p38有丝分裂素激活蛋白激酶在白蛋白刺激肾小管上皮细胞表达调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子中的作用

目的探讨p38有丝分裂素激活蛋白激酶（p38MAPK）对白蛋白诱导的大鼠肾小管上皮细胞表达调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子（RANTES）及核因子-κB（NF-κB）活性的影响。方法培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E），分别加入不同浓度白蛋白（5、15、30g／L）或／和SB203580（p38MAPK抑制剂），应用逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹法分别检测RANTESmRNA及蛋白表达水平；应用凝胶迁移率变动分析检测NF-κB的活性变化；p38MAPK的磷酸化水平分析采用Western印迹法。结果白蛋白呈浓度和时间依赖性上调RANTESmRNA及蛋白表达水平，呈时间依赖性激活NF-κB活性，白蛋白明显刺激了p38MAPK磷酸化水平增高，SB203580可抑制白蛋白刺激的RANTES表达与NF-κB活性。结论白蛋白通过p38MAPK信号通路刺激RANTES的表达和NF-κB的活性。     

氟伐他汀对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾小管上皮细胞核因子κB活性的影响

目的 观察氟伐他汀对血管紧张素（Ang）Ⅱ诱导的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）内核因子（NF）κB活性的影响。 方法 将NRK-52E细胞分为（1）对照组;（2）不同浓度及时间AngⅡ组;（3）AngⅡ（10-6 mol/L）+SB203580（10 μmol/L）组;（4）AngⅡ（10-6 mol/L）+不同浓度氟伐他汀（10-7、10-6、10-5 mol/L）组;(5)AngⅡ（10-6 mol/L）+氟伐他汀（10-5 mol/L）+甲羟戊酸（10-4 mol/L）组。电泳迁移率变动分析法（EMSA）检测NF-κB活性变化。Western印迹方法检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化水平。RT-PCR方法检测单核细胞趋化因子（MCP-1）mRNA表达。 结果 AngⅡ呈剂量依赖性上调NF-κB DNA结合活性、p38MAPK的磷酸化水平以及MCP-1 mRNA表达（P < 0.01）。AngⅡ(10-6 mol/L) 刺激5 min即可增加p38MAPK蛋白磷酸化水平（P < 0.01）。AngⅡ刺激30 min后NF-κB活性显著升高（P < 0.01）,2 h达高峰（P < 0.01）。p38MAPK 特异性抑制剂SB203580可阻断AngⅡ对NF-κB的激活作用（P < 0.01）。氟伐他汀可呈剂量依赖性下调AngⅡ诱导的NRK-52E细胞内p38MAPK磷酸化和NF-κB活化,以及其下游趋化因子MCP-1表达（P < 0.05）。甲羟戊酸（10-4 mol/L）可逆转氟伐他汀的作用（P < 0.05）。 结论 氟伐他汀可能通过抑制p38MAPK信号转导通路,下调AngⅡ诱导的NRK-52E细胞内NF-κB的活化。甲羟戊酸可部分逆转氟伐他汀的作用。     

乌头汤对脂多糖诱导大鼠软骨细胞炎症反应的影响

目的:基于核转录因子-κB(NF-κB)炎症相关信号通路,观察乌头汤水提物对脂多糖(LPS)诱导体外培养软骨细胞炎症模型的影响。方法:①制备乌头汤水提物;②分离、培养软骨细胞;③噻唑蓝(MTT)法检测乌头汤对LPS诱导软骨细胞活性的影响;采用Western Blot法检测NF-κB p65、IκB激酶复合物(IKK)、磷酸化核因子κB抑制蛋白(pIκB)含量表达。结果:①MTT实验结果显示,乌头汤水提物对LPS诱导软骨细胞的最佳干预时间和浓度分别为24 h和150 μg·mL^-1;②Western Blot检测结果显示,乌头汤水提物100 μg·mL^-1组、150 μg·mL^-1组、200 μg·mL^-1组对LPS诱导的软骨细胞干预24 h后,可调节与炎症相关的NF-κB p65、IKK、pIκB含量表达,尤其以乌头汤水提物150 μg·mL^-1组变化显著(P<0.01)。结论:乌头汤通过降低LPS诱导的软骨细胞中与炎症相关的NF-κB途径调节因子含量表达,发挥抗炎作用。     

转化生长因子β1对脂多糖刺激大鼠腹膜间皮细胞上调表达促炎症因子的影响

目的 观察转化生长因子β1（TGF-β1）对脂多糖(LPS)刺激大鼠腹膜间皮细胞上调表达促炎症因子的影响，并探讨其可能的机制。 方法 把原代培养的第2代大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）分成对照组、LPS刺激组（1 mg/L）、TGF-β1刺激组（5 μg/L）及LPS+TGF-β1刺激组。RT-PCR和ELISA方法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6） mRNA及蛋白的表达。蛋白印迹方法检测磷酸化核因子（p-NF）-κB/NF-κB值的变化。 结果 (1)LPS可刺激RPMCs上调TNF-α和IL-6表达。LPS刺激24 h后，p-NF-κB/NF-κB值升高。(2)TGF-β1可拮抗LPS刺激大鼠腹膜间皮细胞上调TNF-α和IL-6表达，同时，也降低p-NF-κB/NF-κB值。 结论 在体外培养的大鼠腹膜间皮细胞，TGF-β1可拮抗LPS的致炎作用，其作用机制可能是通过抑制NF-κB的活化而介导。     

表面活性蛋白-A对脂多糖诱导的人肾小管近曲上皮细胞白介素-6表达的影响

目的：探讨表面活性蛋白-A（SP-A）的表达改变对脂多糖（LPS）诱导的人肾小管近曲上皮细胞（HK-2细胞）白介素-6（IL-6）表达的影响及机制。方法培养HK-2细胞,ELISA方法检测不同浓度的LPS（0、0．1、1、2、5、10 mg／L）作用8 h及5 mg／L的LPS于不同时间（0、2、4、8、16、24 h）作用HK-2细胞后IL-6蛋白表达的变化;应用脂质体转染法将SP-A SiRNA转染入HK-2细胞,筛选稳定转染细胞株,采用5 mg／L的LPS刺激SP-A SiRNA稳定转染的HK-2细胞8 h,ELISA方法检测细胞上清中IL-6的分泌量,Western印迹检测细胞NF-κB p65蛋白的表达。结果应用1、2、5、10 mg／L的LPS刺激HK-2细胞8 h后,IL-6蛋白表达水平较0、0．1 mg／L的LPS刺激后显著升高（P＜0．05）;同时,应用5 mg／L的LPS作用HK-2细胞4、8、16、24 h后,IL-6蛋白的表达水平较5 mg／L的LPS作用0、2 h显著升高（P＜0．05）。SP-A SiRNA转染的HK-2细胞经LPS刺激后,其NF-κBP65和IL-6蛋白表达较未转染经LPS刺激细胞明显升高（P＜0．05）。结论 SP-A可能通过抑制NF-κB p65的表达进而下调LPS诱导的HK-2细胞IL-6的表达,在脓毒症急性肾损伤时发挥保护作用。     

马兜铃酸促进肾小管上皮细胞转分化的发生及温阳活血方干预作用研究

目的：探讨马兜铃酸（aristolochic acid,AA）在大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）转分化中的可能作用,及温阳活血方拮抗转分化机制。方法：（1）MTT法检测不同浓度温阳活血方含药血清对NRK-52E细胞增殖的影响。（2）免疫细胞化学法检测不同浓度AA（0、5、10、20、40μg/ml）对NRK-52E细胞表达α-平滑肌肌动蛋白的影响。（3）ELISA法检测AA刺激下Col-Ⅰ的表达及温阳活血方对其调控作用。（4）Real-Time PCR法检测温阳活血方对TGF-β1mRNA、ET-1mRNA、VEGF mRNA等肾间质纤维化相关因子的调控作用。结果：（1）AA5μg/ml、AA10μg/ml、AA20μg/ml、AA40μg/ml均可刺激NRK-52E表达α-平滑肌肌动蛋白,AA10μg/ml浓度下α-平滑肌肌动蛋白表达较强。（2）AA刺激NRK-52E细胞12h、24h、48h后,Col-Ⅰ的表达水平随着时间的延长而增强。（3）马兜铃酸刺激NRK-52E细胞24h后,TGF-β1mRNA表达上调（P〈0.05）,VEGF mRNA表达显著下调（P〈0.01）,ET-1mRNA的表达显著上调（P〈0.01）,Col-Ⅰ表达水平显著高于正常对照组（P〈0.01）,温阳活血方干预下,TGF-β1mRNA表达下调（P〈0.05）,VEGF mRNA表达显著上调（P〈0.01）,ET-1mRNA有下调趋势,Col-Ⅰ表达水平显著下调。结论：（1）马兜铃酸可促进肾小管上皮细胞转分化的发生。（2）温阳活血方具有拮抗肾小管上皮细胞转分化作用。     

镧对内毒素/脂多糖诱导的巨噬细胞核因子KB活化的抑制作用

目的了解稀土元素镧对内毒素/脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)核因子κB(NF-κB)活化的影响,并探讨其机制。方法分离培养小鼠腹腔 Mφ,分为:空白对照组,无刺激因素;LPS 组,用1μg/ml LPS 刺激30 min;镧离子(La~(3 ))组,用2.5 μmol/L La~(3 )刺激30 min;La~(3 ) LPS 组,先后用2.5μmol/L La~(3 )、1μg/mI LPS 各刺激30 min;La~(3 )/LPS 组,2.5μmol/L La~(3 )刺激30 min 后,洗涤细胞,再加入1μg/ml LPS 刺激30 min。采用细胞免疫荧光染色法观察 NF-κB在各组细胞中的分布与表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)法捡测胞核中 NF-κB/p65蛋白活性;蛋白质印迹法检测细胞核内 NF-κB/p65蛋白及胞质中核因子抑制蛋白α(IκBα)的表达量。ELISA 法测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死冈子α(TNF-α)的含量。结果 (1)免疫荧光染色显示,空白对照组、La~(3 )组、La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组 Mφ绿色荧光多分布于胞质,胞核荧光强度分别为42±7、73±30、48±11和67±19;LPS 组绿色荧光集中于胞核,荧光强度为116±14,明显高于其余4组(P<0.01)。(2)胞核 NF-κB/p65蛋白活性:LPS 组吸光度值为0.435±0.066.与空白对照组(0.048±0.027)、La~(3 )组(0.062±0.049)、La~(3 ) LPS 组(0.066±0.031)、La~(3 )/LPS 组(0.108±0.017)比较,明显偏高(P<0.01)。(3)LPS 组 Mφ胞核 NF-κB/p65蛋白表达水平明显高于其余4组,胞质 IκBα蛋白表达水平明显低于其余4组。(4)TNF-α含量:La~(3 )组培养上清液中 TNF-α含量低于试剂盒检测下限(25 pg/ml)及空白对照组(P<0.05),La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组低于 LPS 组(P<0.01),但高于空白对照组。结论 LPS 可激活小鼠腹腔 MφNF-κB/p65核移位,并使胞核中 NF-κB/p65的表达量和活性升高、胞质 IκBα蛋白表达下调,导致 TNF-α分泌增多。镧可抑制上述效应。     

姜黄素保护大鼠肾小管上皮细胞对抗氧化应激引起的损伤作用

目的 探讨姜黄素对氧化应激诱导大鼠近端肾小管上皮细胞 (NRK-52E) 损伤作用的影响。 方法 用不同浓度的H2O2处理NRK-52E细胞,建立氧化应激损伤NRK-52E的实验模型。应用Hoechst 33258染色法观察凋亡细胞的形态学改变;PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western印迹法检测Bcl-2蛋白的表达。 结果 H2O2在100~500 μmol/L浓度范围内处理NRK-52E细胞24 h,呈浓度依赖性地增加细胞的凋亡率;500 μmol/L H2O2能显著抑制NRK-52E细胞Bcl-2的表达（P < 0.05）。20 μmol/L和40 μmol/L姜黄素能显著阻断H2O2对NRK-52E细胞的致凋亡作用[（32.9±8.1）%、（22.23±9.3）%比（72.7±10.5）%,均P < 0.05],并能显著拮抗H2O2对Bcl-2蛋白表达的下调作用（P < 0.05）。40 μmol/L姜黄素本身也能上调Bcl-2蛋白的表达（P < 0.05）。 结论 姜黄素能保护NRK-52E细胞对抗氧化应激引起的细胞凋亡,此肾小管上皮细胞保护作用可能与其抑制H2O2对Bcl-2蛋白表达的下调作用有关。     

核因子кB诱捕物寡核苷酸对肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响

目的 研究核因子(NF)κB结合位点诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)对肾小管上皮细胞的NF-κB活性及下游炎症因子表达的影响。方法 (1)鱼精蛋白-脂质体法转染NF-κB decoyODN:将NF-κB decoy ODN与鱼精蛋白、脂质体混合,转染至TNF-α刺激培养的大鼠肾小管上皮细胞内,测定转染率。(2)凝胶电泳迟滞分析测定转染 NF-κB decoy ODN后细胞NF-κB活性。(3)RT-PCR方法检测转染NF-κB decoy ODN后细胞 ET-1、iNOS、ICAM-1、VCAM-l以及MCP-1 mRNA表达水平。结果 当+/-比例为4时,鱼精蛋白-脂质体法转染率高达93.20％;转染NF-κB decoy ODN可抑制TNF-α激活的NF-κB活性,从而进一步抑制ET-1、iNOS、ICAM-1、VCAM-I和MCP-1的mRNA表达。结论(1)鱼精蛋白-脂质体法是一种不受血清影响的高效率转染方法。(2)NF-κB decoy ODN在体外通过抑制NF-κB活性,进而影响肾小管上皮细胞炎症因子的表达。     

姜黄素对内毒素所致肾脏炎症的抑制作用

目的：肾脏的急慢性炎症与肾脏疾病的进展密切相关,本研究拟探讨姜黄素对内毒素（LPS）所致肾脏炎症的抑制作用。方法：SPF级昆明种小鼠40只,鼠龄6～8周,体重20～25g。小鼠分为3组：（1）正常对照组：腹腔注射生理盐水;（2）模型组（LPS组）：腹腔注射LPS（1mg/kg和5mg/kg）;（3）治疗组（LPS＋姜黄素）：动物先腹腔注射姜黄素（1mg/kg或5mg/kg）3d,然后腹腔注射LPS1mg/kg或5mg/kg。于处理后6h取材,切取部分肾组织用10%甲醛固定,HE染色,进行病理学观察。部分肾组织用于MCP-1mRNA检测。将肾小管上皮细胞（HK-2细胞）培养于KSF培养液中,设正常对照组给予正常培养液,LPS刺激组（1ng/ml,100ng/ml和10μg/ml）,LPS刺激＋姜黄素（5μmol/L和50μmol/L）处理组,分别培养4h和24h后收集细胞,应用Real-timePCR检测各组细胞MCP-1的表达。ELISA检测细胞培养上清液中MCP-1的表达。EMSA检测肾小管上皮细胞NF-κB的活性。结果：腹腔注射LPS（1mg/kg和5mg/kg）虽未引起光镜下肾脏组织的病理改变,但可显著增加小鼠肾脏MCP-1 mRNA的表达,分别增加20倍和26倍,而姜黄素处理可降低LPS所诱导的肾脏MCP-1 mRNA的表达,尤以LPS（1mg/kg）＋姜黄素（1mg/kg）为明显（下降至基础值的2.5倍）。应用不同浓度的LPS刺激HK-2细胞4h,HK-2细胞MCP-1 mRNA表达量显著增加,且呈剂量依赖的效应（分别增加1.60、2.15和14.7倍）。而以100ng/ml的LPS刺激HK-2细胞4h,观察姜黄素的干预作用,可见不同浓度的姜黄素（5μmol/L和50μmol/L）可显著抑制LPS所诱导的HK-2细胞MCP-1 mRNA的表达,且以50μmol/L姜黄素干预组为明显。同时ELSA检测细胞上清液中MCP-1的表达结果相似。EMSA结果显示NF-κB的DNA结合活性随LPS的浓度增加而增加,而应用姜黄素预处理后,由LPS所诱导的增高的NF-κB的DNA结合活性随之下降。结论：早期给予姜黄素治疗,能明显改善LPS诱导的小鼠肾脏趋化因子MCP-1的表达,从而发挥其肾脏损伤的保护功能;而体外研究表明姜黄素可抑制LPS所诱导的肾小管上皮细胞MCP-1表达,其作用可能与抑制细胞NF-κB的活性有关。     

核因子κB诱捕物寡核苷酸对肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响

目的 研究核因子(NF)κB结合位点诱捕物寡核苷酸(NF—κBdecoyODN)对肾小管上皮细胞的NF-κB活性及下游炎症因子表达的影响。方法 (1)鱼精蛋白-脂质体法转染NF-κBdecoy ODN：将NF-κBdecoyODN与鱼精蛋白、脂质体混合，转染至TNF—α刺激培养的大鼠肾小管上皮细胞内，测定转染率。(2)凝胶电泳迟滞分析测定转染NF-κBdecoy ODN后细胞NF-κB活性。(3)RT—PCR方法检测转染NF-κB decoy ODN后细胞ET-1、iNOS、ICAM-1、VCAM-1以及MCP-1mRNA表达水平。结果 当 ／一比例为4时，鱼精蛋白-脂质体法转染率高达93．20％；转染NF-κB decoy ODN可抑制TNF—α激活的NF-κB活性，从而进一步抑制ET-1、iNOS、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的mRNA表达。结论 (1)鱼精蛋白-脂质体法是一种不受血清影响的高效率转染方法。(2)NF—κBdecoy ODN在体外通过抑制NF-κB活性，进而影响肾小管上皮细胞炎症因子的表达。     

MEK/ERK1/2在LPS抑制NRK-52E肾小管上皮细胞增殖中的作用

【摘要】 目的 探讨脂多糖(LPS)对大鼠NRK-52E肾小管上皮细胞增殖的影响及MEK/ERK1/2信号途径的调节作用。方法 不同剂量LPS按不同时间刺激NRK-52E细胞,并以MEK特异性抑制剂U0126干预。使用cell counting kit-8(cck-8)试剂检测细胞增殖,Western blot检测NRK-52E细胞ERK1/2、Akt蛋白磷酸化水平。结果 LPS在0.001、0.01 mg·L-1作用72 h对NRK-52E细胞增殖无明显影响,在0.1、1.0 mg·L-1抑制NRK-52E细胞增殖;MEK特异性抑制剂U0126显著抑制NRK-52E细胞增殖,其作用在2.5、5、10、20 ?滋M浓度之间无显著差异。U0126预处理加强LPS对NRK-52E细胞增殖的抑制作用。LPS诱导NRK-52E细胞ERK1/2和Akt磷酸化;U0126单独或联合LPS处理NRK-52E细胞72 h阻断ERK1/2蛋白磷酸化,伴有pAkt蛋白水平上调。结论 MEK/ERK1/2可能在LPS抑制NRK-52E细胞增殖的过程中起保护作用。     

白蛋白诱导的肾小管细胞凋亡与丝裂素激活蛋白激酶信号通路

目的 探讨白蛋白诱导肾小管上皮细胞凋亡以及诱导凋亡的信号传导机制&#65377; 方法 将培养的大鼠肾小管细胞NRK-52E分别与不同浓度(10&#65380; 20&#65380; 30 mg/ml)的去脂无内毒素牛血清白蛋白(BSA)共同孵育6&#65380; 12&#65380; 18和24 h&#65377;透射电镜&#65380;共聚焦激光显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡&#65377;BSA 20 mg/ml刺激NRK-52E细胞15&#65380; 30&#65380; 60和120 min后, Westen印迹测定p38&#65380;氨基末端激酶(JNK)和细胞外信号调节激酶(ERK)活性&#65377;将SB202190(20 μmol/L, p38抑制剂)&#65380;SP600125(10 μmol/L, JNK抑制剂)和PD98059(20 μmol/L, ERK抑制剂)分别与白蛋白和NRK-52E细胞共同孵育24 h后检测细胞凋亡&#65377;结果 白蛋白以时间和剂量依赖方式诱导肾小管细胞凋亡&#65377;白蛋白与NRK-52E细胞共孵育后,p38和JNK活性明显升高,ERK活性显著降低&#65377;SB202190和SP600125可分别抑制白蛋白诱导NRK-52E细胞凋亡,而PD98059促进白蛋白诱导的NRK-52E细胞凋亡&#65377;结论 白蛋白以时间和剂量依赖方式诱导肾小管细胞凋亡,而p38和JNK激活与ERK抑制介导了白蛋白诱导的肾小管细胞凋亡&#65377;     

核因子κB反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下，核因子κB（NF-κB）反义寡核苷酸对体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响。 方法 采用脂质体介导的方法将NF-κB反义寡核苷酸（AS-ODN）导入细胞，以TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞24 h后，用RT-PCR方法检测细胞中NF-κB mRNA及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达，用荧光光谱法分析α-SMA蛋白的表达，并以倒置相差显微镜观察细胞转分化过程的形态变化。 结果 TGF-β1诱导24 h后，HK-2细胞中NF-κB mRNA的表达显著上调，为空白对照组的8倍以上（P < 0.01）。NF-κB反义寡核苷酸导入细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的 NF-κB mRNA表达，比TGF-β1组减少75％（P < 0.05），同时，α-SMA mRNA和蛋白表达亦较TGF-β1组均明显下调（P < 0.05）。 结论 NF-κB反义寡核苷酸可抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞NF-κB的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，可能有利于肾间质纤维化的防治。     

依贝沙坦抑制造影剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的 探讨依贝沙坦在造影剂诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用及机制。方法 培养的大鼠肾小管细胞(NRK-52E)分别与不同碘浓度(25、50、100、150 mgI/ml)的安射力(非离子型造影剂)共孵育1 h;安射力(100 mgI/ml)先后刺激NRK-52E细胞0.5、1、2、4 h。与安射力(100 mgI/ml)相同渗透浓度的甘露醇(420 mmol/L)与NRK-52E细胞共孵育1 h作为阳性对照。不同浓度依贝沙坦(0.01、0.1、1 mmol/L)先与NRK-52E细胞共孵育1 h后,安射力(100 mgI/ml)刺激1 h。Hoechst染色和流式AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(ROS)水平。RT-PCR检测Bax、Bcl-2 mRNA的表达。 结果 安射力呈浓度和时间依赖性诱导NRK-52E细胞凋亡。与安射力相同渗透浓度的甘露醇不能明显诱导细胞凋亡。安射力与NRK-52E细胞共孵育后,细胞内ROS产生增多,Bcl-2 mRNA的表达下调,Bax mRNA的表达上调。依贝沙坦呈浓度依赖性抑制安射力诱导的NRK-52E细胞凋亡、细胞内ROS的产生、Bcl-2 mRNA表达下调及Bax mRNA表达上调。细胞内ROS水平与细胞凋亡呈正相关。 结论 安射力呈浓度和时间依赖性诱导NRK-52E细胞凋亡,此作用与细胞内氧化应激及bcl-2 mRNA表达下调、Bax mRNA表达上调相关。依贝沙坦能抑制上述安射力的作用,呈浓度依赖性抑制NRK-52E细胞凋亡。     

脂氧素A4对脂多糖活化小鼠巨噬细胞NF-κB和TNF-α转化酶的影响

目的 研究脂氧素A4（LXA4）对脂多糖（LPS）活化的小鼠巨噬细胞NF-κB及TNF-α转化酶的影响。方法 小鼠RAW 264．7巨噬细胞株培养于细胞培养板,随机分为空白对照组、LPS处理组（LPS 1μg/ml）和LPS＋LXA4组（LPS 1μg/ml＋LXA4 10^-7mol/L）。酶联免疫吸附法测定上清液TNF-α水平,提取细胞总蛋白,Western blot法测定NF-κB p65、IκB-α及TNF-α转化酶含量,荧光素酶报告质粒测定NF-κB活性。结果 LXA4抑制LPS活化的RAW 264．7巨噬细胞IκB-α降解、NF-κB p65核转位及NF-κB活性,同时抑制TNF-α蛋白表达和上调TNF-α转化酶蛋白表达。结论 LXA4通过抑制NF-κB活性和下调TNF-α转化酶表达而减少LPS活化的RAW264．7巨噬细胞分泌TNF-α。     

利多卡因对LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞NF-κB活性的影响

目的 探讨利多卡因对LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞NF-κB活性的影响.方法 取wistar大鼠腹腔巨噬细胞,以2 × 106/ml的密度接种于12孔培养板,每孔1 ml.纯化处理后随机分为5组,每组10孔.正常对照组(C组)加入RPMI-1640培养液1 ml,L组加入含100 ng/ml LPS的RPMI1640培养液1 ml,LL1组、LL2组和LL3组分别加入含有2、20、200μg/ml利多卡因+100 ng/ml LPS的RPMI-1640培养液1 ml.孵育24 h后,收集上清液,测定高迁移率族蛋白B1(HMGB1)浓度;取细胞沉淀,测定HMGBl mRNA表达水平和NF-κB活性.结果 与C组比较,其他各组HMGB1浓度、HMGB1mRNA表达和NF-κB活性均升高(P＜0.05);与L组及LL1组比较,LL2组和LL3组上述指标降低(P＜0.05).LL3组HMGB1 mRNA表达水平低于LL2组(P＜0.05).结论 利多卡因可抑制LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞NF-κB活化,从而抑制HMGB1的合成与释放.     

血管紧张素Ⅱ1型受体表达对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞损伤的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)在高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞损伤中的作用及分子机制。方法体外培养大鼠肾小管上皮细胞,分为正常对照组、高糖组、高糖+血管紧张素Ⅱ1型受体小干扰RNA组、高糖+小干扰RNA阴性对照组。采用免疫印迹法检测受体AT1R、脂联素受体1(AdipoR1),炎性因子核转录因子(NF-κB)、单核细胞趋化因子1(MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1)及纤维化标记物α-肌动蛋白(α-SMA)、纤维结合蛋白(FN)的表达;采用免疫沉淀法检测AT1R-AdipoR1二聚化在肾小管上皮细胞中的形成,共聚焦显微镜下观察AT1R、AdipoR1在肾小管上皮细胞中的共定位关系。结果研究发现,在高糖刺激下,大鼠肾小管上皮细胞中AdipoR1表达无改变,AT1R表达明显增加(P0.05);炎性因子NF-κB、MCP-1、MIP-1α表达显著上调(均P0.05);纤维化标记物α-SMA、FN表达显著升高(均P0.01)。研究还发现,大鼠正常肾小管上皮细胞中存在AdipoR1-AT1R二聚化,且在高糖刺激下AdipoR1-AT1R二聚体表达较正常对照组明显升高。在转染血管紧张素Ⅱ1型受体小干扰RNA后,AT1R-AdipoR1二聚化明显减少,且明显抑制AT1R表达(P0.05),并使肾小管上皮细胞炎性因子NF-κB、MCP-1、MIP-1α表达显著下调(均P0.05),使纤维化标记物α-SMA、FN表达明显降低(均P0.05)。结论高糖刺激下,AT1 R通过促进AT1 R-AdipoR1二聚化,介导肾小管上皮细胞炎性损伤及诱导肾小管上皮细胞凋亡,促进其纤维化的发生发展。     

热休克蛋白72肽结合区对肾小管上皮间质转分化的影响

目的 探讨热休克蛋白72肽结合区在肾小管上皮间质转分化(EMT)过程中的作用和可能机制.方法 应用质粒转染方法分别诱导热休克蛋白72(HSP72)野生型、肽结合区缺失型(HSP72-△PBD)和肽结合区(PBD)的表达.用转化生长因子β1(TGF-β1)刺激大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)48 h,Western印迹和免疫荧光染色检测细胞E-钙黏蛋白(cadherin),α-平滑肌肌动蛋白(SMA),HSP72和Smad3/磷酸化(p)-Smad3蛋白表达.结果 TGF-β1(10 μg/L)刺激NRK-52E细胞48 h后上调α-SMA和下调E-cadherin蛋白表达水平.Western印迹及细胞免疫荧光显示,过表达HSP72和PBD能明显减轻TGF-β1诱导的NRK-52E细胞E-cadherin蛋白表达下调和α-SMA蛋白表达上调,而过表达HSP72-△PBD不能改变上述蛋白的表达.此外,过表达HSP72和PBD显著抑制Smad3的磷酸化.结论 HSP72抑制Smad3活化和EMT的发生可能与PBD的功能有关.     

NF-κB信号通路在异丙酚抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶基因表达上调中的作用

目的 探讨NF-κB信号通路在异丙酚抑制脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶( iNOS)基因表达上调中的作用.方法 体外培养RAW264.7细胞,以5×105/ml密度接种于6 cm培养皿(3 ml/皿)或6孔板(2 ml/孔),采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=18):正常对照组(C组)、LPS组(L组)和LPS+异丙酚(LP组).C组不做任何处理;L组和LP组均加入1μg/mlLPS,LP组于加入LPS前2h加入50 μmol/L异丙酚.于LPS孵育30 min时,每组取6皿和6孔,收集细胞,分别采用免疫印迹法测定磷酸化IκB激酶(p-IKK)和NF-κB活性;于LPS孵育6h时,每组取6皿,收集细胞,测定iNOS mRNA表达.结果 与C组比较,L组p-IKK和iNOS mRNA表达上调,NF-κB活性升高(P＜0.05);与L组比较,LP组p-IKK和iNOS mRNA表达下调,NF-κB活性降低(P＜0.05).结论 NF-κB信号通路参与了异丙酚抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞iNOS基因表达上调.