的作用。方法:ICR小鼠随机分为对照组、利巴韦林组(0.07 g·kg-1)、抗病毒颗粒组(4.24 g·kg-1)、一叶抗流感胶囊(1.5,0.75,0.38 g·kg-1),采用甲型H1N1流感病毒(FM1,PR8)滴鼻感染小鼠造成肺炎模型,治疗给药于感染后连续ig 4 d,预防给药4 d后再感染病毒,计算肺指数、死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率;体外Cytopathic effect(CPE)法观察一叶抗流感胶囊抗流感病毒的作用,犬肾上皮细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞密度为1×105个/mL,药物质量浓度为2.5,1.25,0.62,0.31 g·L-1,作用时间为48 h,每组4个样本。结果:与正常组比较,采用甲型H1N1流感病毒FM1和PR8病毒株感染小鼠后,治疗给药和预防给药下,病毒组肺指数均明显增高,治疗给药组的死亡率分别为90%和90%、预防给药组的死亡率为85%和55%,治疗给药组的平均存活天数分别为9.20 d和9.25 d、预防给药组的平均存活天数分别为9.35,11.60 d;一叶抗流感胶囊高、中剂量组治疗性给药后能明显降低流感病毒FM1株和PR8株感染后小鼠的肺指数(高剂量组1.03±0.28,0.88±0.13;中剂量组1.08±0.14,0.92±0.10);延长平均存活天数[高剂量组(11.05±2.86),(11.20±2.86)d,中剂量组(10.95±2.78)d,(10.90±2.86)d,一叶抗流感胶囊高、中剂量组预防性给药明显延长平均存活天数(11.15±2.30),(11.75±2.24)d。一叶抗流感胶囊在体外对FM1毒株的IC50为0.89 g·L-1,治疗指数为6.75。结论:一叶抗流感胶囊对甲型H1N1流感亚型FM1株体内、体外均有明显的治疗作用;对PR8株仅体内治疗给药有效。     

众生丸在小鼠体内抗H5N1亚型禽流感病毒的实验研究

目的：研究众生丸在小鼠体内对禽流感病毒H5N1亚型的抑制作用。方法：以达菲为阳性对照,观察众生丸对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用和对染毒小鼠的死亡保护作用,从而判定其抗流感病毒作用。结果：与病毒对照组相比较,众生丸可降低禽流感病毒性肺炎小鼠肺指数,调节T淋巴细胞亚群,降低小鼠血清中TNF-α含量,促进IFN-γ和IL—10产生,减轻肺间质、肺泡内炎症;众生丸低剂量组对H5N1亚型禽流感病毒所致小鼠的死亡有降低作用,并延长生存时间。结论：众生丸对H5N1禽流感病毒感染小鼠所致肺病变具有抑制作用。     

银花平感颗粒体内抗甲型H1N1流感病毒作用

为探讨银花平感颗粒(YHPG)体内抗甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)作用及其对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响,采用滴鼻感染ICR小鼠建立流感病毒肺炎模型,感染后第3天和第7天测定各组动物肺指数并观察肺组织病理变化;采用实时荧光定量RT-PCR和流式细胞技术,观察各组肺组织病毒载量以及外周血T细胞亚群(CD4⁺,CD8⁺,CD4⁺/CD8⁺)的变化。结果表明,YHPG(15,30 g·kg^-1)剂量组在感染后第3天和第7天均能显著降低流感病毒感染小鼠肺指数和肺组织病毒载量,减轻肺组织病理变化,同时还可显著提高外周血CD4⁺ T细胞水平和CD4⁺/CD8⁺比值,降低CD8⁺ T细胞水平。说明YHPG可抑制流感病毒复制、减轻流感病毒感染小鼠肺部损伤以及调节流感病毒小鼠免疫功能下降,对甲型H1N1流感病毒感染小鼠有一定的治疗作用。     

消岩汤对A549/DDP细胞自噬及耐药蛋白的影响研究

[目的]通过消岩汤对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP多药耐药及自噬蛋白的影响,探究消岩汤对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP的耐药逆转作用及探讨相关分子通路。[方法]建立稳定细胞耐药模型,连续灌胃不同浓度消岩汤10 d后,通过血清药理学的实验方法,提取药物血清,用含药血清作用于肺腺癌细胞耐药细胞A549/DDP,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(QPT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Werstern Blot)检测A549/DDP耐药、自噬相关基因的表达及相关通路蛋白的变化。[结果]高剂量消岩汤,低剂量消岩汤和生理盐水作用于肺腺癌耐药细胞A549/DDP,检测A549/DDP细胞中耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)、肺抗药性相关蛋白(LRP)及自噬相关蛋白Beclin1,HMGB1m RNA和蛋白表达变化,发现高剂量组消岩汤处理细胞株后P-gp、LRP及自噬相关蛋白Beclin1,HMGB1 m RNA和蛋白均发生降低(P0.05),进一步发现消岩汤可影响AKT1-m TOR相关基因,消岩汤明显降低AKT1,m TOR蛋白的表达。[结论]消岩汤通过影响AKT1-m TOR分子通路进而影响耐药相关蛋白P-gp、LRP及自噬相关蛋白Beclin1,HMGB1基因的变化。     

Evaluation of the anti-neuraminidase activity of the traditional Chinese medicines and determination of the anti-influenza A virus effects of the neuraminidase inhibitory TCMs in vitro and in vivo

Etnopharmacological relevance

Neuraminidase (NA) inhibitors are currently the most effective drugs to treat influenza A viruses infection. Many traditional Chinese medicines (TCMs) have been used in the clinics to treat influenza. The anti-viral mechanisms of these TCMs and their inhibitory effects towards NA need to be systematically tested.

Aim of the study

To evaluate the anti-NA activity of the TCMs and the anti-influenza A virus effects of the NA inhibitory TCMs in vitro and in vivo.

Material and methods

We tested the inhibitory activity of water extracts from 439 TCMs towards NA. The in vitro anti-influenza virus activities of the 5 TCMs were evaluated using the strain A/California/7/2009 (H1N1) NYMC X-179A of influenza A virus. A randomly selected TCM with NA inhibitory activity, Melia toosendan extract, was further evaluated using a mouse model infected with influenza A virus.

Results

Five TCMs, Duchesnea indica (Andr.) Focke [Fragaria indica Andr.], Liquidambar formosana Hance., Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc., Melia toosendan Sieb. et Zucc., and Prunella vulgaris L., exerted potent inhibitory activity towards NA. These TCMs in the range of 25-250 μg/mL had the ability to reduce virus-induced cytopathic effect (CPE) and the virus yield in MDCK cells. Melia toosendan significantly reduced death rate and prolonged mean day to death (MDD) of the viral infected mice.

Conclusions

This study describes five TCMs exerted strong inhibitory activities towards NA, and exhibited antiviral effect against influenza A virus by reducing viral reproduction and reduced CPE of the viral infected cells. Melia toosendan, significantly reduced death rate and prolonged survival of the H1N1 viral infected mice.     

基于甲型H1N1流感病毒致MDCK细胞损伤保护作用的双黄连组方HPLC特征图谱谱效关系研究

构建双黄连组方HPLC特征图谱与甲型H1N1流感病毒致MDCK(Madin-Darby canine kidney)细胞损伤保护作用的相关性。在双黄连原方的基础上按正交法L₉(3⁴)组成9个不同配比的组方,分别进行HPLC分析和MDCK细胞损伤的保护作用试验,采用细胞病变效应法(cytopathic effect, CPE)观察病毒感染力,MTT染色结果作为浓度筛选和细胞损伤保护作用的判定指标。除组方1外,其他各组方对甲型H1N1流感病毒致MDCK细胞损伤均具有显著的保护作用(P<0.01,P<0.001),对所获得的HPLC数据和药效数据应用SPSS软件进行逐步回归分析,结果双黄连各组方17个特征共有色谱峰中与甲型H1N1流感病毒致MDCK细胞损伤的保护作用相关性较大的组分为2,3,6,8和12号峰。将组方数据与药效数据进行逐步回归分析,发现金银花、连翘与细胞损伤的保护作用呈正相关。通过HPLC图比对,2,3和12号峰来自金银花,而6和8号峰来自连翘。通过对照品保留时间进一步比较,确定了其中4个色谱峰分别为绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷B和3,4-二咖啡酰奎宁酸。推测双黄连组方中与甲型H1N1流感病毒致MDCK细胞损伤保护作用相关性较大的的主要成分为金银花和连翘中咖啡酰类衍生物。