脂多糖刺激后腹腔巨噬细胞表面Toll样受体表达的变化

目的探讨LPS刺激后小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR2、TLR4表达的动态变化.方法常规方法从BALB/C小鼠腹腔中分离出巨噬细胞,调整细胞数为2×106/孔,分为6组,每组设3个复孔,加入LP S使其终浓度为1μg/ml,在终浓度为1μg/ml LPS刺激下,5%CO2,37℃孵育0、1.5、3、6、16、24h.用异硫氢酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠TLR2抗体和藻红蛋白(PE)标记的大鼠抗小鼠TLR4抗体对小鼠腹腔巨噬细胞进行免疫荧光染色,流式细胞仪(FCM)测定FITC、PE阳性细胞数及其平均荧光强度(MFI).结果1.随着LPS刺激时间的延长,TLR2阳性率逐步上升,6h达到高峰后出现缓慢下降趋势,各刺激组阳性率与对照组组相比,P＜0.01.TLR2 MFI则随着LPS刺激时间的延长而缓慢下降,各刺激组与对照组相比,P＜0.05.2.随着LPS刺激时间的延长,TLR4阳性率逐步上升,刺激达24h时,阳性率为14.02%+1.23%,与对照组(8.98%±1.06%)相比,P＜0.01.TLR4 MFI也随着刺激时间的延长而上升,各刺激组与对照组相比,P＜0.05.结论LPS能够引起巨噬细胞TLR2/4表达和分布发生变化,说明TLR2与TLR4均参与针对LPS的反应.     

脂多糖刺激后腹腔巨噬细胞表面Toll样受体表达的变化

目的探讨LPS刺激后小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR2、TLR4表达的动态变化。方法常规方法从BALB/C小鼠腹腔中分离出巨噬细胞,调整细胞数为2×106/孔,分为6组,每组设3个复孔,加入LPS使其终浓度为1μg/ml,在终浓度为1μg/mlLPS刺激下,5%CO2,37℃孵育0、1.5、3、6、16、24h。用异硫氢酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠TLR2抗体和藻红蛋白(PE)标记的大鼠抗小鼠TLR4抗体对小鼠腹腔巨噬细胞进行免疫荧光染色,流式细胞仪(FCM)测定FITC、PE阳性细胞数及其平均荧光强度(MFI)。结果1.随着LPS刺激时间的延长,TLR2阳性率逐步上升,6h达到高峰后出现缓慢下降趋势,各刺激组阳性率与对照组组相比,P<0.01。TLR2MFI则随着LPS刺激时间的延长而缓慢下降,各刺激组与对照组相比,P<0.05。2.随着LPS刺激时间的延长,TLR4阳性率逐步上升,刺激达24h时,阳性率为14.02%±1.23%,与对照组(8.98%±1.06%)相比,P<0.01。TLR4MFI也随着刺激时间的延长而上升,各刺激组与对照组相比,P<0.05。结论LPS能够引起巨噬细胞TLR2/4表达和分布发生变化,说明TLR2与TLR4均参与针对LPS的反应。     

结核分枝杆菌调控巨噬细胞凋亡机理的研究进展

综述了结核分枝杆菌感染机体后，巨噬细胞凋亡的正、反向调控机制。在感染早期，结核分枝杆菌可以激活caspase酶系，引发一系列级联反应，在细胞因子IL-1β、TNF-α的作用下，激发信号转导途径。胞内线粒体发生一系列结构和功能的变化，释放凋亡诱导因子。一系列因子协同作用．最终启动巨噬细胞凋亡，并导致细菌被杀灭。同时，结核分枝杆菌某些菌体成分可被巨噬细胞表面特异性受体识别．抑制巨噬细胞中分泌细胞因子的生物学活性．从而减少凋亡。结核杆菌通过一系列调控机制．以休眠状态存活于巨噬细胞中，与宿主达成一种动态平衡。     

结核分枝杆菌调控巨噬细胞凋亡机理的研究进展

综述了结核分枝杆菌感染机体后,巨噬细胞凋亡的正、反向调控机制。在感染早期,结核分枝杆菌可以激活caspase酶系,引发一系列级联反应,在细胞因子IL1β、TNFα的作用下,激发信号转导途径。胞内线粒体发生一系列结构和功能的变化,释放凋亡诱导因子。一系列因子协同作用,最终启动巨噬细胞凋亡,并导致细菌被杀灭。同时,结核分枝杆菌某些菌体成分可被巨噬细胞表面特异性受体识别,抑制巨噬细胞中分泌细胞因子的生物学活性,从而减少凋亡。结核杆菌通过一系列调控机制,以休眠状态存活于巨噬细胞中,与宿主达成一种动态平衡。     

Toll样受体4在免疫相关细胞中的作用

Toll样受体(TLRs)是参与固有免疫的重要蛋白分子,也是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。TLR4是TLRs家族的重要成员之一。TLR4通过调控中性粒细胞和单核巨噬细胞的活化,可促进细胞因子的释放,启动固有免疫应答。同时TLR4能促进树突状细胞的成熟,激活初始T细胞,启动适应性免疫应答。在T细胞和B细胞的适应性免疫应答中,TLR4可促进细胞分泌细胞因子,介导全身炎症反应,并调控记忆性细胞的生成。本文就TLR4在中性粒细胞、树突状细胞、单核巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中的作用进行综述。     

机械通气对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体4表达的影响

目的 探讨机械通气对大鼠肺泡巨噬细胞（AM）表面Toll样受体4（TLR4）表达的影响。方法 清洁级成年雄性SD大鼠18只，随机分为自主呼吸组（R组，n=6）、小潮气量（VT）机械通气组（M组，n=6）和大VT机械通气组（N组，n=6）。腹腔注射质量分数为20％的乌拉坦8mg／kg麻醉大鼠，行气管插管。机械通气呼吸机参数设定：M组：VT为6ml／kg，N组VT为40ml／kg，吸：呼为1：1，呼气末正压（PEEP）为0，吸入氧浓度（FiO2）为0．21。调整呼吸频率和潮气末二氧化碳分压（PETCO2）维持在35～45mmHg（1mmHg=0．133kPa）。实验3h结束，放血处死大鼠。监测实验开始及实验1、2和3h时动脉血气分析；并测定大鼠肺组织病理形态学积分、湿／干重（W／D）比值及支气管肺泡灌洗液（BALF）中自细胞计数（WBC）和肺蛋白通透性系数。用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）测定AM表面的TLR4mRNA表达，用免疫组化法测定AM表面的TLR4蛋白表达。结果 N组实验1h时存在过度通气，pH升高、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）降低（P均〈0．05），其他指标都在正常范围内。与R组比较，N组肺组织病理形态学积分、W／D比值，BALF中WBC和肺蛋白透性系数以及TLR4蛋白表达和TLR4mRNA表达均显著升高（P均〈0．01）；M组改变差异均无显著性（P均〉0．05）。结论 大VT机械通气导致大鼠肺损伤，并使AM表面TLR4表达明显上调。小VT机械通气可避免上述改变的发生。     

Toll样受体2和4在老年慢性左心力衰竭中的表达

目的探讨Toll样受体2(TLR2)和T0ll样受体4(TLR4)在老年慢性左心力衰竭患者外周血单核细胞表面的表达。方法根据NYHA心功能分级和左室射血分数(LVEF)将健康对照者和慢性左心力衰竭患者分成对照组、心功能I级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级组。采用流式细胞仪检测外周血单核细胞表面TLR2和TLR4的表达。结果左心力衰竭患者不同心功能组中TLR2和TLR4的表达均显著高于对照组(均P<0.05),且随着心功能分级的升高而明显上升。LVEF随着心功能分级的升高而逐渐下降,且与对照组比较,均P<0.05。结论 TLR2和TLR4可能作为一种危险因素参与老年慢性左心力衰竭的发生发展。     

Toll样受体4在急性肺损伤中的作用

目的观察Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)基因突变型小鼠与野生型小鼠内毒素攻击致急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的差异,分析TLR4在ALI中的作用。方法采用TLR4基因突变小鼠(C3H/HeJ品系,TLR4~(-/-)及野生型小鼠(CBA品系,TLR4~( / )),用内毒素攻击复制小鼠ALI模型,用显微病理及肺干湿重比(W/D)分析肺损伤程度,检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)水平,探讨损伤差异的可能机制。结果用1,5 mg·kg~(-1)LPS溶液经尾静脉注射复制ALI模型,结果示TLR4突变小鼠肺组织大体及显微病理损伤较野生型小鼠减轻,同时肺组织水肿(W/D)亦较野生小鼠减轻,尤其是在大剂量(5mg·kg~(-1))时,差异有显著性[(4．08±0．1)vs．(4．55±0．2),n=10,t=12．71,P＜0．01]。突变小鼠肺组织PMN浸润水平较野生型低[MPO：1 mg·kg~(-1)组,(20．73±4．58)vs．(39．97±3．66),n=10,t=13．43,P＜0．01];5 mg·kg~(-1)组,[(24．0±3．94)vs．(48．5±4．07),n=10,t=15．33,P＜0．01],且两者均较假手术组高。结论TLR4可能通过介导中性粒细胞肺内聚集而导致ALI的发生发展。     

结核杆菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡过程中细胞因子的动态变化

目的:探讨结核杆菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡过程中细胞因子的动态变化。方法:分离收集小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞,调整细胞浓度为5×106CFU/mL;配制结核杆菌菌悬液,菌量为5×108CFU/mL。将结核分枝杆菌H37Rv菌株菌悬液和小鼠巨噬细胞按1∶1混合,分别作用10、30、60、90、120、180min,4℃1500r/min离心10min,PBS液洗涤细胞 1次。加入含15%小牛血清RPMI 1640培养液,置37℃,5%CO2孵箱中培养4h。取出培养瓶用刮匙轻轻将贴壁细胞刮下,1200r/min离心10min,分别用70%乙醇、2% 戊二醛和4%甲醛固定,用流式细胞仪检测Toll样受体2(TLR2)和Bcl-2表达水平。用未加结核杆菌悬液的小鼠巨噬细胞作对照组,实验重复3次。结果:凋亡组各时间段内TLR2水平无显著变化,但凋亡组各时段TLR2表达与对照组差异均有统计学意义(P<0.01);凋亡组巨噬细胞内Bcl -2基因的表达水平10～90min无显著变化,120min后逐渐升高,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:结核杆菌 H37Rv株在感染的早期对宿主巨噬细胞有较强的致凋亡作用。     

双歧杆菌干预对实验性末端回肠炎肠上皮细胞 Toll 样受体2和Toll 样受体4表达的影响

目的 建立回肠-盲肠侧侧吻合术导致的实验性末端回肠炎动物模型以及双歧杆菌干预模 型,观察Toll 样受体(TLR)2 和TLR4 在双歧杆菌干预下的表达,研究双歧杆菌对实验性末端回肠炎的保护 作用.方法 清洁级SD 雄性大鼠100 只,随机分为五组:正常对照组(A)、模型对照组(B)、双歧杆菌低剂量 干预组(C)、中剂量干预组(D)及高剂量干预组(E),每组20 只.观察这五组大鼠末端回肠的炎症情况,行 镜下肠组织病理学评分(HS),使用免疫组化法检测各组末端回肠黏膜中TLR2、TLR4 的表达.结果 (1)肉 眼观察,模型对照组与双歧杆菌干预组及空白对照组相比,炎症评分有统计学差异(P <0.05).(2)镜下观 察,模型对照组与双歧杆菌干预组及空白对照组相比,炎症评分差异有统计学意义(P <0.05).(3)造模对 照组肠上皮细胞TLR2 和TLR4 的平均吸光度值较其余四组高(P <0.05);在双歧杆菌干预下,干预组TLR2 和TLR4 的平均吸光度值低于B 组(P <0.05).结论 使用双歧杆菌干预可降低实验性末端回肠炎肠组织 TLR2、TLR4 的表达,双歧杆菌对实验性末端回肠炎有保护作用.     

Vascular cell responsiveness to Toll-like receptor ligands in carotid atheroma

Background Atherosclerosis is potentiated by stimulation of Toll‐like receptors (TLRs), which serve to detect pathogen associated molecular patterns (PAMPs). However little is known of which PAMPs may be present in atheroma, or capable of stimulating inflammatory signalling in vascular cells. Materials and Methods DNA extracted from human carotid atheroma samples was amplified and sequenced using broad‐range 16S gene specific primers to establish historical exposure to bacterial PAMPs. Responsiveness of primary human arterial and venous endothelial and smooth muscle cells to PAMPs specific for each of the TLRs was assessed by measurement of interleukin‐8 secretion and E‐selectin expression. Results Extracts of atheromatous tissue stimulated little or no signalling in TLR‐transfected HEK‐293 cells. However, sequencing of bacterial DNA amplified from carotid atheroma revealed the presence of DNA from 17 different bacterial genera, suggesting historical exposure to bacterial lipopeptide, lipopolysaccharide and flagellin. All cells examined were responsive to the ligands of TLR3 and TLR4, poly inosine:cytosine and lipopolysaccharide. Arterial cells were responsive to a wider range of PAMPs than venous cells, being additionally responsive to bacterial flagellin and unmethylated cytosine‐phosphate‐guanosine DNA motifs, the ligands of TLR5 and TLR9, respectively. Cells were generally unresponsive towards the ligands of human TLR7 and TLR8, loxoribine and single stranded RNA. Only coronary artery endothelial cells expressed TLR2 mRNA and responded to the TLR2 ligand Pam₃CSK₄. Conclusions Vascular cells are responsive to a relatively diverse range of TLR ligands and may be exposed, at least transiently, to ligands of TLR2, TLR4, TLR5 and TLR9 during the development of carotid atheroma.     

健康人单核细胞来源树突状细胞Toll样受体的表达模式分析

目的体外诱导健康人外周血单核细胞来源的树突状细胞（dendritic cell,DC）,动态定量分析DC表达Toll样受体（TLRs）的种类,探讨TLRs的表达水平与DC成熟的相关性。方法用羟乙基淀粉（HES）分离健康人外周血单个核细胞（PB-MC）,经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素4（rhlL4）诱导培养DC,于培养5d加或不加肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素一仅（IFN一仅）,诱导其为成熟与未成熟两种类型的细胞。分别于3、5、7d用特异性单克隆抗体（单抗）标记未成熟DC（immature DC,imDC）和7d成熟DC（mature DC,mDC）,在流式细胞仪（FACS）上检测,用CellQuest软件分析细胞表面共刺激分子（B7—1、B7—2）和MHCII类分子以及细胞内、外TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9的表达百分率。结果健康人TLR3在imDC细胞膜表面的表达高于细胞内,并随着培养时间的延长有所下降;TLR4则主要表达在imDC细胞膜外,并伴随着干预性成熟而下降;TLR7在imDC细胞内的表达高于细胞表面,并随着imDC生长时间延长而逐渐增加,DC成熟时表达下降;TLR8和TLR9细胞内外均有表达,但细胞内稍高于细胞外,随DC成熟而表达增加。结论健康人单核细胞来源的DC表面TLRs的表达具有多样性,TLRs在DC的不同分化阶段表达模式不同,这种差异可能是DC通过TLRs识别病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMPs）的基础,从而有效地调节或控制固有免疫与获得性免疫。     

人胰腺组织Toll样受体4 表达的研究

目的：研究人胰腺组织Toll样受体4(TLR4)的表达分布。方法：采用免疫组化方法观察20例正常人胰腺组织冰冻切片TLR4的表达分布情况。结果：正常人胰腺主胰管上皮、血管内皮、胰岛和胰腺腺泡细胞可见TLR4的表达,其中胰管上皮和血管内皮表达尤为明显。结论：正常人胰腺胰管上皮及血管上皮存在TLR4的表达分布,此结果提示TLR4可能参与胰腺感染时识别和清除入侵病原体的免疫防御反应。     

巨噬细胞炎症蛋白—2在内毒素性急性肺损伤中的作用

目的：探讨巨噬细胞炎症蛋白２（ＭＩＰ２）在内毒素性急性肺损伤（ＡＬＩ）中的可能作用。方法：采用斑点杂交及原位杂交技术对ＡＬＩ大鼠肺组织中ＭＩＰ２ｍＲＮＡ的表达进行定量和定位研究。结果：内毒素性ＡＬＩ时大鼠各时点肺组织ＭＩＰ２ｍＲＮＡ表达量显著高于对照组，且与血浆及肺组织匀浆髓过氧化酶（ＭＰＯ）活性呈正相关（ｒ＝０．７２９，０．８８５，Ｐ均＜０．０５）。原位杂交发现，在ＡＬＩ早期，肺内巨噬细胞是ＭＩＰ２的主要分泌细胞。结论：在ＡＬＩ早期，巨噬细胞释放的ＭＩＰ２可能是ＡＬＩ时多形核白细胞（ＰＭＮ）在肺内大量浸润并激活的原因之一。     

Toll样受体4在实验性急性坏死型胰腺炎形成中的介导作用

目的　应用抗内毒素受体 Toll样受体 4 (TLR4 )抗体体内注射观察其对小鼠实验性急性坏死型胰腺炎 (ANP)的影响 ,探讨内毒素信号通路 ,尤其是Toll样受体 4在ANP发生中的介导作用。方法　 1 0只BALB/c小鼠随机分为ANP组和ANPTLR4抗体处理组。ANP模型制备采用腹腔内注射雨蛙肽和脂多糖 (LPS)。TLR4抗体处理组于LPS注射前 1 5min静脉注射TLR4单克隆抗体 ,剂量为 2 0 μg。 1 2h后处死小鼠并收取标本。测定血清淀粉酶和乳酸脱氢酶 (LDH)水平 ;胰腺组织切片行HE染色并作病理评分 ;RT PCR检测胰腺组织炎性介质TNF α、IL 1 β和ICAM 1mRNA表达变化 ;免疫组化和westernblot检测胰原组织核因子 -κΒ (NF κΒ)p6 5亚单位蛋白表达的改变 ;酶组织化学方法检测中性粒细胞特异性髓过氧化物酶(MPO)活性的变化。结果　与ANP模型组相比 ,TLR4抗体处理组血清淀粉酶活性 [1 2 6 1 2± 5 70 6U/Lvs2 341 2± 892 2U/L ,P <0 0 5 ]和LDH活性 [1 92 6± 4 0 0U/Lvs2 5 74± 2 77U/L ,P <0 0 5 ],较ANP模型组显著升高 ;病理评分结果显示 ,TLR4抗体处理组胰腺组织坏死和炎症反应程度明显加重 ;胰腺组织炎性介质TNF α、IL 1 β和ICAM 1mRAN表达呈显著上调 ;胰原组织NF κBp6 5亚单位的蛋白表达也呈上调趋势 ;反映中性粒细胞     

恶性细胞中巨噬细胞集落刺激因子及其受体的异源表达

业已证明血清M-CSF(可溶性M-CSF)水平在白血病前期、白血病、淋巴瘤、乳腺癌和肝癌患者明显升高,但机制不明。为探讨细胞内M-CSF及其受体表达在病态造血,肿瘤和白血病中的作用,采用RT-PCR和ABC免疫酶标技术,对12名正常人静脉血,21例初诊血液病患者骨髓和6株血源细胞系的M-CSF/M-CSF-R mRNA及抗原表达进行了分析。结果表明M-CSF及其受体的表达呈多态性分布,无论是因子还是受体在白血病患者的粒、单、红、巨核系的细胞膜、质、核呈不同程度的反应,提示其在不同状态和病种作用中的复杂性,值得深入研究。     

Cytokine-activated endothelial cells delay neutrophil apoptosis in vitro and in vivo. A role for granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.

The activation of endothelium is important in recruiting neutrophils to sites of inflammation and in modulating their function. We demonstrate that conditioned medium from cultured, activated endothelial cells acts to significantly delay the constitutive apoptosis of neutrophils, resulting in their enhanced survival and increased phagocytic function. The antiapoptotic activity is, in part, attributable to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) secreted by activated endothelial cells. The in vivo relevance of these findings was investigated in a cytokine-induced model of acute meningitis in mice. Peripheral blood neutrophils (PBNs) from mice with meningitis exhibited a delay in apoptosis compared with untreated mice. Furthermore, neutrophils recovered from the inflamed cerebrospinal fluid (CSF) exhibited enhanced survival compared with neutrophils isolated from the peripheral blood of the same animals. In unchallenged GM-CSF-deficient mice, the apoptosis of circulating PBNs was similar to wild-type animals; however, after cytokine-induced meningitis, the delay in neutrophil apoptosis typically observed in wild-type mice was attenuated. In contrast, the apoptosis of neutrophils recovered from the CSF of mice of both genotypes was comparable. Taken together, these studies suggest that neutrophil apoptosis is regulated during an inflammatory response, in both intravascular and extravascular compartments. GM-CSF released by activated endothelium can act to increase neutrophil survival and function in the peripheral blood, whereas other factor(s) appear to perform this function in the extravascular space.     

人Toll样受体4胞浆内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的：构建人Toll样受体4胞浆内段（hTLR4C)His融合蛋白表达载体并在原核表达与纯化，以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法：采用PCR方法扩增hTLR4基因编码区的胞浆内段，并将其重组于pET-DsbA2.0载体中。重组质粒经酶切、序列鉴定分析后，转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：用异丙基β－D硫代半乳糖（IPTG）诱导产生hTLR4胞浆内段的His-DsbA融合蛋白，继而纯化获得了分子量约42kd的融合蛋白。结论：本研究成功地构建了hTLR4胞浆内段融合蛋白表达载体并获得高效表达，为进一步研究提供了重要的实验材料。     

习惯性流产患者绒毛和蜕膜中Toll样受体4与Treg/ TH17细胞免疫平衡的相关性研究

目的探讨习惯性流产(RSA)患者绒毛和蜕膜中Toll样受体4(TLR4)与Treg/TH17细胞免疫平衡的关系。方法收集32例RSA患者和32例健康对照组的绒毛和蜕膜,用实时荧光定量PCR法检测其TLR4 mRNA表达水平,用流式细胞术检测Treg和TH17细胞数量,分析TLR4 mRNA与Treg/TH17细胞间的相关性。结果 RSA患者绒毛和蜕膜中TLR4 mRNA的相对表达水平分别为2.6±1.1、2.1±1.1,明显低于健康对照组(7.4±2.3、6.8±1.3),差异有统计学意义(t分别为10.650、15.613,P均0.01)。Treg细胞百分率分别为(7.75±1.83)%、(7.24±1.71)%,明显低于健康对照组(12.18±2.65)%、(11.64±3.23)%,差异有统计学意义(t分别为7.781、6.810,P均0.01);TH17细胞百分率分别为(7.78±2.13)%、(8.13±2.11)%,明显高于健康对照组(3.85±1.53)%、(4.11±1.52)%,差异有统计学意义(t分别为8.477、8.13,P均0.01)。RSA患者绒毛和蜕膜中TLR4 mRNA水平均与Treg细胞数量呈正相关(r分别为0.925、0.948,P均0.01);RSA患者绒毛和蜕膜中TLR4 mRNA水平均与TH17细胞数量呈负相关(r分别为-0.954、-0.939,P均0.01)。结论 RSA患者绒毛和蜕膜中TLR4低表达与Treg/TH17免疫失衡有关,可能参与RSA的发生。