siRNA抑制人卵巢癌SKOV-3细胞MDM2的表达及细胞增殖的研究

目的 研究siRNA对人卵巢癌细胞SKOV-3细胞MDM2基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法 体外合成2对针对MDM2基因的siRNA,经脂质体转染导入SKOV-3细胞;转染siRNA MDM2(简称si-MDM2)转染阴性对照质粒到SKOV-3,并设只加转染试剂作空白对照组,采用MTT法检测si-M...     

siRNA抑制人肝癌细胞MDM2表达及细胞增殖的研究

目的探讨siRNA对人肝癌HepG2细胞MDM2基因表达的抑制作用及对增殖的影响。方法体外合成针对MDM2基因的siRNA质粒,转染HepG2细胞株;应用RT-PCR和western blot方法检测siRNA对MDM2和P53基因和蛋白表达的影响,并用MTT法检测siRNA对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期。结果和空白组比转染siMDM2-1,2的HepG2细胞的MDM2基因和蛋白表达减低,而P53基因和蛋白表达增加。阴性对照质粒组的基因表达未见明显改变。转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,转染siMDM2-1,2和阴性对照质粒后的抑制率分别是46.3%、56.1%和3%。和对照组比较,转染siMDM2-1,2的hepG2细胞的细胞周期发生明显改变,而转染对照质粒的hepG细胞周期未发生明显变化。结论 siRNA MDM2可以有效抑制HepG2细胞株中MDM2的表达,促进P53的表达,同时可以使细胞周期发生变化,这可能是其抑制肿瘤细胞增殖的主要机制之一。     

实时荧光定量RT-PCR检测siRNA表达载体抑制人肾癌786-0细胞G250 mRNA的表达

目的评价实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测小干扰RNA（siRNA）表达载体抑制人肾癌786-0细胞G250 mRNA表达的可靠性,以建立稳定的RNAi技术。方法体外合成四条针对G250基因的siRNA,并设计阴性对照和空白对照,转染肾癌786-0细胞株;根据G250 mRNA的序列设计特异性引物,荧光染料SYBR Green Ⅰ法定量RT-PCR测定G250 mRNA的表达情况。结果四条siRNA分别使G250 mRNA表达量降低了35.56%、49.27%、45.88%、65.13%,阴性对照和空白对照组无明显变化。结论实时荧光定量RT-PCR技术可以准确地检测mRNA的表达,可以用来评价siRNA的有效性。     

神经胶质瘤中生长抑制因子基因的表达

目的：探讨ING4基因在神经胶质瘤发生发展过程中的作用。方法：采用RT-PCR方法扩增 34名神经胶质瘤患者手术标本和24例正常脑组织标本的ING4基因和内参照GAPDH基因，凝胶分析软件对RT-PCR产物进行半定量分析，比较ING4基因mRNA在神经胶质瘤和正常脑组织中的表达情况。结果：所有的标本均扩增出ING4基因的目的条带。神经胶质瘤中的ING4基因mRNA表达水平明显低于正常脑组织（P <0.05）。恶性度高的神经胶质瘤组明显低于低度恶性神经胶质瘤组（P <0.05）。结论：ING4基因在神经胶质瘤的发生发展过程中可能起一定的作用，且与恶性程度有一定相关性。     

脑胶质瘤易感性与MDM2基因SNP309多态性的关系

目的探讨MDM2基因SNP309多态性和胶质瘤易感性的关系。方法提取MDM2基因SNP309多态性与脑胶质瘤易感性关系的数据,筛选出符合条件的数据,应用Meta分析技术软件对各项数据进行异质性检验,计算合并相对危险度（OR）值及95％可信区间（a）,并行敏感性分析和发表便宜的评估。结果该研究中共有6组符合条件的数据,病例组1,358例、对照组933例。Meta分析合并结果显示,MDM2基因SNP309多态性在等位基因模型和杂合子基因模型下能够增加亚洲人种组脑胶质瘤的发病风险,等位基因模型：P=0．005,OR=1．39,95％CI1．11～1．74,P异质性=0．67;杂合子基因模型：P=0．003,OR=2．06,95％CI1．29～3．30,P异质性=0．76。敏感性分析表明合并结果不受单个研究的影响。结论MDM2基因SNP309多态性能够增加亚洲人脑胶质瘤的发病风险。     

siRNA对骨肉瘤U2OS细胞株MDM2-mRNA表达的抑制作用

目的 研究载体介导的siRNA（small interfere RNA）技术对骨肉瘤细胞株U20S中MDM2-mRNA表达的抑制作用.方法 依据设计siRNA的原则,以MDM2为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体PGCsilencerTM中构建重组体（PGCsilencerTM-MDM2 siRNA）.实验分转染重组质粒组,转染阴性对照质粒组和只加脂质体的空白组;RT-PCR法观察U20S细胞中MDM2-mRNA表达改变.结果 成功构建发卡样MDM2 siRNA真核表达载体（PGCsilencer TM-MDM2 siRNA）;PGCsilencer TM-MDM2 siRNA转染到U20S细胞后,MDM2-mRNA表达较空白组显著下降（P＜0.05）,转染阴性对照质粒组与空白组无显著差异（P＞0.05）.结论 成功构建PGCsilencer TM-MDM2 siRNA重组体,并能有效抑制U20S细胞中MDM2-mRNA表达.     

siRNA抑制人膀胱癌T24细胞株VEGF 的表达及细胞增殖

目的探讨siRNA（small interfering RNA）对T24人膀胱癌细胞株VEGF基因表达的抑制及癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。方法体外构建两个针对VEGF基因的siVEGF的重组质粒，转染124细胞；应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定VEGF基因的表达，并用MTT法和流式细胞仪检测siVEGF对细胞的增殖抑制率和凋亡的影响。结果构建的两个siVEGF重组质粒分别使VEGF基因表达下调到空白组的21．02％和30．13％；control siRNA组的VEGF基因表达与空白组无明显差异。转染siVEGF后T24细胞生长受到抑制，并发生细胞凋亡，凋亡率分别为45．5％和35．9％。结论siVEGF可以有效抑制124细胞株中VEGF的表达，从而抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡。     

人脑胶质瘤中RhoA的表达及其临床意义

目的研究RhoA在人脑胶质瘤组织中的表达情况及其与病理分级的相关性,探讨RhoA在胶质瘤的诊断、恶性程度及预后判断中的临床意义。方法采用SABC免疫组化法、RT-PCR法对53例不同病理级别的星形细胞瘤及9例正常脑组织标本,进行RhoA蛋白和RhoA mRNA的检测。结果 (1)免疫组化结果显示53例胶质瘤组织中RhoA蛋白表达全部呈阳性,对照组正常脑组织存在弱表达或不表达。(2)不同级别星形细胞瘤标本的RhoA阳性细胞率、RhoA mRNA与GAPDH mRNA灰度比值均存在差异;Ⅰ级和Ⅲ、Ⅳ级之间差异有统计学意义(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ级RhoAmRNA表达均高于Ⅰ级;Ⅱ级和Ⅲ、Ⅳ级之间差异有统计学意义(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ级RhoAmRNA表达均高于Ⅱ级。(3)相关性分析:RhoA阳性细胞率和RhoA mRNA表达量与胶质瘤病理分级均呈正相关性(r=0.875,r=0.817,P<0.001)。结论 (1)RhoA在所有已检测的胶质瘤标本中均存在表达,且表达程度与胶质瘤病理分级呈正相关。检测RhoA的mRNA和(或)蛋白的表达,可以作为胶质瘤诊断、判断预后的一个可靠指标。(2)RhoA表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关,提示我们可以将其作为星形细胞瘤Ⅰ～Ⅳ级新的有效的诊断标记物,同时作为常规组织病理学的分级标准的补充。这将有助于描述肿瘤的生物学行为特征,选择术后进一步的治疗方案。     

染色体22q12上THOC5和ADRBK2基因在人脑胶质瘤组织中mRNA表达

目的观察位于染色体22q12上的THOC5和ADRBK2基因在人脑胶质瘤肿瘤组织中mRNA表达。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及图像分析方法,检测17例人脑胶质瘤肿瘤组织和8例正常人脑组织中THOC5和ADRBK2基因mRNA表达。基因表达水平用THOC5或ADRBK2基因/β-肌动蛋白(β-actin)灰度比值×100表示。结果ADRBK2基因在正常人脑组织和人脑胶质瘤肿瘤组织中,均存在弱表达,统计分析显示无显著性差异(P0.05);THOC5基因在正常人脑组织中弱表达,在人脑胶质瘤肿瘤组织中高表达。统计分析显示:人脑胶质瘤肿瘤组织中THOC5基因mRNA表达与正常人脑组织中THOC5基因mRNA表达比较,有显著性差异(P0.05)。结论THOC5基因高表达可能与胶质瘤的发生、发展相关。     

Livin α,β在人脑胶质瘤中的表达及临床意义

目的 探讨Livin α,β基因在脑胶质瘤中的表达及意义.方法 采用荧光实时定量PCR技术检测122例人脑胶质瘤组织及其33例邻近正常脑组织,10例良性脑肿瘤中的Livin α,βmRNA及内参Gapdh的表达水平.结果 Livin α在脑胶质瘤及其邻近正常脑组织,良性脑肿瘤中的表达无统计学意义;Livin β在高分化组(67例)的表达明显高于低分化组(55例)(P<0.05),两组分别与良性脑肿瘤组(10例)比较差异有统计学意义(P<0.05),其中33例胶质瘤与邻近正常脑组织比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 Livin βmRNA在胶质瘤的发生及发展中起重要作用.     

MDM2在食管鳞癌中的表达及其意义

目的探讨MDM2蛋白在食管鳞癌中的表达及其意义。方法采用免疫组化SP法分别对49例食管鳞癌组织、30例癌旁非典型增生组织及49例正常黏膜组织中MDM2蛋白的表达进行检测。结果正常食管黏膜组织MDM2蛋白阳性表达率为30．61％（15／49）,非典型增生组织MDM2蛋白阳性表达率为60．33％（19／30）,食管鳞癌组织中MDM2蛋白阳性表达率为87．76％（43／49）;三者两两相比,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论MDM2蛋白表达与食管鳞癌的发生发展有关。     

Bcl-2 siRNA对淋巴瘤细胞系CA46凋亡的影响

本研究探讨bcl-2 siRNA对淋巴瘤细胞系CA46凋亡及bcl-2基因表达的影响。设计并合成1条siRNA,用阳离子脂质体法转染CA46细胞。转染后48小时收集CAd6细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡及凋亡过程中线粒体跨膜电位改变,用RT—PCR方法和流式细胞仪分别检测CA46细胞bcl-2 mRNA和BCL-2蛋白的表达。结果表明：bcl-2 siRNA转染CAd6细胞48小时后,CA46细胞出现凋亡且线粒体跨膜电位发生变化;bcl-2 mRNA和BCL-2蛋白表达均显著降低。结论：bcl-2 siRNA可特异性抑制淋巴瘤细胞CA46 bcl-2基因的表达,改变CA46细胞线粒体跨膜电位诱导其凋亡。     

Functionalization of single-walled carbon nanotubes enables efficient intracellular delivery of siRNA targeting MDM2 to inhibit breast cancer cells growth

The delivery of DNA or RNA to cells represents the limiting step in the development of cancer gene therapy and RNA interference protocols. Single walled carbon nanotubes (SWNTs) are of interest as carriers of biologically active molecules because of their ability to cross cell membranes. In this study, we developed a novel strategy for chemical functionalization of SWNTs (f-SWCNTs) with DSPE-PEG-Amine to bind small interfering RNA (siRNA) by disulfide bonds applied to siRNA-mediated gene silencing in breast cancer cells. Results indicated the efficiency of f-SWNTs carrying siRNA reached 83.55%, and the new f-SWNTs-siRNA-MDM2 complexes were successfully introduced into the breast carcinoma B-Cap-37 cells at a concentration of 100 nM in mediums, and caused proliferation inhibition of B-Cap-37 cells significantly. The proliferation inhibition ratio of B-Cap-37 cells was detected as 44.53% for 72 h, and the apoptosis ratio was measured as 30.45%. It was obvious that MDM2 can serve as a novel therapeutic target by an effective carrier system of DSPE-PEG-Amine-functionalized SWNTs, which would be very advanced and significant to therapy of breast cancer further.     

siRNA对骨肉瘤U20S细胞株MDM2-mRNA表达的抑制作用

目的 研究载体介导的siRNA(small interfere RNA)技术对骨肉瘤细胞株U20S中MDM2-mRNA表达的抑制作用.方法 依据设计siRNA的原则,以MDM2为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体PGCsilencerTM中构建重组体(PGCsilencerTM-MDM2 siRNA).实验分转染重组质粒组,转染阴性对照质粒组和只加脂质体的空白组;RT-PCR法观察U20S细胞中MDM2-mRNA表达改变.结果 成功构建发卡样MDM2 siRNA真核表达载体(PGCsilencer TM-MDM2 siRNA);PGCsilencer TM-MDM2 siRNA转染到U20S细胞后,MDM2-mRNA表达较空白组显著下降(P＜0.05),转染阴性对照质粒组与空白组无显著差异(P＞0.05).结论 成功构建PGCsilencer TM-MDM2 siRNA重组体,并能有效抑制U20S细胞中MDM2-mRNA表达.     

siRNA特异性抑制HEL细胞evi1基因的实验研究

本研究探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默人红白细胞白血病细胞（HEL）的evi1基因后对细胞evi1基因表达的抑制作用及细胞生物学特征变化及其作用机制。体外合成3条evi1基因特异性的siRNA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3）并转染HEL细胞,并设对照。用四甲基偶氮唑蓝法评价细胞增殖抑制情况,半定量逆转录聚合酶链反应（semiquantitative RT-PCR）检测evi1基因mRNA的表达,台盼蓝染色试验测定细胞活性的变化,流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡率。结果显示,细胞转染24、48、72小时后,以siRNA-1作用最强,转染后48小时抑制作用最明显。siRNA浓度为120nmol/L时,抑制率达到最大。转染48小时后siRNA-1对HEL细胞的增殖抑制率为（72.22±2.80）%,evi1-mRNA相对表达率为（27.31±1.11）%,HEL细胞活率为（26.05±2.49）%,与其他各组相比有显著性差异（p〈0.001）。siRNA可使细胞周期阻滞在G0/G1期,S期细胞明显减少,凋亡率明显增高（p〈0.01）。结论：evi1基因特异性siRNA可抑制HEL细胞增殖,使evi1-mRNA表达水平降低,细胞活性下降,HEL细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制细胞的有丝分裂,促进细胞凋亡。     

Mdm2、p53在乳腺癌中的表达及意义

目的研究Mdm2、P53蛋白在乳腺肿瘤组织中的表达及临床意义。方法应用免疫组化SP法检测Mdm2、P53蛋白在不同组织学类型乳腺癌60例、正常乳腺组织20例中的表达。结果Mdm2、P53蛋白在乳腺癌组织中阳性表达率与正常乳腺组织比较差异有统计学意义（P〈0．01）。Mdm2、P53蛋白表达与肿瘤大小比较无差异（P〉0．05）,在临床分期、腋窝淋巴结转移之间比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论Mdm2、P53蛋白在乳腺癌组织中的异常表达,说明在乳腺癌的发生及发展中起重要作用。     

siRNA对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制

为了探索CML的治疗新思路研究了siRNA(small interfering RNA)对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制作用。制备特异性对应bcr-abl融合基因的siRNA，转染K562细胞株，采用RT-PCR法测定bcr-abl融合基因mRNA的表达。结果表明：siRNA对bcr-abl基因表达的抑制作用随浓度的增加而增强，0.2ug siRNA能使bcr-abl融合基因mRNA的表达在24和48小时分别降低至对照组的19.9％和26.6％，但72小时时恢复到原水平，同时转染siRNA后细胞生长受到抑制。结论：siRNA可以有效的抑制K562细胞株中bcr-abl融合基因的表达。     

高分化及去分化脂肪肉瘤MDM2的检测及其临床意义

目的研究高分化及去分化脂肪肉瘤石蜡包埋组织中MDM2基因和蛋白表达的可行性及临床意义。方法收集17例高分化及去分化脂肪肉瘤,对照组肿瘤标本18倒,均为甲醛固定石蜡包埋组织,MDM2基因检测用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法,以看家基因β-actin为内参照。蛋白检测用免疫组化EnVision二步法。结果用RT-PCR法检测的10例高分化及去分化脂肪肉瘤均有MDM2基因表达,而对照组肿瘤标本只检测到β-actin基因,未检测到MDM2基因。17例高分化及去分化脂肪肉瘤MDM2蛋白表达率显著高于18例对照组肿瘤标本（P〈0.05）。结论在高分化和去分化脂肪肉瘤石蜡包埋组织中,RT-PCR法检测MDM2基因和免疫组化法检测MDM2蛋白可行,且两者结果对其诊断和鉴别诊断有意义。