人内皮型一氧化氮合酶基因在小鼠肺内的表达

目的 观察人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)重组腺病毒感染小鼠肺组织后heNOS基因在小鼠肺组织内的表达.方法 采用反转录PCR(RT-PCR)法克隆heNOS基因,利用体外连接法构建复制缺陷型heNOS重组腺病毒表达载体;免疫组织化学分析heNOS在小鼠肺组织内的表达情况.结果 (1)序列分析表明,克隆所得heNOS基因片段含有完整开放阅读框架,与GenBank中heNOS DNA序列(*163729)同源性达99.93%.(2)该基因在转染细胞中能表达具有生物活性功能的NOS蛋白.(3)体外连接法成功构建出复制缺陷型heNOS重组腺病毒转移载体.(4)滴入heNOS重组腺病毒后,小鼠肺血管内皮细胞、平滑肌细胞、细支气管上皮细胞内heNOS阳性表达明显增加.结论 本实验成功构建的复制缺陷型heNOS重组腺病毒转移载体,能经呼吸道转移至肺组织,并在小鼠肺血管、支气管和肺泡上皮细胞表达所需的目的 蛋白heNOS.     

IL-12双亚基共表达载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人IL-12（hIL-12）p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）。方法根据hIL-12p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增，将扩增所得p40和p35片段采用overlap PCR法拼接，获得的rhIL-12融合基因与pGEM—TEasy质粒连接，将鉴定正确的pGEM—T／rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3．1（＋）真核表达质粒中，构建pcDNA3．1（＋）／rhIL-12真核表达载体，并进行测序鉴定。将鉴定正确的pcDNA3．1（＋）／rhIL-12经脂质体介导转染hMSC，同时以转染pcDNA3．1（＋）空质粒作为对照组，在倒置显微镜下观察细胞生长形态；在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达；另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天，采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平。结果PCR扩增结果显示特异性扩增出p40（1000bp）、p35（600bp）、rhIL-12（1600bp）片段，均与预期DNA表达片段大小一致。pcDNA3．1（＋）／rhIL-12测序显示克隆的rhlL-12基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察，可见转染pcDNA3．1（＋）／rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异。蛋白质印迹和ELISA检测显示，转染pcDNA3．1（＋）／rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL-12融合蛋白的持续表达；而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达。结论成功构建了hIL-12p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3．1（＋）／rhIL-12，为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

人CD81分子的肝组织特异性稳定表达

目的：用肝组织特异性启动子，实现人CD81分子在小鼠肝癌细胞Hepa 1—6中的稳定表达。方法：从能感染丙型肝炎病毒(HCV)的人肝癌细胞系HepG2中提取RNA，用随机引物合成cDNA的第1条链，然后用人CD81基因的特异性引物进行PCR扩增，克隆PCR扩增片段。将经测序证明为人CD81基因的正确序列，连接到肝特异性启动子的下游，使CD81基因的3′端与SV40polyA加尾序列融合，得到肝组织特异性表达的人CD81融合基因片段。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3中，转染小鼠肝癌细胞系Hepa 1—6。经G418加压筛选后，分别用RT—PCR检测人CD81 mRNA的转录，用FACS检测人CD81蛋白的表达。结果：克隆序列的测序结果与GenBank中登录的序列进行对比表明，得到了人CD81 cDNA的正确序列。构建的人CD81肝特异性融合基因片段可稳定转染Hepa 1-6细胞，并可检测到人CD81在mRNA水平上的转录和在蛋白质水平上的稳定表达。结论：由于CD81是HCV的感染受体，稳定表达HCV感染受体-人CD81分子的小鼠肝癌细胞克隆的获得，为今后研究HCV包膜蛋白与CD81的相互作用、筛选感染阻断药物，以及发展HCV感染的小鼠动物模型奠定了基础。     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建peDNA3．1（-）／NNMT（尼克酰胺-N-甲基化酶）真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1／NNMT重组质粒中克隆得到NNMT cDNA全长序列,并将扩增的eDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-）中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT—PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功．经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定

目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因转染至肝癌细胞．方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因，将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN—SEA重组质粒，再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞，用RT—PCR和ELISA法鉴定．结果从产SEA标准菌株ATCCl3565中提取并扩增出SEA基因全长片段；SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN，经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致；将pLXSN—SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402，经筛选获得稳定表达的抗性单克隆．RT—PCR扩增出约800bD的基因片段，经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平．结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体，将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL－7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白．     

HCV NS5A基因在hepG2细胞中的表达以及对PI3K的影响

目的：探讨HCV—NS5A对PI3K表达的影响。方法：应用PCR技术从含有HCV全长开放阅读框的质粒中获得NS5A全长基因片段，利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．0（-）中。通过酶切、PCR及测序鉴定，NS5A基因已正确插入到pcDNA3．0（-）中，再利用脂质体转染HepG2细胞。结果：经RT—PCR及Western blot检测，HCV的NS5A基因在HepG2细胞中获得表达，而且在表达重组NS5A的转染HepG2细胞中，检测到PI3K蛋白的表达。结论：NS5A可在体外激活PI3K及其信号通路。     

IL-12双亚基共表达载体的构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

 目的 构建人 IL-12（hIL-12）p40 和 p35 双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）。方法 根据 hIL-12 p40 和 p35 亚基全长 cDNA 序列分别设计合成引物行 PCR 扩增，将扩增所得 p40 和 p35 片段采用 overlap PCR 法拼接，获得的 rhIL-12 融合基因与 pGEM-T Easy 质粒连接，将鉴定正确的 pGEM-T/rhIL-12 重组质粒克隆至 pcDNA3.1（+）真核表达质粒中，构建 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 真核表达载体，并进行测序鉴定。将鉴定正确的 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 经脂质体介导转染 hMSC，同时以转染 pcDNA3.1（+）空质粒作为对照组，在倒置显微镜下观察细胞生长形态；在转染后第 4 天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中 rhIL-12 融合基因的表达；另分别在转染后第 2、4、6、8、10、12、14 天，采用 ELISA 方法检测细胞培养上清液中 rhIL-12 融合基因的表达水平。 结果 PCR 扩增结果显示特异性扩增出 p40（1000 bp）、p35（600 bp）、rhIL-12（1600 bp）片段，均与预期 DNA 表达片段大小一致。pcDNA3.1（+）/rhIL-12 测序显示克隆的 rhIL-12 基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察，可见转染 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 的 hMSC 生长形态和生长速度与对照组 hMSC 相比均无明显差异。蛋白质印迹和 ELISA 检测显示，转染 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 的 hMSC 培养上清液中可见 rhIL-12 融合蛋白的持续表达；而对照组中均未检测到 rhIL-12 融合蛋白表达。 结论 成功构建了 hIL-12 p40 和 p35 双亚基真核共表达载体 pcDNA3.1（+）/rhIL-12，为利用 hIL-12 进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。     

小鼠SLC基因真核表达载体的构建及其趋化活性鉴定

目的：克隆小鼠次级淋巴样组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine，SLC)基因，并构建真核表达载体。在体内外检测该表达载体表达产物的免疫趋化功能。方法：用RT—PCR从C57BL／6小鼠胸腺组织中克隆小鼠SLC基因，构建真核表达载体pcDNA3．1—msLC。在体外，用基因枪转染小鼠黑色素瘤B16F10细胞；RT—PCR检测转染细胞有SLC的表达；利用趋化小室法，检测表达产物针对淋巴细胞的趋化活性。在体内，用基因枪通过小鼠皮肤局部转染SLC基因，观察转染局部淋巴细胞的浸润。结果：克隆的基因经测序证实，为小鼠SLC基因Scya21b型。转染SLC基因的B16F10细胞体外培养48h后，RT—PCR检测到SLC的表达，同时培养基上清具有针对淋巴细胞的趋化活性。通过基因枪局部转染小鼠皮肤，24h后皮肤病理检查显示，局部皮内有明显的淋巴细胞浸润。结论：从小鼠胸腺组织中克隆到小鼠SLC基因，构建的真核表达载体pcDNA3．1—mSLC在体内外均可以表达，并具有针对淋巴细胞的趋化活性。     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的：构建CD80/IgG真核表达载体，使其在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中呈分泌型表达，为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法： 采用多聚酶链反应（PCR）技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA（cDNA） 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中，获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG；采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株；免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果： DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点，CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达，其分子量大小和预期的基本一致，该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论： 成功构建pcDNA／CD80-IgG真核表达载体，并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。     

Construction of the recombinant expression vector for CD80-IgG fusion gene and its expression in Chinese hamster ovary cells

Itiswellestablishedthatoptimalactivationof na veTcellsrequiressignalingthroughtheT cell receptoraswellasthroughothercostimulatorypathways.Na veTcellswillbecomenonrespons ive,anergicorapoptoticifthetumorantigenispr esentedtothemwithoutthecostimulatorysignal,whichmakestumorcellsescapefromtheimmuno surveillance.Oneofthemostimportantcostimula torysignalsofthiskindcanbeprovidedbythein teractionofB7.1(CD80)onantigen presenting cells(APC)withCD28onTcells.Acutemyelogenousleukemia(AML)cellsarenot…     

CD80/IgG融合基因重组表达载体的构建及在CHO细胞中功能性表达的研究

目的 构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国地仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovurm,CHO）中功能性表达,寻找消除白血病细胞免疫逃逸的有效方法.方法 采用定向分子克隆技术将小鼠CD80胞外段和IgG1 Fc段的cDNA串联至真核表达载体pcDNA3.0中,运用脂质体将所得的重组子转染CHO细胞,经免疫印迹、斑点ELISA检测其表达,免疫亲和层析法纯化其表达产物,用流式细胞术、MTT比色法及ELISA在体外检测该产物的生物学活性.结果 两段目的基因按预期设想克隆入空载体中并得到了表达,亲和层析纯化获得了高纯度目的蛋白,该蛋白能够将白血病细胞表面CD80分子密度提高5倍,并可显著增强同种异体小鼠淋巴细胞的增殖、对白血病细胞的杀伤以及Ⅱ-2的分泌.结论 成功构建了融合基因真核表达载体,其表达产物在体外具有相应的生物学功能,有希望成为消除白血病细胞免疫逃逸的有力工具.     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的克隆人Flt3配体（Flt3 LIg and，FL），并在CHO细胞中进行表达。方法从健康人外周血中提取总RNA，通过RT-PCR技术，扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段，经DNA测序证实后，将得到的片段基因插入pcDNA3．0表达载体，构建了pcDNA3．0-FL真核表达载体；将重组质粒pcDNA3．0-FL转染CHO细胞．经G418筛选出阳性细胞克隆，扩大培养，提取细胞总蛋白，用SDS—PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24000处有一显色条带。结果FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3．0中并在CHO细胞中成功表达。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．0-FL并在CHO细胞中成功表达，为FL的相关研究和应用开发奠定了基础。     

人IL-18结合蛋白AcDNA的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆人IL－18结合蛋白（hIL-18BPa)的cDNA，观察其在COS－7的表达。方法：采用RT－PCR自人白血病细胞株jukat中获得hIL-18 BPa的cDNA，将其克隆至T－vector中，经测序确证后，将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中，脂质体介导法将其转染COS－7细胞，72h后收集上清纯化，用BCA法测定hIL-18 BPa的含量，用ELISA法测定其活性。结论：获得的IL－18BPa的cDNA序列gene bank登录的cDNA序列一致。上清液中hIL-18BPa含量为1．4mg/L，并具有良好的生物学活性。结论：成功克隆hIL-18 BPa基因，并实现了COS－7细胞中的瞬时表达，为研究其活性奠定了基础。     

人IL-18结合蛋白A在CHO细胞中表达的研究

目的 克隆人IL－18结合蛋白A（hIL-18BPa)的cDNA，构建真核表达载体及其在CHO细胞中的表达。方法 采用RT－PCR，自人白血病血细胞株Jurkat中获得hIL-18BPa的cDNA。将其克隆至T-vector中，经测序确证后，将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3．1中。以脂质体介导法，将其转染CHO细胞，用G418筛选抗性克隆，ELISA法测定其生物学活性。结果 获得的IL-18BPa的cDNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hIL-18BPa插入载体pcDNA3．1后，成功地构建稳定表达的载体。转染CHO细胞2后，获得可稳定表达hIL-18BPa的基因工程细胞株。经纯化后，证明具有良好的生物学活性。结论 成功地克隆hIL-18BPa基因，并实现了在CHO细胞中的稳定表达，为研究其生物学活性奠定了基础。     

Adiponectin 基因转染对肌细胞糖原合成和葡萄糖氧化的影响

目的：研究adiponectin对C2C12肌细胞糖原合成和葡萄糖氧化的影响。 方法： 用阳离子脂质体介导转染和随后G418筛选建立稳定转染小鼠adiponectin cDNA真核表达质粒（pcDNA3.0-mad）及空载pcDNA3.0的C2C12细胞株并鉴定。C2C12肌细胞糖代谢实验分对照组、空载体组和pcDNA3.0-mad(mad)组共3组进行，每组又分 0、0.5、5、100 nmol/L胰岛素刺激4个亚组。通过液闪测定细胞合成的糖原中［14C］的放射活性和氧化产生的［14CO2］，分别检测肌细胞的糖原合成和葡萄糖氧化情况。 结果： Western blotting和免疫组化检测证实mad组细胞表达adiponectin蛋白。Mad组葡萄糖氧化量随胰岛素浓度增加的速率较其它两组快，对照、空载体和mad组线性回归系数分别为23.34、23.23和26.06。Mad组C2C12肌细胞基础状态下和胰岛素刺激下的葡萄糖氧化和糖原合成与其它两组无显著差异（P>0.05）。 结论： 转染adiponectin基因对C2C12肌细胞葡萄糖氧化和糖原合成无显著影响。     

AngiostatinK（1—3）基因真核表达载体的构建,鉴定和表达

构建携带人ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）ｃＤＮＡ的真核表达载体,并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞中表达。方法将带有分泌信号的ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）ｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤ－ＮＡ－ＳＡＫ（１０３）,采用酶切鉴定结果。     

PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖药物筛选模型的建立及应用

目的通过构建重组的小鼠pcDNA3.1(+)-PD-L1质粒,并在真核细胞中进行高表达,建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖药物筛选模型用于免疫调节药物的筛选。方法以RT-PCR方法扩增得到小鼠的PD-L1全长片段;以pcDNA3.1(+)真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pcDNA3.1(+)-PD-L1;脂质体转染到小鼠成纤维细胞(L929),通过G418筛选得到高表达PD-L1的稳定细胞株并经免疫荧光鉴定;用丝裂霉素处理过的PD-L1高表达细胞与小鼠脾淋巴细胞共培养;成功建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的模型之后向其中加入不同种类、不同浓度的天然产物提取物,并设复孔。结果通过Eco RI/Xho I双酶切及测序证实构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-PD-L1正确。RT-PCR和免疫荧光方法鉴定重组质粒在L929细胞中高效表达,应用流式细胞术成功建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的模型,并筛选出阻断PD-L1活性的有效药物。结论获得了稳定高表达PD-L1的细胞,并且用于免疫调节的药物筛选,为免疫调节药物的筛选奠定了实验基础。     

真核表达载体pcDNA3.1(+)-vIL-10的构建及其在SD大鼠骨髓基质干细胞的表达

目的构建携带免疫调节因子vIL-10c DNA的真核表达载体,转染至SD大鼠骨髓基质干细胞,观察免疫调节因子vIL-10在骨髓基质干细胞的表达。方法PCR扩增原核载体PET-28α/vIL-10,获得目的基因vIL-10,目的基因在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体Pc DNA3.1(+),转染大鼠骨髓基质干细胞。用G418筛选得到vIL-10高表达的细胞,对照组为pcDNA3.1(+)直接转染的骨髓基质干细胞。结果经PCR、酶切、测序鉴定显示按设计构建的载体pc DNA3.1(+)-vIL-10,已成功转染骨髓基质干细胞。RT-PCR检测到510bp目的片段vIL-10在骨髓基质干细胞表达,SDS-PAGE电泳表明在骨髓基质干细胞有vIL-10蛋白的表达。结论vIL-10 mRNA和蛋白在骨髓基质干细胞中表达。