比较胚胎和新生小鼠肠神经嵴干细胞体外增殖分化的实验研究

目的联合应用简化无血清培养基和连续传代法，从胚胎14～17d、新生1d、新生5d小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞（gut neural crest stem cells，GNCSCs），观察其体外培养过程中增殖、分化的特点，用p75、GFAP、Peripherin、α-Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系，比较胚胎和新生小鼠GNCSCs在生长速度、分化细胞的种类及数量上的差异。方法取3组小鼠的肠管，分离制成单细胞悬液，接种于DMEM／F12完全培养基贴壁培养，在连续传代培养中观察克隆球的形成；将克隆球接种于含血清培养基，观察其分化现象；用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达。结果部分胚胎和新生小鼠肠管细胞在无血清培养基中连续传代培养形成克隆球。在血清刺激下克隆球可分化为多种形态的细胞。克隆球和分化细胞系的免疫染色均为阳性。结论胚胎和新生鼠肠管内存在具有自我更新能力的GNCSCs，且均可分化为神经元、神经胶质细胞和平滑肌三类细胞。新生鼠较胎鼠GNCSCs生长速度慢，分化的神经元数量减少，神经胶质细胞数量增加，平滑肌细胞无显著变化。     

利用人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化模型建立体外神经毒性测试的实验研究

目的 许多药物具有神经毒性,尤其是对于儿童的影响更大.目前常用的药物体内毒性实验既耗时又昂贵.人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化有望建立一种理想的用于评价药物神经毒性的体外评估系统.此项研究旨在利用红藻氨酸的神经毒性验证此系统的可行性.方法 单层贴壁状态下,人胚胎干细胞和人羊水干细胞在化学成分明确的诱导条件下向神经细胞诱导.这些细胞经神经细胞特异性的抗体染色证实其特性.诱导得到的神经细胞在不同浓度红藻氨酸的培养液中进行培养和扩增,每代细胞进行计数,绘制细胞的生长曲线.结果 人胚胎干细胞和人羊水干细胞均可被高效地诱导为神经细胞;人胚胎干细胞的神经诱导效率高于人羊水干细胞;红藻氨酸对诱导得到的神经细胞具有毒性,其浓度与毒性呈正相关.结论 人胚胎干细胞和人羊水干细胞的体外神经分化可作为用于评价药物神经毒性的体外评估系统.

Abstract：

Objective A lot of drugs have side effects on the central nerves system. Especially in children. In vivo neurotoxicity tests are time-consuming and expensive. The neural differentiation of human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells provides all ideal in vitro system that Can be applied to evaluate neurotoxicity of drugs. This study was to try to establish such a system. The kainie acid was selected to test the neurotoxicity. Methods The human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells were indueed to differentiate into neural cells by a chemically defined neural induction medium. The induced neural cells were propagated in the presence of basic fibroblast growth factor. Immunocytochemical staining Was applied to confirm these cells' neural identity. The induced cells were propagated under different concentration of kainic acid, then the gosh curve were made based on the cell numbers. Results Both of the human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells could be efficiently induced to be differentiated into neural cells. The neural differentiation efficiency of human embryonic stem cells is higher than that of human amniotic fluid stem cells. The kainic acid has neurotoxieity to the indueed neural cells. Conclusions The neural differentiation of human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells were proved to provide a rapid and convenient approach for estimating the neurotoxlcity of drugs.     

新生大鼠海马神经干细胞的无血清培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞无血清培养的最佳方法，观察神经干细胞的生长、增殖及分化的特点。方法分离新生24h大鼠的海马组织，分别采用含碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、及bFGF＋EGF的无血清条件培养基进行悬浮培养，采用神经巢蛋白（nestin）免疫荧光染色方法鉴定神经干细胞，通过胎牛血清诱导分化，鉴定分化细胞，进一步证实神经干细胞。结果bFGF＋EGF能更好的诱导神经干细胞增殖，培养细胞呈nestin抗原阳性，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性抗原。结论bFGF＋EGF的无血清培养基可用于培养大鼠海马神经干细胞。     

不同状态下新生鼠海马神经干细胞体外培养特征

目的探讨不同状态下新生鼠海马神经干细胞(NSCs)体外培养特征。方法将42只新生7日龄SD乳鼠随机分为正常对照组、单纯缺氧组及缺氧缺血(HI)组,每组14只。每组又根据处死时相点随机分成3、6 h,1、3、7、14、21 d 7个小组,每小组2只。建立HI动物模型后,采用细胞克隆和免疫组织化学技术对3组左侧海马的NSCs进行培养、传代、分化及鉴定。结果3组SD鼠海马组织均能培养出悬浮生长的NSCs神经球,具有连续克隆能力,可传代培养及分化。在3、6 h时间点处死培养SD鼠原代细胞时,3组获得克隆球的数目无显著差异,而在1、3、7、14、21 d时间点培养的原代细胞中均以单纯缺氧组培养出的克隆球最多,HI组培养出的克隆球最少。结论不同状态下新生鼠海马组织均能培养出NSCs,NSCs随年龄的增加、病程的延长和病情的加重而减少。     

胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究

目的探讨胚胎干细胞（ESC）诱导分化为树突状细胞（DCs）的实验方法,实现体外大规模扩增高纯度DCs用于临床免疫治疗。方法E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体（EB）诱导分化为DCs。不成熟DCs（im-DCs）流式细胞仪检测CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ-DR表达。用磷酸酯多糖（LPS）促进DCs成熟,收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查,分析细胞表型并与im-DCs细胞表型做对比,异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果ESC来源DCs呈典型DCs形态学表现。im-DCCD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达低,m-DCCD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达均较前明显升高。功能检测发现,ESC来源DCs具有强烈激发同种异体淋巴细胞增殖的作用,证实ESC来源的DCs具备正常的免疫学功能。结论使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DCs。故ESC可作为DCs来源一条新途径,对于体外大规模制备DCs用于免疫过继治疗提供一个较好的方法。     

新生大鼠神经干细胞的分离培养

目的 探讨新生大鼠神经干细胞的分离培养方法及其外源报告基因在神经干细胞中的表达情况。方法 采用无血清细胞培养技术，间接免疫细胞化学染色法及其绿色荧光蛋白转导技术。结果 从新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力，表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达成熟神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。绿色荧光蛋白报告基因转导神经干细胞后能够有效表达。结论 该方法分离培养的神经干细胞保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新、增殖能力和多分化潜能，而且外源报告基因在神经干细胞中能够有效表达。     

新生大鼠神经干细胞的分离培养

目的： 探讨新生大鼠神经干细胞的分离培养方法及其外源报告基因在神经干细胞中的表达情况。方法： 采用无血清细胞培养技术，间接免疫细胞化学染色法及其绿色荧光蛋白转导技术。结果： 从新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力，表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达成熟神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。绿色荧光蛋白报告基因转导神经干细胞后能够有效表达。结论： 该方法分离培养的神经干细胞保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新、增殖能力和多分化潜能，而且外源报告基因在神经干细胞中能够有效表达。     

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎大鼠神经干细胞增殖分化的影响

目的探讨分离、培养及鉴定胚胎大鼠神经干细胞(NSCs)方法，观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对NSCs增殖、分化的影响。方法从大鼠胚胎脑组织中分离出NSCs，用bRGF和胎牛血清诱导其增殖和分化，予BrdU以标记分裂细胞，采用免疫细胞化学鉴定NSCs和分化神经细胞。结果大鼠胚胎脑NSCs在无细胞因子和胎牛血清的培养基中无新生细胞形成，但能在bFGF和血清诱导下形成克隆，并产生nestin和BrdU阳性细胞，贴壁后分化为神经元和星形胶质细胞。结论该方法从大鼠胚胎大脑分离出的细胞具有NSCs特性，即自我更新和多向分化潜能;bFGF是NSCs增殖必须的丝裂原。     

大鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养和诱导分化

目的 探索从大鼠胚胎肠组织获取肠神经嵴干细胞（neural crest stem cells，NCSCs）的可能性；与脑神经干细胞（neural stem cells，NScs）比较，了解其生物学性状。方法 用NSCs的培养液同时进行肠NCSCs和脑NSCs的培养；得到的神经细胞球用神经上皮干细胞蛋白（nestin）进行鉴定，计数NCSCs神经细胞球和NSCs神经细胞球中各自的Nestin阳性细胞比例。NCSCs神经细胞球在胎牛血清诱导分化培养7d后，用神经元细胞特异性标记神经纤维丝蛋白（NF68）和星形胶质细胞特异性标记神经胶质酸性蛋白（GFAP）对其进行免疫荧光鉴定。结果从大鼠胚胎肠组织成功得到NCSCs，并且形成神经细胞球，Nestin为阳性；分化后细胞为NF68或者GFAP阳性；与NSCs比较，NCSCs能较快形成神经细胞球，其神经细胞球中的Nestin阳性细胞比例（66．75±12．42）％低于NSCs（91．60±5．62）％（P=0．000）。结论 肠NCSCs可以从大鼠胚胎肠组织分离培养得到，在体外培养环境下能够增殖，并且具有多向分化潜能。     

人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究

目的研究人胚胎神经干细胞体外长期培养的条件、不同部位脑组织神经干细胞数量及其分化能力和特点。方法分离人胚胎海马、皮质、室周、纹状体脑组织，培养在含碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、表皮生长因子（EGF）、B27、N2掭加剂的无血清培养基中，形成神经球，用有限稀释法进行克隆、传代。计算神经球数量，用溴脱氧尿苷（BrdU）标记神经球，使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞自主分化能力。结粜人胚胎海马、皮质、室周、纹状体部位脑组织均能培养出具有自我增殖能力的神经干细胞，其中海马所含神经干细胞最丰富。室周次之。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。液氮冻存6个月的细胞复苏后仍具增殖分化能力。细胞贴壁分化后可形成Nestin、胶质原性纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白2（MAP2）表达阳性细胞。结论胚胎脑组织具有丰富的神经干细胞。具有自我更新和增殖能力，可长期培养。含b-FOF、EGF的无血清培养基能促进神经干细胞连续稳定增殖，保持神经干细胞特性。分离培养的神经干细胞可向神经元、胶质细胞分化。     

中枢神经系统原发性神经外胚层肿瘤干细胞的分离与鉴定

目的 从中枢神经系统原发性神经外胚层肿瘤(Central nervous system primitive neu-roectodermal tumor,CNS-PNET)中分离并鉴定肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs).方法 应用无血清的干细胞培养基,分离CNS-PENT的细胞球细胞,应用二代细胞球形成分析、免疫细胞化学染色以及不同亚群肿瘤细胞裸鼠颅内接种等方法 ,进行CSCs鉴定.结果 2种CNS-PNET细胞在于细胞培养条件下均形成了细胞克隆球,部分细胞球细胞均表达了神经干细胞标记抗体Sox2和Nes-tin.原代细胞球在连续传代培养中均可形成2代细胞球,且也能表达Sox2和Nestin.在血清的刺激下细胞球细胞可分化为多种形态的细胞,分化细胞亚群免疫染色均为阳性.10个CNS-PNET细胞球细胞在颅内接种后几乎全部裸鼠形成肿瘤,相反,同等数量的原代肿瘤细胞接种后未见肿瘤生长.结论 使用无血清的干细胞培养条件可以简便快捷的培养并分离出CNS-PNET的悬浮细胞克隆球体,具备自我更新、多向分化、体内成瘤的基本特征,并能表达干细胞的标记抗体,可以作为理想的CSCs进行一系列的后续研究.     

两步法体外定向诱导小鼠胚胎干细胞发育为CD+34/Sca-1+造血干细胞的研究

目的　建立一种体外诱导胚胎干细胞 (embryonicstemcell,ESC)定向发育为CD 3 4 /Sca 1 造血干细胞 (hematopoieticstemcell,HSC)的实验方法。方法　联合应用血管内皮生长因子(vascularendothelialcellgrowthfactor ,VEGF)、干细胞因子 (stemcellfactor ,SCF)、白细胞介素 3(interleukin 3,IL 3)、白细胞介素 6 (interleukin 6 ,IL 6 )和促红细胞生成素 (erythropoietin ,EPO)分阶段首先诱导ESC形成富含CD 3 4 /Sca 1 细胞的胚胎体 (embryoidbody ,EB) ,然后分别观察EB细胞在甲基纤维素半固体培养体系和骨髓基质细胞饲养层培养体系中进一步分化为HSC的情况。结果VEGF联合其他细胞因子能有效促进EB中HSC的形成 ,CD 3 4 /Sca 1 细胞数高达 (13 72± 1 92 ) %。收获此阶段的EB进一步诱导发现 ,甲基纤维素培养体系造血克隆形成率明显低于骨髓基质细胞培养体系 ,在甲基纤维素中CD 3 4 /Sca 1 细胞数最高只能达到 (2 0 5 2± 2 78) % ,而基质细胞中CD 3 4 /Sca 1 细胞数可达 (34 6 0± 3 71) % (t=5 2 6 ,P <0 0 0 1)以上 ,且来自骨髓基质细胞培养体系的造血分化细胞在造血集落培养时能形成类型和数量更多的造血克隆。结论　使用VEGF联合SCF、IL 3、IL 6、EPO分阶段诱导ESC形成富含CD 3 4 /Sca     

经脑室神经干细胞移植对脑室周围白质软化新生大鼠的脑病理评估

目的：对经脑室植入神经干细胞（NSCs）的脑室周围白质软化（Periventricular leukolamacia，PVL）新生大鼠进行光镜下脑病理评估，探讨NSCs移植对治疗早产儿PVL的可行性。方法：采用E14胎鼠大脑皮层制备NSCs。2日龄新生大鼠随机分为PVL对照组（PVL组），PVL＋DMEM/F12培养基对照组（PVL＋DMEM/F12组），PVL＋神经干细胞（NSCs）移植组（PVL＋NSCs组），假手术对照组（Sham组），Sham＋DMEM／F12培养基对照组（Sham＋DMEM/F12组），Sham＋NSCs移植组（Sham＋NSCs组），每组18～21只。对2日龄PVL新生大鼠在建模后72 h进行经脑室NSCs移植，分别于移植后7，14，21 d进行光镜下脑病理评估。结果：随着移植后时间的增加，脑白质病变呈进一步改善。移植后21 d光镜下病理证实，未移植组脑白质呈轻度和重度病变各占50％，神经元病理评分为1.28±0.86。移植组则有30％白质完全正常，轻度和重度病变各占40％和30％，神经元病理评分为0.32±0.16，两组在脑白质病变程度以及神经元病理评分之间的差异均呈非常显著性意义（χ2＝10.7，P<0.01；F=29.664, P<0.01）。结论：经脑室外源性NSCs移植可明显改善脑白质的病理损伤。经脑室NSCs移植对早产儿PVL具有很大的治疗潜力，为今后成功防治早产儿这一最常见的脑损伤顽症提供了新的可行性途径。     

缺氧缺血性脑损伤发病中神经干细胞变化规律初探

目的：探讨缺氧缺血性脑损伤后神经干细胞(NSCs)的变化规律。方法：取新生7日SD大鼠随机分为正常对照组、缺氧组和缺氧缺血组。每组再根据处死时间点随机分成3 h,6 h,1 d,3 d,7 d,14 d,21 d 7个亚组(n=10)。缺氧缺血组大鼠分离并结扎左颈总动脉,置于密闭缺氧箱2.5 h,缺氧组不结扎血管,仅缺氧2.5 h。免疫组织化学检测海马、皮层及纹状体区阳性NSCs数。结果：正常7日龄大鼠脑组织存在NSCs,且呈明显的区域性分布,在10日龄后数目逐渐减少。缺氧组及缺氧缺血组大鼠NSCs较正常组增多,差异有显著性,在缺氧后3d(10日龄)时达高峰,后逐渐减少,缺氧组在缺氧后21 d(28日龄)时仍高于正常组。结论：H IBD发病中早期NSCs增殖;NSCs随着病情的演变开始减少;早期采用NSCs干预治疗可能为临床治疗H IBD提供重要途径。     

5-氮杂胞嘧啶核苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞凋亡

目的 研究5-氮杂胞嘧啶核苷(5-AZA)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡的影响.方法 从小鼠股骨和胫骨骨髓中分离BMSCs;利用免疫荧光染色检测间充质干细胞特异性标记分子CD44和CD90在BMSCs上的表达;应用0、10和20 μmol/L的5-AZA体外诱导培养BMSCs 48 h,应用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和荧光标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)凋亡试剂盒检测5-AZA处理后细胞的凋亡率;应用Western blot检测凋亡相关蛋白Annexin V和Caspase-3在处理后的细胞表达水平.结果 实验中,BMSCs阳性表达间充质干细胞特异性标记蛋白CD44和CD90.DAPI染色和Caspase-3染色均显示10和20 μmol/L 5-AZA可增加BMSC的凋亡率;对照组、10 μmol/L组5-AZA和20 μmol/L 5-AZA组DAPI染色阳性凋亡率分别为(21.086±2.601)％、(34.467 ±3.724)％和(46.512±3.864)％,Caspase-3染色阳性凋亡率分别为(5.354±0.735)％、(15.462±2.385)％和(28.190 ±4.190)％,组间比较差异均有统计学意义(P均＜0.01).Westernblot检测显示Annexin V和Caspase-3在5-AZA处理后表达均显著增高;对照组、10 μmol/L组5-AZA和20μmol/L 5-AZA组Annexin V相对表达水平分别为(26.612±2.184)％、(42.873 ±4.313)％和(50.056±4.457)％,Caspase-3的相对表达水平分别为(19.231 ±2.683)％、(38.618 ±5.385)％和(91.235 ±7.116)％,组间比较差异均有统计学意义(P均＜0.01).结论 常规剂量的5-AZA可诱导BMSCs凋亡.     

高压氧对移植的外源性人神经干细胞体内神经元分化的影响

目的：观察缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生大鼠移植人神经干细胞（hNSCs）后高压氧（HBO）对外源性hNSCs体内神经元分化的影响。方法：新生7 d的SD大鼠HIBD模型制作后3 d经脑室移植hNSCs,并分成移植组（n=8）和移植+HBO组（n=8）。移植+HBO组于移植后1 h进行HBO治疗,每日1次,10 d后断头取脑,应用免疫荧光方法检测植入细胞在皮层、海马神经元分化情况。结果：移植后10 d,植入细胞分化形成神经元,分布以海马、皮层为主。统计学结果表明,在皮层,两组分化的神经元计数差异无显著性（P>0.05）;而在海马区,移植+HBO组神经元分化存活的数量较单纯移植组多,差异有显著性（P<0.05）。结论：HIBD新生大鼠移植hNSCs后HBO促进海马区外源性hNSC向神经元的分化。     

牵张应力对儿童骨髓间充质干细胞体外增殖与向成骨分化的影响

目的观察周期性牵张应力对儿童骨髓间充质干细胞（MSCs）体外增殖活性与向成骨分化的影响。方法分离并培养儿童骨髓间充质干细胞，利用体外装置对3～6代细胞加载不同大小的牵张应力，相差显微镜观察细胞形态分布的变化，分别用细胞计数法、四甲基偶氮唑（MTT）和流式细胞仪检测细胞增殖、细胞周期及凋亡情况，同时检测碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）的活性。结果牵张应力干预MSCs后，细胞形态变长，沿受力环切线方向规则排列，细胞增殖能力增强，细胞周期比例改变，增殖指数增大，细胞凋亡则没有明显差别，ALP、OC的活性显著增强。结论适当的周期性牵张应力可以提高MSCs的增殖能力并促使细胞向成骨分化。