胶原酶和胰酶对胎鼠端脑神经干细胞培养的影响

背景：神经干细胞为神经发育和神经功能重建的研究带来了广阔前景,其体外培养已成为神经科学的一个研究基础。目的：比较胶原酶和胰酶对体外培养神经干细胞的作用。方法：取孕14d的SD大鼠,无菌条件下取胎鼠端脑,剪碎后分别用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞。结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长,而用胰酶消化得到的则形成聚集体;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性;获取的神经干细胞纯度大于99%。提示用胶原酶可以简单而快速地获得原代单层化贴壁生长的神经干细胞。     

骨形态发生蛋白2对14d胎鼠端脑神经干细胞分化为胆碱能神经元的影响

背景:骨形态发生蛋白2可能是参与胆碱能神经元前体细胞分化的细胞外调控因子。目的:观察骨形态发生蛋白2在孕14d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元过程中的作用。方法:取孕14d胎鼠端脑,用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞,种植于涂有多聚赖氨酸的培养板,细胞原代培养24h后半量换液,加入10μg/L骨形态发生蛋白2继续培养。结果与结论:胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性,获取的神经干细胞纯度大于99%;ChAT免疫荧光鉴定骨形态发生蛋白2可以将孕14d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元,细胞纯度大于97%。     

骨形态发生蛋白2对14d胎鼠端脑神经干细胞分化为胆碱能神经元的影响

背景：骨形态发生蛋白2可能是参与胆碱能神经元前体细胞分化的细胞外调控因子。目的：观察骨形态发生蛋白2在孕14d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元过程中的作用。方法：取孕14d胎鼠端脑,用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞,种植于涂有多聚赖氨酸的培养板,细胞原代培养24h后半量换液,加入10μg/L骨形态发生蛋白2继续培养。结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性,获取的神经干细胞纯度大于99%;ChAT免疫荧光鉴定骨形态发生蛋白2可以将孕14d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元,细胞纯度大于97%。     

人脑神经干细胞的分离培养及鉴定的研究

目的探讨分离培养人脑神经干细胞的方法及条件。方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,用无血清培养基进行体外培养,bFGF和EGF刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。该细胞可在体外培养条件下传代培养,并表达神经干细胞标志Nestin;分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志NSE。结论在体外培养条件下可从人胚脑中分离培养出神经干细胞。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较(英文)

背景:通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的:对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法:①预损伤法:预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法:直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论:预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P>0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

人脑神经干细胞的分离培养及鉴定的研究

目的探讨分离培养人脑神经干细胞的方法及条件.方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,用无血清培养基进行体外培养,bFGF和EGF刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达.结果从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞.该细胞可在体外培养条件下传代培养,并表达神经干细胞标志Nestin;分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志NSE.结论在体外培养条件下可从人胚脑中分离培养出神经干细胞.     

原代人脐静脉内皮细胞分离培养方法的探讨及其鉴定

目的通过比较两种原代人脐静脉内皮细胞的分离培养方法并对细胞特异性抗原进行鉴定,探索提高原代内皮细胞体外培养存活率及纯化率的方法。方法采用一次性无菌注射器向人脐静脉灌注消化液,消化液的浓度和消化时间分别0.25%（质量体积比）胰蛋白酶,10min和0.1%（质量体积比）胶原酶Ⅱ,15min。通过在倒置显微镜下观察细胞的形态特点和用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定,比较两种消化方法的优劣。结果 0.1%胶原酶Ⅱ,15min的消化方法较0.25%胰蛋白酶,10min对原代人脐静脉内皮细胞有更好的分离效果,活细胞数量多且细胞纯度较高。免疫荧光染色结果表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原表达。结论胶原酶Ⅱ可以有效分离脐静脉内皮细胞,最佳消化条件是0.1%胶原酶Ⅱ,37℃,15min。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较

背景：通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的：对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法：①预损伤法：预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法：直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论：预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义（P〉0.05）。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及其基本属性的观察

目的分别以单纯机械吹打法和胰蛋白酶消化法分离培养神经干细胞(NSCs),并观察NSCs的生长、增殖和分化特点。方法采用无血清培养技术从胎鼠的大脑皮层和海马通过单纯机械吹打和胰蛋白酶消化分离培养原代细胞,并加血清诱导其分化,借助免疫细胞化学技术检测培养的神经干细胞及其分化后神经元和星形胶质细胞标志蛋白的表达;并应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。结果①从胎鼠大脑皮层及海马能分离培养出具有很强增殖力的细胞,它们能稳定表达巢蛋白,经诱导分化后可表达神经元和星形胶质细胞的特异性抗原。②与用单纯机械吹打分离细胞法相比,用胰蛋白酶消化后,在神经干细胞培养基中有很少或几乎没有未分离的组织团块,原代细胞背景更清晰。结论①应用胰蛋白酶消化,能分离培养出纯度较高的神经干细胞。②从大鼠大脑皮层及海马能成功地分离、培养出神经干细胞,它是进一步研究神经干细胞的良好材料。     

新生小鼠海马源性神经干细胞体外分离培养细胞群的增殖分化

目的:从新生小鼠脑海马部取材进行大量细胞克隆,对体外分离培养的神经干细胞进行鉴定,检测所分离细胞群的增殖分化特性。方法:实验于2005-07/10在解放军第三军医大学解剖学教研室实验完成。选用清洁级昆明种新生24h内小鼠12只,利用神经干细胞条件培养基和单细胞克隆技术,从小鼠脑海马分离并体外培养神经干细胞。连续传代20代后,以免疫荧光细胞化学方法及免疫组织化学方法检测克隆细胞Nestin、BrdU、NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白的表达。结果:实验选用昆明种新生24h内小鼠12只,全部进入结果分析。①神经干细胞的培养及分化:神经干细胞以神经球的方式悬浮生长,无明显突起,原代细胞接种后于第3天开始形成神经球。组成细胞球的细胞圆润饱满,活力状态好,绝大多数在1d内贴壁,并从细胞球边缘伸出突起,加入含血清的培养基后克隆球48h内即可见到明显的细胞分化,克隆球周围有细胞移出,7d后原有的细胞球消失。②神经干细胞的鉴定结果:原代克隆及其亚克隆行Nestin免疫荧光染色,证实克隆内细胞均为Nestin抗原阳性;细胞经BrdU标记后,行BrdU免疫细胞化学染色,部分细胞呈阳性。③神经干细胞的分化鉴定:对诱导分化的细胞分别行NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学检测,表达均呈阳性。结论:成功分离并获得新生小鼠脑海马神经干细胞,该细胞可连续传代,具备多向分化潜能。