大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立与优化

目的 建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型，并观察2-乙酰氨基芴（2-acetaminofluorene,AAF)剂量与模型动物肝卵圆细胞增殖程度间的关系。方法 选择体重150g左右的雄性Wistar大鼠，通过胃管灌喂AAF，每日1次，连续4d，第5日行三分之二肝切除（手术当日不灌喂AAF），第6日继续灌喂，连续1周。AAF剂量分别按2.5、5、10、20mg/kg给予，对照组给予生理盐水灌喂。各组手术后复隔2-3d分别取3只大鼠肝组织作常规组织学观察及免疫组织化学染色。结果 对照组大鼠肝组织内未见到肝卵圆细胞，2.5mg/kg剂量组及5mg/kg剂量组仅见少量肝卵圆细胞增生，而10、15、20mg/kg三个剂量组肝组织内均见明显的肝卵圆细胞增殖反应；肝卵圆细胞胞浆细胞角蛋白19（CK19）、OV6及波形蛋白染色均呈阳性，胞核增殖细胞抗源染色呈阳性。结论 AAF剂量为10-20mg/kg时可获得满意的大鼠肝卵圆细胞增殖模型。     

芪苈强心对心肌梗死后心力衰竭大鼠miRNA表达的调控作用

目的利用microRNA芯片杂交技术研究芪苈强心对心肌梗死后心力衰竭大鼠microRNA表达的调控作用,为进一步探索芪苈强心保护心脏功能的作用通路提供新的视角。方法通过结扎雄性SD大鼠左前降支建立急性心梗后心力衰竭模型,分为假手术组,心衰模型组和芪苈强心组,药物干预前后分别行超声心动图检查。治疗6周后处死动物、取材,行microRNA芯片杂交,筛选差异表达microRNA,实时荧光定量PCR验证芯片结果。对差异表达microRNA进行靶基因预测及进一步生物信息学分析。结果芪苈强心显著提高心衰大鼠左室射血分数(60.2±5.3%vs.36.5±5.9%,p0.01)。心衰模型组与假手术组比较,22个microRNA表达上调,5个下调;芪苈强心组与心衰模型组比较,2个microRNA表达上调,21个下调。实时荧光定量PCR结果与芯片筛查结果一致。对其中11个差异倍数较大的microRNA行靶基因预测,共1782个靶基因,显著富集于470个GO生物学过程条目、120个GO细胞组成条目和115个GO分子功能条目(p0.05);KEGG分析中,66条信号通路被有效富集(p0.05),包括趋化因子信号转导通路、凋亡信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等。结论在心梗后心力衰竭模型中,芪苈强心调控多个microRNA的表达,多靶点、多途径地发挥保护心脏、逆心肌重塑的作用。     

利用大鼠Y染色体特异性PCR技术检测卵圆细胞源性肝癌细胞

目的:利用Y染色体体细胞的特异性来寻找卵圆细胞分化为肝癌细胞的直接证据,从而为卵圆细胞源性的研究及临床肝癌治疗方法提供理论依据．方法:选择健康♂ Wistar大鼠30只饲喂每千克含0．6 g 3-甲基-4-二甲基偶氮苯(DAB)的饲料 4 wk,建立卵圆细胞增生的♂ Wistar大鼠动物模型．卵圆细胞的分离、提取和鉴定(光镜、电镜、免疫组化)．将实验用♀Wistar大鼠60只随机平分成对照组和实验组．对照组不接种细胞悬液,连续喂含DAB饲料14 wk．实验组按 25 mg／kg体重戊巴比妥腹腔麻醉,消毒开腹, 用吸取♂ Wistar大鼠卵圆细胞悬液,接种至肝脏包膜下,每点106个,之后连续喂含DAB饲料 14 wk,促进肝肿瘤的生成．从GenBank调出雄性大鼠的SRY基因,利用引物设计软件设计引物片断．14 wk后提取两组大鼠肝肿瘤组织的基因组DNA,利用所设计的引物进行PCR扩增,对PCR产物进行电泳分析．结果:光镜下可找到卵圆细胞,核仁小而清晰,胞质少,细胞体积较小,约为正常肝细胞的 1／3,直径约9-12 μm不等．电镜下观察可见细胞表面少量短而小的微绒毛突起,呈现未分化细胞的形态．免疫组化观察肝卵圆细胞胞质 c-kit染色呈棕黄色阳性信号．14 wk后对照组和实验组共计60只大鼠均见肝脏肿瘤生成,肿瘤组织在外观上和性状上无显著性差异．实验组电泳后见与设计片断长度相符的电泳阳性条带．结论:大鼠的卵圆细胞可以分化为肝癌细胞．为卵圆细胞源性肝癌细胞的假说提供实验依据．     

IFN-γRα、ICAM-1在大鼠肝卵圆细胞增殖模型中的表达及其意义

目的 探讨γ干扰素受体α(interforon gamma receptor alpha IFN-γRα)及细胞间黏附分子I(intercelluar adhesion moleeule I.ICAM-1)在大鼠肝卵圆细胞增殖模型中的表达情况及其生物学意义。 方法 采用二乙酰氨基笏(2-acetaminofluorene AAF)加三分之二肝切建立大鼠肝卵圆细胞增殖的模型,并以大鼠单纯三分之二肝切后的再生肝纠织、单纯灌AAF4天后的肝组织及正常大鼠肝细胞作对照,采用RT-PCR检测IPN-γRα、ICAM-1及甲胎蛋白(alpha-fetoprotein AFP)mRNA在模型组及对照组肝组织中的表达情况。结果 AFP,IFN-γRα及ICAM-1mRNA 表达水平在模型组肝切后4天及9天明显上调,AFP在肝切后9天、IFN-γRa及ICAM-1在肝切后4天的表达均显著高于对照组(P<0.05),在肝切后20天复常。结论 AFN-γRα和ICAM-1mRNA的高表达与肝卵圆细胞的增殖及分化过程密切相关。     

小鼠感染肝毛细线虫肝脏microRNA的差异表达分析

目的 分析小鼠感染肝毛细线虫后肝脏microRNA (miRNA)的表达谱,筛选差异表达miRNA,为肝毛细线虫感染致肝纤维化机制研究提供资料。方法 6只雄性BABL/c小鼠随机分为肝毛细线虫感染组和对照组,每组3只。感染组小鼠经灌胃感染肝毛细线虫感染期虫卵（20个卵/鼠）,对照组灌胃等量生理盐水。感染后35 d分别取感染组和对照组小鼠的肝组织,进行组织切片、苏木精-伊红（HE）染色后,镜下观察肝组织病变情况。提取和纯化小鼠肝组织总RNA进行文库构建和miRNA高通量测序。通过生物信息学分析筛选差异表达的mi RNA,预测其靶基因并进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对部分差异表达miRNA进行验证分析。结果 肝组织切片的HE染色结果显示,感染组小鼠肝组织呈虫卵肉芽肿性病变,伴有明显的炎性细胞浸润;对照组肝细胞形态完整,未见炎性细胞浸润、变性坏死和纤维化。通过miRNA测序,筛选出差异表达的miRNA共16条,4条表达上调,且均上调2倍以上,其中mmu-miR-129-5p上调4倍以上;12条表达下调,均下调0...     

肥大心肌细胞来源外泌体差异表达microRNA及其信号通路调节的初步研究

目的获得肥大心肌细胞来源外泌体与正常心肌细胞来源外泌体差异表达microRNA,并进行靶基因和信号通路分析,探讨差异表达microRNA调控心肌肥大的分子机制。方法取1~3天龄Wistar新生鼠心脏行原代心肌细胞培养,并分成两组,模型组用AngⅡ(1μmol/L)诱导心肌细胞肥大,对照组细胞未给予任何处理或加入培养液,分离纯化上述两组细胞外泌体,采用microRNA测序技术筛选差异表达microRNA,通过miRanda算法分析差异表达microRNA靶基因,并行KEGG pathway分析。结果与对照组比较,肥大心肌细胞来源外泌体有14个差异表达microRNA,其中13个microRNA上调(包括mmu-miR-2137、mmu-miR-5126、mmu-miR-690和10个新发现的microRNA),1个microRNA下调(P0.05)。通过miRanda算法得到差异表达microRNA的靶基因54条,采用排序前20的靶标基因及其相关microRNA构建局部网络图。经KEGG通路分析发现,差异表达microRNA参与了MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、Wnt信号通路等的调节。结论肥大心肌细胞来源外泌体microRNA表达谱发生明显变化,并经靶基因调节MAPK等多种信号通路,进而影响心肌肥大的病理生理过程。     

大鼠肝卵圆样细胞恶性转化过程中的基因表达谱分析

目的 分析肝卵圆细胞恶性转化过程中基因表达谱的改变,探讨差异基因的意义.方法 经直接致癌剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍启动的大鼠肝卵圆细胞样WB-F344暴露于过氧化氢,每周1次,重复21次诱发其恶性转化.通过形态学、遗传学和软琼脂克隆形成等实验验证细胞的转化.并应用四甲基偶氮唑盐法检测转化细胞的增殖能力.采用大鼠癌通路发现者功能芯片比较恶性转化过程中正常对照(WB),WB-5(过氧化氢刺激5次),WB-21(过氧化氢刺激21次)3组细胞基因表达的差异. 结果 转化的细胞获得了异倍体核型,具有非停泊依赖生长特性.电镜下转化细胞的细胞器增多,出现缝隙连接和微绒毛等结构.基因表达谱分析显示共有21个基因差异表达,主要参与调节细胞增殖、凋亡、细胞黏附运动等,其中连续上调的有pten,连续下调的有cdknla,而先上调再下调的基因有myc、fos、casp-8等. 结论细胞增殖和凋亡的异常在卵圆细胞恶性转化过程中起重要作用,而cdknla、pten、myc、fos等基因可能是起关键作用的分子.     

大鼠肝卵圆细胞增殖过程中基质细胞衍生因子-1及其受体CXCR4的表达

近年来,有研究表明基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)和其受体CXCR4(SDF-1/CXCR4)轴在干细胞的增殖分化中起至关重要的作用[1].本研究采用2-乙酰氨基芴联合部分肝脏切除术(AAF/PH)成功诱导肝卵圆细胞增殖,同时给AAF/PH模型大鼠注射CXCR4特异性抑制剂AMD3100,通过检测SDF 1和其受体CXCR4在卵圆细胞增殖过程中表达的变化情况,进一步研究SDF-1/CXCR4轴在肝卵圆细胞增殖过程中的作用.     

microRNA在肥胖大鼠脂肪组织中的差异表达

目的建立高脂饮食诱导的大鼠肥胖模型,初步探讨肥胖大鼠脂肪细胞、体质量、体长、血糖、血脂的变化,为进一步研究microRNA在肥胖诱发脂类代谢紊乱的相关分子机制奠定基础。方法将40只雄性SD大鼠随机分为普通饮食组和高脂饮食组,分别以基础饲料和高脂饲料喂养,尾静脉采血检测造模前及4周、8周的血糖、血脂水平,8周时眼眶放血处死大鼠;用动物电子秤称量大鼠体重;留取大鼠网膜脂肪组织,用皿式电子分析天平称重,并将其保存在-80℃液氮中备用,油红染色光学显微镜观察脂肪组织形态,采用微距阵基因芯片技术筛选肥胖大鼠模型的网膜脂肪组织差异表达的microRNA,Real-Time PCR验证结果。结果建模8周末,高脂饮食组大鼠体重、网膜组织重量、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白均高于普通饮食组(P0.01),高密度脂蛋白低于普通饮食组(P0.01)。基因芯片检测并经Real-TimePCR验证发现,高脂饮食组大鼠网膜组织中有13个差异表达的microRNA,其中microRNA30a、microRNA7e、microRNA30c、microRNA335、microRNA103、microRNA107、microRNA139-5p表达上调,microRNA494、microRNA140、microRNA342-5p、microRNA382、microRNA17-1-3p、microRNA92a表达下调。生物信息学分析发现,差异表达的microRNA调控的靶基因与细胞增殖、凋亡、糖代谢及调节脂肪细胞分化和脂类代谢生物学功能相关。结论高脂诱导的肥胖模型大鼠网膜组织中microRNA表达谱发生明显改变,提示microRNA能够调节脂肪细胞分化和脂类代谢。     

大鼠肝卵圆细胞的分离培养及脾内移植研究

目的 观察肝卵圆细胞在同种异体大鼠脾内移植的演变结果,为肝干细胞移植治疗临床肝功能衰竭提供实验依据。方法 采用改进的梯度离心法分离肝卵圆细胞,体外培养鉴定后移植入2/3肝切除的同种异体大鼠脾脏内。结果 每只模型大鼠肝脏中可分离获得约1.69×10~5/ml肝卵圆细胞。体外培养的肝卵圆细胞呈现上皮细胞的生长特点,对OV6、细胞角蛋白19及甲胎蛋白染色呈阳性反应,对白细胞共同抗原染色呈阴性反应。肝卵圆细胞植入异体大鼠脾脏内可形成岛屿状肝组织结构,形成“肝化脾”。结论 大鼠肝卵圆细胞具有肝干细胞的生物学特征,在一定条件下可分化为肝细胞及胆管上皮细胞。