DNA条形码序列对9种蒿属药用植物的鉴定

目的采用DNA条形码序列对9种常见的蒿属药用植物进行鉴定,为常见蒿属药用植物的鉴定提供分子依据。方法对9种常见蒿属药用植物的4条候选DNA条形码序列(ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH)进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增和测序效率,应用BLAST1、Distance方法来评估各序列的鉴定效率。此外,基于MEGA5分析9种常见蒿属药用植物ITS2序列种间K2P遗传距离并构建NJ树。结果除matK外,其余3条片段的PCR扩增和测序效率均为100%,ITS2序列对9种蒿属药用植物的物种水平鉴定成功率最高,为100%,而psbA-trnH、rbcL、matK、matK+rbcL的鉴定成功率(BLAST1法)分别为83.3%、66.7%、54.5%、75%。通过ITS2序列的种间K2P遗传距离及NJ树均能将不同物种全部区分。结论 ITS2序列可以作为鉴定蒿属药用植物的潜在条形码。     

应用ITS2序列鉴定垂盆草及其混伪品△

目的：通过对药食同源植物垂盆草及其混伪品进行分子鉴定,以保证该植物的临床药效及食用安全。方法：通过对样品DNA进行PCR扩增,获得ITS2基因片段,纯化后的PCR产物进行双向测序,运用CodonCode Aligner进行序列的拼接、MEGA5.0软件进行序列分析并构建K2P模型的NJ树。结果：垂盆草与其混淆品ITS2序列间存在明显变异,种内遗传距离小于种间遗传距离,从NJ树中可以明显看出不同来源垂盆草聚为一支,与混伪品可以很好地区分。结论：ITS2序列可有效地鉴别药用植物垂盆草及其混淆品,对中药鉴定具有潜在的应用价值。     

基于ITS2序列鉴定苗药金铁锁及其混伪品

目的：本研究利用ITS2序列对苗药金铁锁及其混伪品进行鉴定研究,从而确保药材质量,保障临床用药安全。方法：提取金铁锁药材及其混伪品基因组DNA,PCR扩增并双向测序获得ITS2序列。所有序列经过CodonCode Aligner V3.7.1拼接后,采用MEGA5.1软件进行序列比对,计算种内和种间Kimura2-Parameter（K2P）遗传距离,并构建系统发育树。采用相似性搜索法、最近距离法、邻接（NJ）树法对ITS2序列鉴定能力进行评估。结果：金铁锁药材的ITS2序列长度为229 bp,其ITS2序列种内最大K2P遗传距离小于与混伪品的最小种间K2P遗传距离;应用相似性搜索法表明ITS2序列能够准确鉴定金铁锁药材及其混伪品;基于ITS2序列构建NJ树,金铁锁及其混伪品均表现出良好单系性,均能明显区分。结论：ITS2序列能够稳定、准确地鉴定金铁锁药材及其混伪品,DNA 条形码技术可为金铁锁药材及其混伪品的鉴定提供新的方法。     

应用ITS2序列鉴定垂盆草及其混伪品

目的：通过对药食同源植物垂盆草及其混伪品进行分子鉴定,以保证该植物的临床药效及食用安全。方法：通过对样品DNA进行PCR扩增,获得ITS2基因片段,纯化后的PCR产物进行双向测序,运用CodonCode Aligner进行序列的拼接、MEGA5．0软件进行序列分析并构建K2P模型的NJ树。结果：垂盆草与其混淆品ITS2序列间存在明显变异,种内遗传距离小于种间遗传距离,从NJ树中可以明显看出不同来源垂盆草聚为一支,与混伪品可以很好地区分。结论：ITS2序列可有效地鉴别药用植物垂盆草及其混淆品,对中药鉴定具有潜在的应用价值。     

基于DNA条形码技术的俄罗斯特色药用植物资源调查

目的:调查俄罗斯高加索、阿尔泰野外地区药用植物的分布现状,明确该地区药用植物的种类、功效信息,深入挖掘一带一路沿线国家地区的药用植物新资源、新功效。方法:在野外搜寻并采集药用植物制成蜡叶标本运回国,提取腊叶标本的植物总DNA,使用内转录间隔区(ITS)序列通用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,PCR产物送双向测序,测序结果经软件进行拼接,根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库BLAST所获相似度最高物种的同属ITS序列,经DNAman软件对待鉴定物种的ITS序列和同属ITS序列进行相似度分析,利用MEGA 7软件作进化树,采用Kimura-2参数遗传距离,采用邻接法构建邻接法(NJ)系统树,发育树各分支的置信度用自举检验法检验,共进行2 000次循环,根据聚类结果进行鉴定。在此基础上对俄罗斯高加索、阿勒泰野外地区的重点药用植物进行归纳与分析。结果:经过NCBI数据库BLAST比对,各标本ITS序列与NCBI数据库上登录序列聚为一支,与外类群明显分开,结合植物标本性状特征,确定了待鉴定标本的种属分类。该次野外收集的标本中共鉴定出51种植物,覆盖17科44属,有明确功效记载的植物共有29种。查阅俄罗斯联邦国家药品目录和《中国药典》,分析国内常用药用植物,总结出20种中俄常见药材其在当地具有不同药用功效。该研究对扩大中药用药范围和临床经验具有重要的借鉴意义,也为当地加强物种保护和开发利用野生药用植物资源提供了依据。     

应用DNA条形码技术鉴定中药材灯心草

目的:应用植物类药材通用条形码ITS2鉴定中药材灯心草。方法:对灯心草药材及其密切相关种进行PCR扩增和测序,运用CodonCode Aligner对所获ITS2序列进行拼接。应用MEGA5.0软件计算Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离。采用相似性搜索法、最近距离法、PWG距离法及构建NJ(邻接)系统聚类树等方法进行鉴定分析。结果:灯心草药材种内K2P遗传距离在0～0.005,远远小于灯心草与其他密切相关种之间的K2P遗传距离(0.215～0.614);4种鉴定方法均表明ITS2序列可以有效区分灯心草与其密切相关种。结论:植物类药材通用条形码ITS2适用于鉴定中药材灯心草,进一步证明了ITS2对中药材的鉴定能力。     

Identification of medicinal vines by ITS2 using complementary discrimination methods

Ethnopharmacological relevance

Medicinal vines listed in Chinese pharmacopoeia possess important medicinal efficacy in traditional Chinese medicines.

Aim of the study

The ITS2 region, which has several characteristics that make it a valuable DNA barcode, was studied to discriminate the stems of medicinal vines to confirm their identities and ensure their safe application in pharmaceuticals by using complementary discrimination methods.

Materials and methods

Complementary discrimination methods were performed on two datasets, including 393 samples of 170 species from 22 genera 13 families, which belonged to medicinal vines and their adulterants. Based on the primary ITS2 sequences, three main discrimination methods (phylogenetic tree, the nearest distance, and BLAST 1) were adopted to identify species. Moreover, we applied both two-dimensional (2-D) and three-dimensional (3-D) structures of ITS2 to differentiate species.

Results

ITS2 performed well, with over 95.0% of species and 100% of genera being correctly differentiated for the two datasets. All results showed that the ITS2 region unveiled a remarkable ability to identify closely related species within different families and genera.

Conclusion

Our findings supported that the ITS2 region was an efficient marker for authentication of medicinal vines.     

白头翁属药用植物及药材鉴别研究

目的：本研究对白头翁、朝鲜白头翁、兴安白头翁3种药用植物及药材进行了形态分类和ITS2序列分子鉴别研究,为建立其分子鉴定方法提供有力依据。方法：通过对长白山区白头翁属3种药用植物进行野外实地考察采样,形态分类描述及提取样品总DNA,扩增ITS2序列、双向测序。所得序列经CodonCode Aligner拼接、比对,采用MEGA 6.0软件对样品进行变异位点分析、计算种内和种间遗传距离（K2P）并构建邻接树（NJ）。结果：形态鉴别容易区分白头翁与朝鲜白头翁和兴安白头翁,但朝鲜白头翁和兴安白头翁不易区分,ITS2序列片段长度均为219bp,3种药用植物的药材ITS2序列与其基原植物序列一致,种间变异位点有6个,遗传距离显示物种种内最大K2P距离远远小于种间最小K2P距离,NJ树结果显示,白头翁、朝鲜白头翁、兴安白头翁均可明显区分。结论：ITS2序列能够准确鉴定白头翁属3种药用植物的药材和基原植物,可作为形态鉴别的有力补充。     

基于DNA条形码技术的中药材木通种子鉴定研究

目的:利用核糖体内部转录间隔区2(ITS2)及叶绿体psbA-trnH序列对中药材木通种子进行鉴定,建立其种子DNA条形码鉴定方法,保障中药材木通种子的准确性。方法:收集木通种子样品15份,通过提取DNA、聚合酶链式反应(PCR)扩增、双向测序,获取其ITS2及psbA-trnH序列。基于BLAST分析、邻接(NJ)系统发育树构建进行物种鉴定分析。结果:共获得4种类型ITS2序列,2种类型psbA-trnH序列。ITS2及psbA-trnH均可区分木通与川木通、关木通,但ITS2序列可以区分木通与三叶木通、白木通,psbA-trnH序列无法区分木通与三叶木通、白木通。结论:DNA条形码技术可用于木通种子及其易混伪品的鉴定。     

芡实及其近缘种药材ITS2条形码鉴定研究

目的:应用ITS2条形码鉴定芡实及其近缘种药材。方法:提取20份芡实及其近缘种药材样品基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并双向测序,测序后用Sequin 12.3提交至GenBank;从GenBank上下载所有芡实及其近缘种30种102条ITS2序列;对提交与下载的122条序列,应用MEGA5.1软件进行序列比对,计算种内和种间距离,采用相似性搜索法、最近距离法进行鉴定分析,并构建NJ系统进化树直观反映鉴定结果。结果:芡实药材ITS2序列长度均为214 bp,为1个单倍型,与其近缘种之间遗传距离较远,NJ树结果显示芡实及其近缘种药材可明显区分开,表现出良好的单系性。结论:ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确地鉴别芡实药材,为保障临床安全用药提供了新的技术手段,为拓宽DNA条形码技术在中药鉴定中的应用进行了新的探索。     

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??OBJECTIVE To identify 93 samples of Ilex asprella(Hook. et Arn.) Champ. ex Benth. and its related species based on ITS2 barcode. METHODS The total genomic DNAs were extracted and the ITS2 regions were amplified and sequenced. The genetic distances were computed using MEGA5.0 in accordance with the Kimura 2-parameter (K2P) model. The neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree and BLAST method were used to assess the efficiency of sequence identification. RESULTS The length of ITS2 sequence of I. asprella was 241 bp and the average GC content was 63.4%. The intra-specific genetic distances of I. asprella were 0-0.030 and the minimum inter-specific of I. asprella and its closely related species was 0.043. Furthermore, I.asprella formed into a single branch with high bootstrap value in NJ tree. The identification efficiency of ITS2 barcode using BLAST was 100%. CONCLUSION The ITS2 region can accurately and stably distinguish I.asprella from its closely related species and adulterants.It provides a new method to ensure the clinical safety of traditional Chinese medicines.     

耳草属岭南药材DNA分子鉴定研究

目的：本研究应用ITS2序列作为DNA条形码对9种广东耳草属药材进行鉴定研究。方法：收集广东耳草属药材样本,通过植物基因组DNA提取、PCR扩增以及产物的双向测序获得ITS2序列,所得序列采用CodonCode Aligner进行拼接。用MEGA 6.06进行比对,分析种内和种间遗传距离,并构建系统进化树。结果：9种耳草属植物65条序列长度范围为208-224bp,共有92个碱基变异位点,种内遗传距离（0.002）明显小于种间遗传距离（0.202）。NJ和ML聚类树结果基本一致,除耳草与金毛耳草关系较近难以区分外,其余7个物种种内样本分别聚在一支,表现出单系性。结论：ITS2序列基本能够准确的鉴定广东耳草属药材,可作为耳草属药材基原植物鉴定的候选条形码序列。     

黄精属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的：评价DNA条形码候选序列对黄精属药用植物的鉴定能力。方法：对44份黄精属样品应用通用引物扩增其叶绿体rbcL、matK、psbA-trnH及核ITS2和ITS序列,分析其种内种间变异和barcoding gap,应用BLAST和Nearest Distance方法计算物种鉴定效率。结果：ITS2和ITS序列通用引物扩增效率低,叶绿体matK序列获得率最低,rbcL最高,三条序列种内与种间变异均较小,无明显的barcoding gap。基于BLAST和Nearest Distance方法计算,三条叶绿体序列对黄精属药用植物的鉴定效率均较低。结论：DNA条形码候选序列psbA-trnH、matK及rbcL不适用于黄精属药用植物的鉴定,叶绿体全序列或通过叶绿体全序列筛选合适的DNA片段可能是该属药用植物分子鉴定的方向。     

基于条形码ITS2序列的何首乌及其近缘种和混淆品的分子鉴别

目的:通过内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列分析,探究鉴别何首乌与其近缘种和混淆品的新方法。方法:何首乌与其近缘种和混淆品的ITS2序列进行扩增、纯化、测序,运用Seqman软件进行序列拼接,通过MEGA6.0软件进行序列的分析并构建kimura 2-parameter(K2P)模型的neighbor-joinin(NJ)系统聚类树。结果:何首乌与其近缘种和混淆品ITS2序列间存在明显差异,种内遗传距离小于种间遗传距离。齿叶蓼与何首乌种间遗传距离较大,却与翼蓼非常接近,二者的遗传距离仅0.029。NJ系统聚类树显示不同产地的何首乌聚为一支,与其近缘种和混淆品可很好地区分。结论:ITS2序列可有效地鉴别何首乌与其近缘种和混淆品,为何首乌的用药安全性提供技术保障。     

黄芩ITS2条形码数据库构建及其种子的DNA条形码鉴定方法建立

目的:通过构建黄芩核糖体DNA内转录间隔区2(ITS2)条形码数据库,建立黄芩种子DNA条形码鉴定新方法,保障黄芩种子基原准确。方法:收集黄芩对照药材、基原植物、生药材、公共数据库及其常见代用品的ITS2序列,构建黄芩DNA条形码数据库;收集62份市售黄芩种子样品,每份种子获取3~4条ITS2序列,基于BLAST方法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定。结果:共获得101条黄芩及其代用品的ITS2序列。黄芩的种内序列变异小于种间序列变异,黄芩、甘肃黄芩和粘毛黄芩在NJ系统发育树上分别聚为独立的支,可相互区分。共获得195条黄芩种子的ITS2序列,DNA条形码鉴定结果表明193条为黄芩序列,2条为真菌序列。结论:黄芩ITS2条形码数据库稳定可靠,可满足黄芩种子DNA条形码鉴定的需求。DNA条形码技术可用于黄芩种子的物种鉴定。     

应用ITS2条形码鉴定中药材合欢皮、合欢花及其混伪品

为准确鉴别中药材合欢皮、合欢花及其混伪品,该研究应用ITS2条形码对46份药材及其混伪品进行鉴定研究。通过对样本进行基因组DNA提取,PCR扩增和双向测序获得ITS2序列。所得序列经CodonCode Aligner 拼接后,基于隐马尔可夫模型的HMMer 注释方法去除两端5.8S 和28S 区段,用软件MEGA5.0对序列进行分析比对,并基于K2P模型进行遗传距离分析。采用相似性搜索法、最近距离法、构建NJ树对序列鉴定能力进行评估。结果表明,药材基原物种合欢的ITS2序列种内最大K2P遗传距离均远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离;应用相似性搜索法分析结果表明ITS2 序列可准确鉴定合欢药材及其混伪品;NJ树显示合欢药材与其混伪品可明显区分开,表现出良好的单系性。因此,应用ITS2条形码可稳定、准确地鉴别合欢药材及其混伪品。     

中国黄芪属药用植物DNA条形码（ITS2）鉴定

中国黄芪属植物种类繁多,具有重要的药用及生物学价值。本文采用了植物DNA条形码候选序列之一的ITS2片段来探讨在黄芪属药用植物中的鉴定能力。结果显示,ITS2基因区通用性强,序列在黄芪属物种间的差异较大,具有明显的Barcoding Gap,能够正确鉴定41个黄芪属植物物种,仅6个物种不能鉴定。此外,ITS2的二级结构也具有一定的系统学及分类学意义。本研究表明ITS2能够作为黄芪属药用植物鉴定的DNA条形码序列,具有重要的应用价值。     

基于ITS2序列的中药材藤梨根DNA分子鉴定

目的：通过DNA条形码鉴定技术区分中药材藤梨根及其常见混伪品。方法：对采集的中药材藤梨根样品及其常见混伪品进行DNA 提取,PCR扩增和测序,运用CodonCode Aligner 3.5.7对所获ITS2序列进行拼接。应用MEGA 5.0软件计算藤梨根及其常见混伪品的Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,并构建NJ（邻接）系统聚类树,最后分析种间ITS2序列的二级结构差异。结果：中药材藤梨根两种基原植物的平均种内K2P遗传距离分别为0.001和0.002,远小于藤梨根与其常见混伪品之间的平均K2P遗传距离0.120;藤梨根与其常见混伪品的ITS2二级结构也存在明显差异;NJ树显示藤梨根的基原植物聚在一起,与混伪品可明显区分,但无法区别所有猕猴桃属植物。结论：ITS2序列可高效区分藤梨根及其常见混伪品,弥补了传统鉴定方法的不足,提高了鉴定效率及准确性。     

基于ITS2序列的茄科酸浆属植物的DNA分子鉴定

目的:利用内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列对茄科酸浆属植物进行分子鉴定。方法:对酸浆属与散血丹属植物样本的ITS2序列进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增和测序。为扩大研究范围,从Gen Bank中下载了上述2个属植物样本的ITS2序列。所有序列经Codon Code Aligner V3.0.1软件拼接,DNAMAN软件比对分析,采用MEGA 5.10计算相关数据,基于K2P模型构建邻接聚类树。从ITS2数据库中获得所测样本及下载序列的ITS2二级结构信息,分析各样本间ITS2序列二级结构的差异。结果:从邻接聚类树分析可知,所有样本被聚为两大支。酸浆属植物自成1支,散血丹属植物为1支,且除极个别样本外,2个属的各物种种内样本可各为1支,表现出单系性;且每2支之间的Bootstrap支持率均很高。结论:ITS2序列在近缘物种间的系统学研究、品种的鉴定方面具有较大的应用潜力,适用于酸浆属植物的分子鉴定。     

基于ITS2序列的茅苍术及其近缘种DNA分子鉴定

目的 应用ITS2条形码鉴定茅苍术Atractylodes lancea及其近缘种药材.方法 提取不同产地29份茅苍术、北苍术A. chinesis及白术A. macrocephala基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,测序结果提交至GenBank;从GenBank下载茅苍术及其菊科近缘种10种45条ITS2序列;对提交与下载的73条序列,应用MEGA 5.1软件进行序列比对,计算种内和种间距离,采用相似性搜索法、最近距离法进行鉴定分析,并构建Neighber-jioning(NJ)系统进化树直观反映鉴定结果.结果 茅苍术药材ITS2序列长度均为229 bp,是1个单倍型;与菊科近缘种苍术属药材距离较近,与菊科其他属近缘种之间遗传距离较远,NJ树结果显示茅苍术及其近缘种药材均可明显区分,表现出良好的单系性,依据ITS2二级结构,也可以直观地将茅苍术与菊科近缘种药材区分.结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别茅苍术药材,为保障临床安全用药提供了新的技术手段.