靶向Arnt的RNAi慢病毒载体的构建及其在HCCLM6中对Arnt基因表达的影响

目的：构建并鉴定Arnt基因特异性RNAi慢病毒载体，将其导入HCCLM6肝癌细胞中，筛选有效抑制ARNT表达的稳定细胞株。方法：针对已经筛选确定的Arnt基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pLVTHM载体连接[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]产生LV-shArnt慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。用LV—shArnt载体，pCMV—dR8．74载体，pMD2G载体三质粒共转染包装细胞293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白表达水平测定病毒滴度，挑选细胞克隆，收获病毒上清，将病毒上清转染HCCLM6中，经过GFP筛选得到稳定抑制Arnt表达的HCCLM6细胞株，通过RT—PCR鉴定抑制Arnt表达的效果。结果：双酶切与测序鉴定证实成功构建了ArntshRNA的慢病毒载体，转染包装病毒细胞株获得的病毒上清成功转染了HCCLM6，并且抑制了Arnt的表达。结论：运用pLVTHM载体构建的LV—shArnt慢病毒载体可有效抑制Arnt在肝癌细胞株HCCLM6中的表达，为观察转染shRNA慢病毒表达载体的肿瘤细胞的恶性生物学行为变化奠定了实验基础。     

慢病毒载体在RNA干扰中的应用进展

小分子RNA干扰技术是一种新兴的特异性地阻断某些基因表达的研究手段,在肿瘤、病毒感染,遗传病及其它疾病的治疗中均有广泛应用。慢病毒载体是一类来源于重组逆转录病毒的载体,由于具有可以感染非分裂期与分裂期细胞,容纳大的外源性目的基因片段,免疫反应小等特点,现已成为转移目的基因进入哺乳动物细胞的理想载体。将慢病毒载体应用于RNA干扰当中,可以特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达,成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。本文将试图对近期慢病毒载体在RNA干扰当中的应用的最新进展进行综述。     

ALRsiRNA慢病毒载体最佳干扰序列的筛选及构建

目的筛选并构建肝再生增强因子(ALR)基因的最佳RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体,为研究ALR基因表达下调后对肝癌细胞生物学特性的影响提供依据。方法针对ALR基因序列设计并合成4个siRNA靶点,酶切连接GV118-GFP载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定;在包含ALR基因的质粒中以PCR法扩增出ALR基因,克隆至慢病毒载体GV143,构建ALR基因的过表达质粒,将RNAi重组慢病毒载体和ALR的基因表达质粒共转染293T细胞,用western blot检测其对目的基因ALR的敲减效率。结果酶切鉴定证实成功构建了ALR RNAi慢病毒载体及ALR基因过表达载体。不同浓度干扰质粒(0.4μg和0.8μg)的western blot结果显示,相较于阴性对照组,KD1组ALR蛋白的表达水平(0.51±0.02,0.36±0.09)、KD2组ALR蛋白的表达水平(0.65±0.04,0.49±0.02)、KD3组ALR蛋白的表达水平(0.62±0.07,0.52±0.02)均降低(P均0.05),而以KD1组蛋白表达量最低。结论成功筛选并构建了能有效沉默ALR基因的最佳RNAi重组慢病毒载体,为后续实验奠定基础。     

慢病毒载体介导CD55基因抑制对BxPC-3细胞生长的影响

目的:探讨CD55基因对胰腺癌BxPC-3细胞生长的影响。方法:用CD55-RNAi-LV转染BxPC-3细胞后以流式细胞术检测其对细胞凋亡、增殖、周期的影响。结果:CD55-RNAi-LV转染BxPC-3细胞后,与对照细胞相比,细胞凋亡率增高至(33.84±1.09)%(P<0.05);细胞增殖率降低至(30.06±0.97)%(P<0.05),细胞停滞于G1期为(65.41±3.59)%(P<0.05)。结论:胰腺肿瘤细胞系BxPC-3细胞中CD55基因表达可能对其生长有调控作用,有望成为胰腺癌治疗新靶点。     

Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。针对已经筛选确定的kff2ds4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体，应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用LV-shkir2ds4，包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞，产生慢病毒颗粒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果表明，PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒载体LV-shkir2ds4。293T细胞测定病毒滴度为6×10^8TU／ml。结论：成功地构建了人kff2ds4基因RNAi慢病喜载体．     

慢病毒载体及其在RNA干扰技术中的应用与发展

慢病毒载体是一类逆转录病毒载体,以其转染效率高,可感染分裂期和非分裂期细胞,可容纳较大的基因片段等优点,现已被作为转移目的基因的理想载体。而RNA干扰技术是近年来迅速发展起来可以特异性地剔除特定基因或者抑制特定基因表达的一种新技术,在病毒感染、心血管疾病、肿瘤等疾病的治疗中被广泛应用。通过慢病毒载体与RNA干扰技术的结合应用,有望为特定基因的功能以及相关疾病的治疗研究提供新的手段和方法。     

SIRT1基因shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测

背景:SIRT1基因在细胞能量代谢、凋亡及衰老过程中发挥极重要的作用,另有研究发现SIRT1可能在炎症反应方面起着调控作用。目的:构建SIRT1特异性的shRNA慢病毒载体,并初步检测其对THP-1细胞SIRT1基因的抑制效应。方法:设计SIRT1靶点特异性的寡核苷酸序列,连接到经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒,再转染THP-1细胞,通过实时荧光定量PCR实验及WesternBlot检测对SIRT1靶基因的抑制情况。结果与结论:阳性克隆PCR及测序证实SIRT1基因shRNA慢病毒载体构建成功,实时荧光定量PCR及Western Blot检测该载体在mRNA和蛋白水平能抑制THP-1细胞的SIRT1表达。     

人GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体的构建及鉴定

目的 构建人GLIPR-2基因慢病毒RNA干扰（RNAi）载体,并鉴定其感染人肝癌细胞系HepG2后缺氧条件下的GLIPR-2基因表达变化.方法 根据GLIPR-2基因序列合成siRNA片段,克隆至慢病毒载体pMAGic7.1上,转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒.感染HepG2细胞,流式细胞术检测GFP的表达率,并用Western blot检测目的 蛋白在缺氧条件下的表达变化.结果 重组RNAi质粒pMAGic7.1-shRNA-GLIPR-2经菌落PCR鉴定及测序证实构建正确;稳定感染HepG2 细胞后,GFP的表达率为分别为84.48%、69.97% 和39.82%;Western blot结果显示慢病毒转染组GLIPR-2蛋白的表达水平较对照组明显降低.结论成功构建了GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体,该载体在缺氧条件下可明显抑制目的 蛋白在HepG2细胞中表达,为进一步研究GLIPR-2的生物学功能奠定了基础.     

慢病毒载体介导survivin基因siRNA对裸鼠移植人肺腺癌的体内抗癌机制研究

目的探讨慢病毒载体介导survivin基因小片段干扰RNA(siRNA)对裸鼠移植人肺腺癌的体内抑瘤活性。方法制备表达survivin-siRNA的慢病毒载体,构建裸鼠移植人肺腺癌模型,将裸鼠分为空白组(PC组)、空白载体组(NC组)、实验组(RNAi组)3组,分别给予生理盐水、空白病毒载体和siRNA;siRNA组肿瘤组织局部注射表达survivin-siRNA的慢病毒载体,观察肿瘤体积及其随时间的生长变化曲线;分别采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法检测各组裸鼠肿瘤组织中survivin基因的信史RNA(mRNA)及其表达的蛋白水平变化;采用流式细胞术检测肿瘤细胞周期组方图变化。结果慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠肺腺癌的抑瘤率为46.07%;siRNA组瘤重与NC组和PC组比较,差异有统计学意义(P0.05),而NC组与PC组瘤重比较差异无统计学意义(P0.05);siRNA组survivin基因mRNA及蛋白表达较NC组和PC组明显降低,抑制率分别为72.00%、53.00%;G1期细胞百分比明显增加,S期细胞百分比则明显减少。结论慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌survivin基因的表达,有效激发细胞凋亡。     

沉默GPC3对肝癌Huh-7细胞增生、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨Hippo通路靶向GPC3后对肝癌Huh-7细胞增生、迁移、侵袭能力的影响。方法采用Western blot检测法及RT-PCR分别测量肝癌Huh-7不同对数生长期的肝癌细胞株GPC3蛋白表达水平及GPC3 mRNA水平,并筛选出可有效沉默GPC3基因的siRNA。将肝癌Huh-7细胞株分为实验组、未转染组及对照组,实验组导入GPC3-siRNA-1633转染Huh-7,其余两组不作处理。EdU实验检查三组细胞增殖率,划痕实验测定各组细胞迁移率,Transwell实验测定各组细胞侵袭能力。结果实验组GPC3 mRNA表达量及GPC3蛋白水平显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组Hippo通路中YAP mRNA表达量显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。转染48 h后,实验组细胞增生率、迁移率及侵袭率显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GPC3可促进肝癌Huh-7细胞增殖、侵袭及转移,从而促进肝癌细胞生长。CPG3可通过上调Hippo通路中YAP表达水平从而促进肝癌细胞增生。通过沉默GPC3 mRNA后可有效抑制肝癌Huh-7细胞生长。     

Annexin A7 and its binding protein galectin-3 influence mouse hepatocellular carcinoma cell line in vitro

Lymph node metastasis is recognized as an important mode of liver cancer metastasis. Our previous study has built two hepatocarcinoma cell lines, Hca-F with high (75%) and Hca-P with low (25%) incidences of lymph node metastasis, and has indicated that annexin A7 is an important factor in the lymphatic metastasis of tumors. There is evidence that galectin-3 is the binding protein of annexin A7 and works in protein complexes. Our current study shows that both annexin A7 and galectin-3 express higher in Hca-F than Hca-P. Annexin A7 was successfully down-regulated in Hca-P by RNA interference, and this resulted in concomitant reduction of galactin 3 expression in annexin A7 down regulated compared to the control and N-control cells. Using CCK-8 assay, the expression level of annexin A7 and galectin-3 were found to have correlation with the proliferation ability; Transwell assay showed annexin A7 and galectin-3 are involved in cell migration and invasion regulation in mouse hepatocellular carcinoma cell lines, immunofluorescence assay indicate annexin A7 and galectin-3 were co-located annexin A7 and galectin-3 played roles in DNA damage and cell proliferation cycle checkpoint arrest pathway. Those phenomena indicated that annexin A7 influences lymphatic metastasis of tumors by interacting with galectin-3 through the regulation of tumor cell proliferation, attachment, migration and invasion.     

壳聚糖及其衍生物对肝癌细胞SMMC7721生长的抑制作用

背景：壳聚糖的不同衍生物、不同的分子质量和脱乙酰度对抗肿瘤的作用有所不同。 目的：观察水溶性壳聚糖及其3种衍生物磺化壳聚糖、羧甲基壳聚糖、壳寡糖对肝癌细胞株SMMC7721生长的抑制作用。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2004—01／2006—12在江西省消化疾病研究所完成。 材料：肝癌细胞株SMMC7721由江西省消化疾病研究所传代培养。85．5％脱乙酰度壳寡糖和85％脱乙酰度水溶性壳聚糖为济南海得贝海洋生物工程有限公司产品；88.5％脱乙酰度壳聚糖和羧甲基壳聚糖为上海其胜生物制品有限公司产品。方法：①磺化壳聚糖的制备和鉴定：88．5％脱乙酰度壳聚糖与氯磺酸-甲酰胺磺化试剂制得磺化壳聚糖。由华东理工大学分析测试中心采用红外光谱分析检测。②MTT试验：将对数生长期的SMMC7721肝癌细胞株接种于96孔细胞培养板中，分别加入6个质量浓度（25，50，100，200，400，800mg／L）的水溶性壳聚糖、磺化壳聚糖、羧甲基壳聚糖和壳寡糖，并设空白对照组。常规培养72h后，加MTT溶液，孵育4h后终止培养，加二甲基亚砜，酶标仪测490nm波长A值。重复3次试验，取均值，计算抑制率。 主要观察指标：不同质量浓度壳聚糖及其衍生物对肝癌细胞的生长抑制率。结果：在4种不同壳聚糖及其衍生物中，水溶性壳聚糖和磺化壳聚糖可显著抑制肝癌细胞的生长（P〈0.001），其中以磺化壳聚糖最为显著，二者在质量浓度为50mg／L时就可抑制肝癌细胞的生长，并呈剂量依赖关系，在400mg／L和800mg／L时达到高峰。羧甲基壳聚糖和壳寡糖对肝癌细胞无生长抑制作用（P〉0．05）。 结论：水溶性壳聚糖和磺化壳聚糖对肝癌细胞具有显著的生长抑制作用，羧甲基壳聚糖和壳寡糖对肝癌细胞无生长抑制作用。     

MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡，增殖及细胞周期的影响

目的探讨沉默MYCT-1基因对GES-1细胞凋亡、细胞周期及细胞增殖的影响。方法采用siRNA转染GES-1细胞后分别应用AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测siRNA对细胞增殖的作用。结果siRNA转染GES-1细胞后,与对照细胞相比,细胞凋亡率明显增高（P〈0．05）;细胞增殖率降低（P〈0．05）,细胞周期检测表明细胞停滞于S期（P〈0．05）。结论MYCT-1基因维持一定的表达水平对于正常细胞生长调控是必需的,MYCT-1基因对细胞周期的调控主要体现在S期向G1期的转变过程。     

原发性肝癌GPC3基因异常表达和相关miRNA与lncRNA预测

目的分析GPC3对原发性肝细胞癌(HCC)的诊断价值,并预测其非编码RNA调控机制。方法用组织芯片和免疫组化方法检测GPC3蛋白表达,并用在线工具和TCGA数据库分析、预测GPC3相关的mi RNA和lnc RNA。结果 HCC中GPC3 m RNA和蛋白表达均高于癌旁组织,且和HCC肿瘤病理分级相关,GPC3蛋白表达和患者临床分期相关。预测到和GPC3存在调控关系的mi RNA 10个、lnc RNA 2个。结论 GPC3 m RNA和蛋白可作为HCC的诊断标志物,预测到与GPC3相互作用的非编码RNA。     

MK基因特异性siRNA对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术抑制Midkine对人乳腺癌癌细胞株MCF-7细胞凋亡的影响。方法人工合成抑制Midkine基因的siRNA片段,通过脂质体转染到MCF-7细胞内,应用RT-PCR检测bcl-2mRNA表达,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化,通过测定光密度值检测Caspase-3活性。结果转染siRNA后的MCF-7细胞,bcl-2mRNA表达显著下降、细胞线粒体膜电位明显下降和Caspase-3酶活性升高。结论MK-siRNA通过下调hcl-2基因,而改变细胞线粒体膜电位使Caspase-3酶活性升高诱导细胞的凋亡。     

Potential impact of curcumin and taurine on human hepatoma cells using Huh-7 cell line

ObjectivesThis study aimed at exploring the role of curcumin and taurine alone or in combination against cultured human hepatoma cells (Huh-7 cells).Design and methodsHuh-7 cells were plated and treated with various concentrations of curcumin and/or taurine. Hemocytometer cell count, cell viability, quantification of γ-IFN concentrations, and flow cytometric analyses for CD4, CD8, and CD25 were carried out.ResultsThere were significant increases in the levels of cell density, γ-IFN, and CD8, accompanied with significant decrease in the level of CD4, when comparing cultured cells treated with curcumin and taurine with control cultured cells.ConclusionCurcumin/taurine in combination formula is better treatment than single therapy, with respect to cell density and γ-IFN. Moreover, curcumin/taurine combined therapy enhances immunity by stimulating the CD4⁺ T-helper cells with consequent induction of CD8 T-cell responses to lyse tumor cells.     

靶向c-myc基因的siRNA基因干扰对大肠癌Lovo细胞增殖与凋亡的影响

目的 阐述靶向c-myc基因的siRNA基因转染干扰对大肠癌Lovo细胞增殖与凋亡的影响作用. 方法 将靶向c-myc基因的siRNA片段转染入大肠癌Lovo细胞,特异沉默c-myc基因,通过实时荧光定量PCR法检测c-myc mRNA表达水平,原位末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferasedUTP nick end labeling,TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡情况及噻唑蓝法[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]检测细胞的增殖能力. 结果 经过转染的Lovo细胞组与未转染的对照组c-myc mRNA表达量比率为0.22:1,c-myc mRNA表达量比例有统计学差异(P＜0.05).经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组的凋亡指数分别为32.4％与65.4％,具有显著性统计学差异(P＜0.01).MTT检测经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组的细胞增值率,分别为79.28％与38.32％,具有极其显著性统计学差异(P＜0.001). 结论 将靶向c-myc基因的siRNA片段转染入大肠癌Lovo细胞,特异沉默c-myc基因,从而证实c-myc抑制大肠癌细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用,从而为大肠癌的基因治疗寻求更多的治疗靶点.     

Bmi-1 shRNA慢病毒表达载体的构建及稳转U266细胞株的建立

本研究构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立U266-li稳定细胞株,为下一步Bmi-1的功能研究及应用RNAi技术治疗打下基础。设计、合成1对针对Bmi-1 mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染U266细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Western blot技术分别检测U266稳定细胞中Bmi-1及P14 mRNA和蛋白水平的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,病毒滴度为5×107 TU/ml;建立稳定转染的U266细胞株。有效干扰验证显示,shBmi-1能明显降低Bmi-1的mRNA及蛋白水平,而P14的mRNA及蛋白水平则都上调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定干扰Bmi-1表达的U266细胞株。     

导入针对survivin基因的siRNA对大肠癌Lovo细胞凋亡和增殖的影响

目的：向大肠癌离体LOVO细胞中导入针对survivin基因的siRNA，并研究其对LOVO细胞凋亡的影响。方法：设计2条特异性针对survivin基因的siRNA，并体外转录法合成，利用脂质体导入LOVO细胞并检测转染后细胞的凋亡和增殖情况。结果：RTPCR检测survivin mRNA表达水平发现两RNA干扰组细胞内survivin mRNA表达量明显低于正常LOVO细胞；细胞凋亡检测结果发现两干扰组细胞凋亡率分别为21、5％和26、28％明显高于正常Lovo细胞；细胞增殖结果显示：两干扰组细胞增殖能力比正常Lovo细胞减弱。结论：针对survivin基因的siRNA能有效降低目的基因的mRNA表达，抑制LOVO细胞生长，细胞凋亡率明显增高。为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据。