聚合酶链反应凝胶呈像技术检测乙型肝炎病毒

目的 建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）－凝胶呈像（ｇｅｌｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍＧＤＳ）技术,并应用于临床检测乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核酸ＤＮＡ。方法 用凝胶呈像技术对血清ＨＢＶ－ＤＮＡＰＣＲ扩增产物的电泳凝胶进行摄像,分析,并与紫外灯下的肉眼观察结果相比较,对肉眼未判断出阳性而凝胶呈像分析邮阳性的血清标本,用定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）方法检测ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果 通过３８份血清标本的检测,发现     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒

目的用荧光定量聚合酶链反应（ＦＱＰＣＲ）方法准确地定量检测血清中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的数量和免疫指标,以指导临床。方法设计合成了ＨＢＶＦＱＰＣＲ诊断试剂盒,以一种完全闭管式的ＰＣＲ和荧光探针杂交技术相结合所产生的实时检测定量ＰＣＲ方法,检测了５３２份临床血清标本。结果经ＦＱＰＣＲ检测,１５８份ＨＢＶ的ｓ抗原、ｅ抗原、ｃ抗体（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂ）都阳性的标本,其血清标本ＨＢＶＤＮＡ也全部阳性,平均ＨＢＶＤＮＡ拷贝数为１．１×１０８／ｍｌ;９８例ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢｃＡｂ都阳性的标本,其阳性率为７３％（７１例）,平均拷贝数为８．６×１０５／ｍｌ,而常规ＰＣＲ只有３３％的阳性率;６７例ＨＢｓＡｂ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢｃＡｂ都阳性标本的平均拷贝数为２．３×１０５／ｍｌ。结论能够避免ＰＣＲ后处理导致的假阳性污染,并实现准确定量。ＦＱＰＣＲ可以检测ＨＢＶ的真实感染和复制情况,对于乙型肝炎的临床诊断,治疗方案的选择和疗效考察有较大的指导意义。     

实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒聚合酶基因变异

目的　建立一种在拉米夫啶治疗过程中的聚合酶酪氨酸 蛋氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸(YMDD)基序变异的检测方法。方法　根据寡核苷酸探针与模板结合时 ,不匹配碱基显著影响熔解温度的原理 ,设计合成 2条荧光标记的特异性探针 ,用实时荧光聚合酶链反应 (PCR)方法对 2 97例患者的 35 4份标本进行YMDD变异检测。结果　 35 4份标本中 ,检出YMDD变异株 15 6份 ( 44 1% ) ,其中混合株占 34% ( 5 3/15 6 ) ;有 9份血清标本同时进行了DNA序列分析 ,测序结果同本试验检测的结果完全一致 ;同时发现YMDD变异与血清谷丙氨酸转氨酶异常相关 (P <0 0 1)。结论　本研究建立的实时荧光PCR方法简便、快速、灵敏、经济 ,可用于临床拉米夫啶治疗中YMDD变异的检测。     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒

目的 用荧光定量聚合酶链反应（ＦＱ－ＰＣＲ）方法准确地定量检测血清中乙型肝炎疾病（ＨＢＶ）的数量和免疫指标以指导临床,方法 设计合成了ＨＢＶＦＱ－ＰＣＲ诊断试剂盒,以一种完全闭管式的ＰＣＲ和荧光探针杂交技术相结合产生的实时检测定量ＰＣＲ方法,检测了５３２份临床血清标本,结果 经ＦＱ－ＰＣＲ检测,１５８份ＨＢＶ的ｓ抗原,ｅ抗原,ｃ抗体（ＨＢｓＡｇ,ＨＢｅＡｇ,ＨＢｃＡｂ）都阳性的标本,其血清标本ＨＢ     

用重叠延伸聚合酶链反应制备鸭乙型肝炎病毒基因点突变

目的制备含鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）前核心区终止密码突变的基因片段，以对此基因突变作有关生物学研究。方法用重叠延伸聚合酶链反应（ＯＥ－ＰＣＲ）制备含此人工定向点突变的基因片段；用不对称聚合酶链反应（ａｓｙ－ＰＣＲ）制备单链ＤＮＡ模板作测序。结果凝胶电泳显示ＯＥ－ＰＣＲ产物与克隆ＤＨＢＶＤＮＡ酶切片段位置一致，测序证实该点突变存在。结论用ＯＥ－ＰＣＲ作人工定向基因突变，不需要克隆制备单链模板及筛选阳性克隆，２天内即可出结果，较传统方法简便、快速、有效。     

用重叠延伸聚合酶链反应制备鸭乙型肝炎病毒基因点突变

制备含鸭乙型肝炎病毒前核心区终止密码突变的基因片段，以对此基础突变有关生物学研究。用重叠延伸聚合酶链反应制备含此人工定向点突变的基因片段；用不对称聚合酶链反应制备单链ＤＮＡ模板作测序。凝胶电泳显示ＯＥＰＣＲ产物与克隆ＤＨＢＶ ＤＮＡ酶切片段位置一致，测序证实该点突变存在。     

DNA聚合酶链反应检测胃粘膜的乙肝病毒

乙肝病毒(HBV)虽是一种嗜肝病毒,但随着各种检测技术的发展,肝外多脏器感染的报告已遂渐增多。本文旨在探讨以PCR技术检测胃粘膜组织中特异性乙肝病毒基因片断,以探讨乙肝病毒与胃病的关系,更好地指导阻断乙肝病毒医源性传播途径。     

乙型肝炎病毒聚合酶链反应液相杂交酶免疫检测的定性判断值研究

目的探讨乙型肝炎病毒 (HBV)聚合酶链反应 (PCR)液相杂交酶免疫检测的定性判断值设立和灰区范围的计算方法。方法以 HBV为目的靶 DNA,引物 P1 5’端标记 Bio,PCR扩增 35个循环。扩增产物与 5’端标记Dig的探针混合进行液相杂交 ,杂交后产物被 SA酶标板固定 ,经酶标记抗 Dig抗体结合、显色。结果实验结果显示 ,本试剂的检测敏感度在 3× 10 4拷贝 /m l。 3种参比品 A450 值的 95 %、99%分布范围之间不存在交叉区 ,其中临界阳性参比品 95 %分布范围下限值 (A450 )为 0 .182。 5 85例献血员血清标本的 A450 均值为 0 .0 37,P99上限值为 0 .12 3,灰区范围在 0 .12 3～ 0 .182。本试剂对“HBs Ag /HBe Ag /抗 - HBc ”标本的阳性检出率为 98.8% ,“HBs Ag /抗 - HBe /抗 - HBc ”标本的检出率为 5 4.8% ,阴性标本的检测有较高的特异性。结论本试剂设立的定性判断值(灰区计算方法 )具有很高的正确性、可操作性和临床实用性     

聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术在乙型肝炎病毒基因分型中的应用

目前乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)基因型的分型方法有 4种 ,即全基因测序[1] ,表面抗原基因 (Ｓ基因 )序列分析[2 ] ,聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (ＰＣＲ ＲＦＬＰ)基因分型[3 6] ,单克隆抗体酶联免疫吸附试验基因分型法[7] 。而ＰＣＲ ＲＦＬＰ方法是较成熟、准确、简单的方法 ,本研究用分析基因库软件和ＰＣＲ ＲＦＬＰ技术及Ｌｉｎｄｈ等[3] 基因分型方法对广州地区乙型肝炎无症状携带者 (ＡｓＣ)和患儿的基因型进行研究。一、材料和方法1.标本来源 :2 0 0 0年 1月至 9月本院就诊ＡｓＣ和乙型肝炎患儿血清 91份 ,其中ＡｓＣ血清 6 0份 …     

逆转录套式聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒

目的建立敏感、特异的逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）方法，以检测中国人庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）感染。方法根据中国人感染ＨＧＶ者ＮＳ５区部分核苷酸序列分析结果，设计套式ＰＣＲ引物，用于ＨＧＶＲＮＡ的检测，并与用国外报道引物所作的一次ＰＣＲ和套式ＰＣＲ检测结果进行比较。结果共检测标本１３３份。以国外报道引物作一次ＰＣＲ和套式ＰＣＲ检出率分别为８．３％和１１．３％，作者建立的套式ＰＣＲ检出率为１８．０％，对部分ＰＣＲ产物进行序列分析证实为ＨＧＶ特异性基因。结论建立的方法可在中国人群中显著提高ＨＧＶＲＮＡ检出率。     

凝胶图像处理系统定量检测乙型肝炎病毒DNA

目的 建立一种聚合酶链反应（PCR）-凝胶图像处理系统定量分析核酸扩增产物的方法。方法 1、用PCR荧光定量分析仪实时监测PCR扩增曲线,并选择合适的扩增循环次数;2、将梯度标准乙型肝炎病毒（HBV）阳性血清（10^1-10^6拷贝/ul)分别进行40,35及32次循环次数的扩增,经琼脂糖电泳进行凝胶分析;3、选择凝胶分析软件中能客观反映核酸实际含量的最适参数,制定标准曲线,结果 40及35次循环时,在10^1-10^4拷贝/ul线性良好,而在10^4,10^5及10^6拷贝ul3个梯度时直线上升缓慢,趋于平坦,32次循环时,10拷贝/ul未能检出,10^2-10^6拷贝/ul的5个梯度的模板（对数值）与产物（体积）有良好的线性关系（r=0.97)。结论 32次循环线性范围较广,为最适循环次数;在UVIband的吸光度定量分析指标中,以体积或体积百分比作为定量指标较好。     

核酸提取方法在聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸中的评价

目的 对不同核酸提取方法在荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）检测血清乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）含量中应用进行评价，为临床方法学选择和实验结果的评价提供理论依据。方法 选用直接煮沸裂解法、NP－40煮沸裂解法、沉淀煮沸裂解法、磁珠核酸提取法等4种核酸提取方法提取乙型肝炎血清标本和含不同含量肝素的血清标本中HBV DNA模板，用荧光实时定量PCR法对其进行准确定量，从提取效率、抗干扰能力方面进行评价。结果 4种核酸提取方法中磁珠核酸提取法提取效率为最高，对数换算后，以此相对提取效率为100％，则直接煮沸裂解法为最低81％（P＜0．05）、NP－40煮沸裂解法为95％（P＞0．05）、沉淀煮沸裂解法为88．7％（P＜0．05）；从抗干扰能力方面，当肝素含量为500U／ml时，磁珠核酸提取法抗干扰能力最强，沉淀煮沸裂解法次之、直接煮沸裂解法和NP－40煮沸裂解法为最差，其HBV DNA含量抑制率分别为9．4％、13．5％、35．4％、52．7％。结论 本实验结果认为磁珠核酸提取法为实验室首选的核酸提取方法。     

荧光定量 PCR 法检测乙肝病毒 DNA 和乙肝病毒标志物检测的临床价值分析

目的：探讨荧光定量 PCR 法（FQ-PCR）检测乙肝病毒 DNA（HBV-DNA）和乙肝病毒标志物（HBV-M）ELISA 法检测的临床价值。方法选取2013年4～12月在该院检测的653例乙肝患者,先采用 ELISA 法对其血液标本进行 HBV-M 模式定性检测,检测顺序为乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝表面抗体（HbsAb）、乙型肝炎 e 抗原（HbeAg）、乙型肝炎 E 抗体（Hbe-Ab）、乙肝表面核心抗体（HbcAb）;再采用 FQ-PCR 法进行 HBV-DNA 定量检测,观察不同 HBV-M 模式检测结果。结果 HB-sAg、HbeAg、HbcAb 检测同时阳性简称“大三阳”。大三阳[1（＋）、3（＋）、5（＋）模式]和[1（＋）、3（＋）模式]的 HBV-DNA 阳性率分别为97．97％、94．74％,显著高于其他模式的 HBV-DNA 阳性率（P ＜0．05）。大三阳的 HBV-DNA 表达水平（5．59×10^6±2．42×10^5）copies/mL,明显高于其他模式（P ＜0．05）。结论联合 HBV-M 定性及 HBV-DNA 定量检测,对临床早期诊断及用药具有重要指导价值。     

定量PCR HBV DNA室间质量评价可接受范围的探讨

目的探讨定量聚合酶链反应(PCR)HBV DNA室间质量评价合理的可接受范围,使室间质量评价能更真实地反映和监控实验室检测能力。方法由上海市临床检验中心安排人员对51家临床实验室进行5个样本HBV DNA项目的飞行检查,3 h后由调查人员现场带回检测结果并对结果进行统计分析。使用单位数≥10家的试剂以A、B、C表示,以试剂分组,分别比较各试剂组的检测结果、组均值和不同浓度样本标准差(s)和变异系数(CV)的差异,并分别用组均值±3s、组均值±0.5log10和溯源至国家标准品得出的检测值换算成的对数值±0.4 3种评价方式对实验室检测结果进行评价。结果各试剂组检测结果之间有差异,A试剂组与B试剂组比较,1142、1144、1145样本检测结果差异有统计学意义(P均<0.05),与C试剂组比较,1144、1145样本检测结果差异有统计学意义(P均<0.05);A试剂组均值与B、C组比较,或与溯源至国家标准品的测定值(单位为IU/mL,结果用对数值表示)比较,1144、1145差值均超过了0.4;4个不同浓度样本其s和CV均超过了允许总误差为0.4时的s和CV。3种评价方式评价实验室成绩合格率分别为100%、88.2%、64.7%。结论采用组均值±3s为定量PCRHBV DNA室间质量评价的可接受范围更合理,更能真实地反映和监控实验室检测能力。     

实时荧光PCR监测HBV感染患者拉米夫定治疗病毒YMDD变异

目的 建立一种快速准确的实时荧光PCR方法检测HBV感染患者经拉米夫定治疗后YMDD变异情况.方法 首先用PCR法筛选HBV DNA阳性血清157例,HBV DNA含量为2.0×103～8.0×108拷贝/ml,HBV DNA阴性血清30例,然后采用TaqMan探针技术和选择性引物的实时荧光PCR对其进行YMDD变异检测.通过变异株和对照管的循环阈值(cycle threshold,Ct值)差来计算血清中总HBV中的YMDD变异株含量,并用PCR产物直接测序方法随机对69例HBV DNA阳性标本RT区进行基因序列分析,验证所建立方法的准确性.结果 187例接受拉米夫定治疗患者血清标本中,发生YMDD变异88例,其中YIDD变异39例,YVDD变异38例,YIDD与YVDD混合变异11例.突变株的含量为10%～100%.30例HBV DNA阴性血清的C管循环40次,69例测序结果显示68例两种方法检测结果完全相同,符合率为98.55%.结论 采用选择性引物和TaqMan探针技术建立实时荧光PCR方法能快速准确地检测YMDD变异情况,并能检测患者变异株在HBV总量中的比例,为临床使用拉米夫定治疗乙型肝炎病毒感染监测耐药性提供一种有效方法.     

荧光定量PCR与普通定性PCR检测乙型肝炎血清HBV DNA结果的比较

目的　探讨荧光定量聚合酶链反应 (PCR)与普通定性 PCR检测血清 HBV DNA结果的差异。方法　同时采用荧光标记 (Ampli Sensor)定量 PCR方法及普通定性 PCR方法对 10 0例乙型肝炎血清样品进行 HBV DNA检测 ,并分析其相关性 ,比较其差异。结果　 10 0例荧光定量 PCR方法检测 HBV DNA阳性率为 74.0 % (74/ 10 0 ) ,定性 PCR方法检测 HBV DNA阳性率为 5 2 .0 % (5 2 / 10 0 ) ,两种方法的 HBV DNA检出率比较具有显著性差异 (P<0 .0 1)。结论　荧光定量 PCR与普通定性 PCR相比具有一定的优势 ,完全可以取代定性 PCR方法 ,尤其适用于使用抗病毒药物的患者的疗效观察和病情预测     

快速反相杂交法检测HBV DNA

为建立一种简便快速的核酸探针杂交法检测 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ,将 Ｐ Ｃ Ｒ 上游引物用生物素标记后进行扩增;核酸探针固定于硝酸纤维素膜上,与带有生物素的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物杂交,杂交信号用链霉亲和素 酶结合物显色检测。结果表明,该法检测的敏感性为 ５ ｆｇ,杂交时间为４０ 分钟。２００ 例临床标本检测的阳性率（２７５％ ）高于琼脂糖电泳法（２４５％ ）。同时具有操作简便的特点,可作为 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物中 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 的常规检测方法。     

乙型肝炎病毒DNA含量与血清标志物的关系

目的 探讨乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒（HBV）DNA定量与乙肝血清标志物关系。方法 采用定量聚合酶链反应（PCR）法检测354例乙型肝炎患者血清中DNA含量,与HBV标志物作对比研究。结果 血清HBeAg阳性组HBVDNA含理明显高于抗-HBe或抗-HBc阳性组,而后两组HBVDNA检出率仍较高,乙型肝炎肝硬化组阳性率明显低于慢性乙型肝炎组,且含量较低。结论 定量PCR法检测HBVDNA检出率仍较高,乙型肝炎肝硬化组阳性率明显低于慢性乙型肝炎组,且含量较低。结论 定量PCR法检测HBV DNA具有较强的特异性和灵敏度,为临床了解病毒复制情况,制定治疗方案及疗效观察提供了确切依据。     

HBV DNA PCR检测在HBsAg阴性献血人群中的应用

目的 探讨HBsAg阴性献血者HBV DNA榆测的应用价值,评估核酸检测的必要性.方法 采用PCR检测HBsAg阴性献血者HBV DNA.采用8人份混合血样测定,超离心浓缩病毒,磁珠法提取病毒核酸.如HBV DNA为阳性,则进一步检测乙型肝炎病毒血清标志物5项.结果 HBVDNA检测限量为25 U/ml,23 225份标本中有4份为HBV DNA阳性,检出率为0.17‰.进一步检测其他HBV感染的血清学指标,发现这4份标本中有2份为抗HBe和抗HBc阳性,1份为抗HBc阳性,1份为抗HBs、抗HBc阳性.对HBV DNA的定量测定表明,其含量在50～200 U/ml.结论 现行的2次酶联免疫技术的血液筛查存在HBV漏检,有必要在现有的血液筛查模式中增加抗HBc检测,或增加病毒核酸筛查.