嗅觉图谱的建立——从嗅黏膜到嗅球

哺乳动物能精确地识别各种气味，除与嗅黏膜气味受体（olfactory receptor）和环境中化学分子之间一对一的结合方式有关外，前者在嗅黏膜的分布特点及嗅感觉神经元向嗅球的精确投射方式也起了很大作用，能使外界刺激信号通过这条特异性通路准确地到达大脑，从而形成各种感觉。本文就嗅黏膜与嗅球的受体蛋白表达特点及两者间嗅觉图谱的建立作一综述。     

P物质在慢性鼻窦炎嗅黏膜中的表达及其意义

目的 :探讨慢性鼻窦炎患者嗅觉功能障碍的发病机制。方法 :采用免疫组织化学方法对慢性鼻窦炎5 5例和对照组 11例的嗅黏膜进行P物质 (SP)检测 ;用苏木精 伊红染色方法观察嗜酸性粒细胞的浸润程度。结果 :鼻窦炎组嗅黏膜嗜酸性粒细胞阳性者 4 9例 (89.1% ) ,对照组 1例 (18.2 % ) ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;SP在慢性鼻窦炎嗅黏膜的嗅细胞、支持细胞、基底细胞、腺体、血管上皮及部分淋巴细胞、嗜酸性粒细胞中均有阳性表达 ,鼻窦炎组阳性表达 4 5例 (81.8% ) ,对照组 1例 (9.1% ) ,差异有统计学意义 (P <0 .0 1)。结论 :慢性鼻窦炎嗅黏膜的变态反应性改变是引起嗅觉功能障碍的主要因素之一 ,与SP在嗅黏膜中表达增高有关。     

外伤性嗅觉障碍大鼠嗅黏膜的组织学变化

目的 构建大鼠外伤性嗅觉障碍模型,观察不同时间点嗅黏膜组织学变化.方法 神经切断组(40只)和对照组(20只)大鼠均在显微镜下暴露左侧嗅球,沿筛板切断神经组切断大鼠左侧嗅神经.采用嗅觉诱发电位(olfactory evoked potentials,OEPs)和神经示踪验证造模效果.术后1天、5天、2周、3周、6周处理大鼠,处理前1天每组各取2只大鼠经鼻腔滴注辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP).嗅黏膜及嗅球冰冻切片后观察嗅上皮的厚度、细胞数量的变化以及嗅神经的连续性,并且行免疫组化观察嗅上皮中的新生嗅感觉神经元(olfactory receptor neurons,ORNs).结果OEPs及神经示踪证实手术方法可以完全切断嗅神经.术后1天,切断侧黏膜中ORNs出现凋亡,两组大鼠双侧嗅上皮厚度和细胞数量比值无明显变化.5天时切断侧嗅上皮中细胞数量减少,上皮厚度变薄,嗅球中无HRP标记纤维.术后2、3周大鼠嗅球中出现蓝色标记,嗅上皮厚度和细胞数量逐渐增加,但仍然与对照组有差异,此时嗅上皮中出现大量的新生ORNs.经过6周的恢复,嗅上皮厚度及细胞数量基本恢复至对照组水平,嗅上皮中有较多的新生ORNs,其轴突与嗅球重新建立神经联系,但是上皮中仍然有一定数量的凋亡细胞.结论 嗅神经切断术可以作为制作外伤性嗅觉障碍的可靠方法;由于ORNs具有再生能力,大鼠嗅神经切断后嗅黏膜在一定时间内基本恢复至正常水平.     

嗅上皮的组织块培养法

目的建立并优化组织块法嗅觉受体神经元（olfactory receptor neurons,ORNs）原代培养体系。方法以鼠尾胶原为培养底物,取新生小鼠鼻中隔和筛甲的嗅上皮进行原代培养。观察包括ORNs在内的各种细胞的形态和分布特点,经免疫组化和扫描电镜证实本原代培养体系内各种细胞的属性以及ORNs的分化程度。结果组织块培养法所得为一混杂的培养体系,除ORNs外还有基底细胞、嗅鞘细胞、纺锤形细胞及成纤维细胞等。其中基底细胞和纺锤形细胞在形态和免疫表型上均具有ORNs前体细胞的特点。优化培养体系后,可得到分化成熟的ORNs并可在体外稳定存活9天以上。结论本培养方法避免了使用消化酶,可以稳定的得到分化成熟的ORNs。     

倍他米松对大鼠离体嗅感觉神经元cAMP的影响

目的 观察倍他米松对大鼠嗅感觉神经元内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的影响，探讨糖皮质激素治疗嗅觉障碍的可能机制。方法取10只大鼠，提取嗅感觉神经元细胞膜蛋白，加入终质量浓度为0．1mg／ml和1．0mg／ml的倍他米松预孵育，采用酶联免疫吸附实验观察不同孵育时间点（5min和30min）环核苷酸门控通道（cyclic nucleotide-gated channel，CNG通道）配体cAMP生成量的变化。结果0．1mg／ml和1．0rag／ml倍他米松可提高大鼠嗅感觉神经元中cAMP生成量，同一时间点两个浓度相比差异具有统计学意义（P值均〈0．05）；倍他米松预孵育5min后即引起cAMP浓度的快速升高，直到30min仍维持较高水平，同一浓度两个时间点比较差异无统计学意义（P值均〉0．05）。结论倍他米松可使嗅感觉神经元内cAMP生成量增多，且1．0mg／ml倍他米松的作用大于0．1mg／ml的倍他米松。糖皮质激素对嗅觉障碍的治疗作用可能与嗅觉信号转导过程中腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷通路强化有关。     

嗅神经切断对小鼠嗅感觉神经元的影响

目的分析嗅神经切断对小鼠嗅感觉神经元（olfactory receptor neurons，ORN）凋亡情况的影响，并探讨这一造模方法的可靠件。方法取2月龄C57小鼠33只，随机分组后，实验组小鼠行嗅神经切断术，通过辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）顺行神经示踪验证造模成功与否。以脱氧核苷酸转移酶介导的牛物素dUTP缺口末端标记技术（TdT mediated deoxyuridine triphosphate—biotin nick end labelling，TUNEI。）观察术后8h、2d、3d和5d嗅上皮中ORN的凋亡情况，同时在蛋白和mRNA水平观察成熟ORN的特异性标记蛋白——嗅标记蛋白（olfactory marker protein，OMP）在嗅上皮巾的表达情况。结果嗅神经切断术后嗅球中无HRP标记。TUNEL和OMP阳性反应发生于ORN，嗅神经切断术后TUNEL阳性细胞数显著增多，并于术后第2天达到高峰，与此同时OMPmRNA的表达水平开始显著下降，并住术后第5天降至更低，嗅上皮的厚度也相应变薄。结论本实验所采取的造模方法可以较可靠地切断小鼠的嗅神经，并造成小鼠嗅上皮中ORN的同步凋亡。     

神经特异性烯醇化酶及嗅标记蛋白在不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达

目的 探讨神经特异性烯醇化酶(neuron—specific enolase，NSE)及嗅标记蛋白(olfactory marker protein，OMP)在不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达。方法 以免疫组化方法检测NSE及OMP在12、16、20、24，28和34周6例不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达。结果 NSE免疫阳性反应在孕12～34周的胎儿嗅黏膜中均有表达，各胎龄胎儿嗅黏膜切片中均可见大量阳性着色的双极嗅神经细胞。孕12周时，阳性细胞数量很多，排列紧密，胞体多位于嗅上皮中下部且阳性嗅神经上皮占据胎儿鼻腔上2／3的黏膜，随着孕龄的增大，阳性细胞逐渐成多层次排列，所占鼻腔黏膜面积却逐渐减小，至孕34周时，仅局限于鼻腔上1／3黏膜：0MP免疫反应在孕12周胎儿鼻腔上2／3黏膜切片中仅发现少量阳性着色的双极神经细胞，明显少于同龄胎儿NSE阳性反应细胞。随着胎龄的增加，0MP阳性细胞逐渐增多，且胞体多位于嗅上皮中上部，但其数量仍相对少于同龄NSE阳性细胞。结论 人胚胎12周时嗅黏膜中已有大量的嗅神经细胞，其中少数嗅神经细胞已开始发育成熟。随着胎龄的增大，嗅上皮面积逐渐缩小，但成熟的嗅神经细胞逐渐增多，胚胎发育后期的胎儿嗅化学感受器发育已趋于成熟。     

嗅神经切断术后白血病抑制因子在嗅上皮中的表达

目的分析白血病抑制因子(leukemiainhibi-toryfactor,LIF)与嗅感觉神经元(olfactoryreceptorneurons,ORNs)再生的关系。方法建立嗅神经切断的小鼠动物模型,在术后8小时、2天、3天和5天分别通过免疫组化和相对半定量RT-PCR的方法,在蛋白和mRNA水平观察LIF及其特异性受体LIF-R在嗅上皮中的表达情况。结果LIF和LIF-R的表达都是在术后8小时迅速、一过性地上升,随后又迅速恢复至对照组水平。LIF由残留的ORNs表达,LIF-R则由基底细胞和嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs)表达。结论LIF是在ORNs凋亡再生机制中较早表达的一种细胞因子,凋亡中的ORNs产生并分泌的LIF作用于基底细胞和嗅鞘细胞,从而启动调节ORNs再生的一系列分子机制。     

慢性鼻炎大鼠嗅黏膜损伤和嗅细胞凋亡的研究

目的:研究慢性鼻炎大鼠嗅黏膜超微结构和细胞凋亡情况,探讨慢性鼻炎性嗅觉损伤性疾病的发病机制,为开拓新的治疗途径提供思路。方法:应用TUNEL法测定20例慢性鼻炎大鼠嗅黏膜(鼻炎组)和20例正常大鼠嗅黏膜(对照组)中细胞原位凋亡情况。用光镜和透射电镜对鼻炎组和对照组大鼠的嗅黏膜进行形态学观察。结果:①透射电镜观察:鼻炎组大鼠部分嗅黏膜上皮细胞肿胀、脱落、坏死,细胞排列紊乱,细胞形态不规则;支持细胞核椭圆,其内染色质团块状凝聚、边集,细胞质密度下降;嗅细胞表面的纤毛减少、脱落,纤毛基体可见,脱落的纤毛分散于细胞间;细胞表面的微绒毛减少或消失,部分细胞核膜缺损,表现出细胞凋亡的形态学改变;细胞间有炎细胞浸润;基底膜裸露,细胞排列紊乱;嗅腺细胞呈柱状,细胞间隙加大,腔面内分泌物增多。对照组大鼠嗅黏膜上皮细胞排列整齐,支持细胞和嗅细胞呈间隔排列,基底膜完整,嗅腺结构完整,腔面微绒毛丰富,腔内有少量的浆液。②鼻炎组大鼠嗅黏膜中细胞凋亡指数显著高于对照组,经小样本均数t检验,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:慢性鼻炎大鼠嗅黏膜可出现由表及里的超微结构变化,嗅上皮和固有层中均存在显著的细胞凋亡。     

胚胎型神经细胞黏附分子在人嗅黏膜内的发育表达

目的：探讨胚胎发育期人嗅黏膜内胚胎型神经细胞黏附分子(E-NCAM)的表达变化规律及生理功能。方法：使用免疫组织化学方法对人胚胎发育不同时期嗅黏膜内E-NCAM的表达情况进行检测。结果：E-NCAM的表达开始于胚胎发育的第14周，阳性反应位于嗅神经元细胞胞体、树突、轴突及固有层内的嗅神经纤维束；随胚胎发育阳性细胞数目逐渐增多，嗅神经纤维束染色逐渐增强；第28周达峰值后逐渐下降。在发育不同时期，E-NCAM阳性细胞均位于黏膜层的中下部分，黏膜顶层的支持细胞和嗅神经元胞核不表达E-NCAM。结论：E-NCAM的表达同相应的神经元可塑性变化有一致的时序，在胚胎发育前期E-NCAM的高表达，有助于正在分化的神经元生长；发育后期E-NCAM表达下调，有助于成熟神经元细胞的形态结构的稳定性。     

嗅感觉神经细胞的分离与培养

目的 建立哺乳动物嗅感觉神经细胞体外培养的方法。方法取成年家兔的嗅区粘膜,用胰酶和胶原酶消化法进行嗅感觉神经细胞的分离与原代培养,并应用抗神经微丝蛋白(NFP)抗体、抗嗅觉标记蛋白(OMP)抗体进行免疫细胞化学染色,同时采用甲苯胺蓝神经特异性染色和扫描电镜对其进行鉴定。结果 从嗅粘膜分离以及原代培养得到的嗅感觉神经元,光镜、电镜下为典型的双极神经元,OMP、NFP阳性,神经元特异性染色阳性。分离的嗅感觉神经元可在体外存活数小时,其细胞形态、生存数量和存活时间均能满足体外实验的基本要求。结论 本实验在家兔建立了较稳定、可靠的嗅感觉神经细胞分离和原代培养方法。为深入开展嗅感觉神经细胞的离体研究,提供了较为理想的材料来源和技术保障。     

上呼吸道感染后嗅觉障碍患者嗅上皮超微结构观察

目的通过对上呼吸道感染后嗅觉障碍的患者鼻腔大体及嗅上皮超微结构的研究，从形态学上观察嗅觉减退或丧失的超微结构改变。方法选择上呼吸道感染后嗅觉减退或丧失患者10例，用T＆T嗅觉测试法测试患者的嗅觉功能。常规前鼻镜、鼻内镜下对鼻腔大体结构进行观察，鼻内镜下钳取嗅区黏膜行透射电镜超微结构观察。结果上呼吸道感染后嗅觉障碍患者嗅黏膜超微结构有以下变化：①嗅上皮结构层次仍能保持，但细胞间隙增宽；②上皮表面嗅泡明显减少，即使嗅泡存在，其末端的纤毛也明显减少，部分嗅泡呈空泡状改变；③微绒毛细胞和支持细胞表面的微绒毛减少或缺失；④支持细胞的细胞核变形或固缩，嗅细胞的树突水肿变形，细胞器减少。结论上呼吸道感染后嗅觉功能障碍与嗅黏膜上皮超微结构的改变密切相关。患者嗅泡及嗅泡内纤毛缺失，微绒毛细胞及支持细胞的微绒毛减少是引起嗅觉减退的主要原因，支持细胞胞核的变形及嗅细胞树突的形态学改变与嗅觉改变相关。     

嗅球摘除后嗅觉神经元凋亡的实验研究

目的研究凋亡是否参与嗅上皮正常生理更替和嗅球摘除后嗅觉神经元死亡而后再生的过程,探讨凋亡与神经元再生的关系。方法应用原位末端标记法和透射电镜观察正常成年大鼠以及摘除嗅球后大鼠嗅上皮16、32、48 h和3、7、30 d时凋亡的出现和改变情况。结果正常成年大鼠嗅上皮中有末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(TUNEL)的阳性细胞(1.93±0.31)个/200μm。摘除嗅球后TUNEL阳性细胞数增加,32 h达峰值(90.9±18.03)个/200μm,以后迅速下降,维持于低水平。透射电镜下见嗅球摘除术后嗅觉神经元出现胞质浓缩、胞核染色质边聚等细胞凋亡的特征性超微结构改变。尚可见少量胞质内出现自噬泡以及除线粒体以外的细胞器扩张,但胞核正常的嗅觉神经元。结论凋亡参与成年大鼠嗅觉神经元生理性更替以及实验性嗅觉神经元死亡和再生的过程。此外,尚存在自噬型和胞质型神经元死亡。     

The effect of basic fibroblast growth factor on the regeneration of guinea pig olfactory epithelium

Olfactory receptor cells are widely thought to regenerate after degeneration and also thought to show turnover in normal circumstances in animal olfactory epithelium. The identity of the factor that controls proliferation and differentiation of olfactory receptor cells is a very important problem that has yet to be resolved. In this study, the mitogenic effects of epidermal growth factor (EGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) on olfactory receptor cells in guinea pig olfactory epithelium was examined. The intraperitoneal injection of 1,000 ng bFGF/day for 14 days increased the cells in proliferation detected by immunostaining with proliferating cell nuclear antigen (PCNA), while neither EGF nor low-dose bFGF had any effect. These results support the idea that an adequate dose of bFGF plays an important role in the neurogenesis in the olfactory epithelium. Further study is needed to clarify the efficacy of bFGF in the damaged olfactory epithelium, but bFGF may provide a therapeutic option for olfactory disturbances caused by complete or partial loss of olfactory receptor cells. Received: 3 October 2001 / Accepted: 10 October 2001     

分鼻侧评估嗅觉功能及单侧嗅觉减退的临床分析

目的 了解嗅觉减退患者左右两侧嗅觉功能损伤程度是否相同.方法 对104例以嗅觉减退为主诉的患者,通过病史采集了解嗅觉减退的相关病史及其现况,耳鼻咽喉科常规检查及鼻窦CT检查排除鼻腔结构异常或仅发生于单侧鼻腔-鼻窦的病变,并分别对左、右鼻侧进行T&T嗅觉计嗅觉识别阈测试,评估患者每侧嗅觉功能.结果 本组104例嗅觉减退患者,90例(86.5％)患者双侧嗅觉功能水平相同,14例(13.5％)患者双侧嗅觉功能水平不同,其中6例患者表现为单侧(左侧或右侧)嗅觉功能正常,而另一侧嗅觉功能减退.14例左右鼻侧嗅觉功能不同的患者,其常规查体及影像学检查均未见明显鼻腔结构异常或发生于单侧鼻腔鼻窦的病变.结论 人类的左、右两个鼻腔分别拥有一个完整的嗅觉传导系统,尽管双侧受损概率相同,但受损程度可不同.单侧嗅觉减退作为嗅觉障碍的一种特殊表现形式,只有通过分鼻侧进行嗅觉功能评估,才能更全面地了解患者的嗅觉功能.     

神经特异性烯醇化酶及嗅标记蛋白在不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达

目的　探讨神经特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE)及嗅标记蛋白 (olfactorymarkerprotein ,OMP)在不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达。方法　以免疫组化方法检测NSE及OMP在1 2、1 6、2 0、2 4、2 8和 34周 6例不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达。结果　NSE免疫阳性反应在孕 1 2～ 34周的胎儿嗅黏膜中均有表达 ,各胎龄胎儿嗅黏膜切片中均可见大量阳性着色的双极嗅神经细胞。孕1 2周时 ,阳性细胞数量很多 ,排列紧密 ,胞体多位于嗅上皮中下部且阳性嗅神经上皮占据胎儿鼻腔上2 /3的黏膜 ,随着孕龄的增大 ,阳性细胞逐渐成多层次排列 ,所占鼻腔黏膜面积却逐渐减小 ,至孕 34周时 ,仅局限于鼻腔上 1 /3黏膜。OMP免疫反应在孕 1 2周胎儿鼻腔上 2 /3黏膜切片中仅发现少量阳性着色的双极神经细胞 ,明显少于同龄胎儿NSE阳性反应细胞。随着胎龄的增加 ,OMP阳性细胞逐渐增多 ,且胞体多位于嗅上皮中上部 ,但其数量仍相对少于同龄NSE阳性细胞。结论　人胚胎 1 2周时嗅黏膜中已有大量的嗅神经细胞 ,其中少数嗅神经细胞已开始发育成熟。随着胎龄的增大 ,嗅上皮面积逐渐缩小 ,但成熟的嗅神经细胞逐渐增多 ,胚胎发育后期的胎儿嗅化学感受器发育已趋于成熟     

Age-related changes in dividing cells of the olfactory epithelium of the maturing guinea pig

Changes in dividing cells of the olfactory epithelium from guinea pigs of different ages were examined by immunohistochemical staining using anti-proliferating cell nuclear antigen antibody. Numerous dividing cells were scattered diffusely in the basal layer of the olfactory epithelium at 1 and 2 months following birth and then gradually decreased with maturation until 4 months. Findings then remained constant between 4 and 24 months. Subsequently, cell numbers were found to decrease as animals became older. The number of olfactory receptor cells did not vary significantly between 1 and 30 months. Although no correlation could be found between the numbers of dividing cells and olfactory receptor cells, it is still possible that the longevity of the olfactory receptor cells changes to maintain the overall size of the neuronal population. Received: 18 February 1998 / Accepted: 9 April 1998