尾加压素Ⅱ对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的:研究尾加压素Ⅱ(UⅡ)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的诱导凋亡作用,以及这种诱导作用与细胞内游离Ca2+的关系。方法:(1)光镜观察培养的静脉内皮细胞形态。(2)分成浓度组和时间组:浓度组加入不同浓度的UⅡ(10-9～10-6mol/L),并将硫氮唑酮加入对照组及10-7mol/L组;时间组则观察10-7mol/LUⅡ作用后不同时间段HUVEC的凋亡率。(3)流式细胞仪分析细胞周期,计算凋亡率。(4)电镜检测细胞凋亡。结果:(1)UⅡ促进HUVEC凋亡,二者呈时间依赖性(P<0.05);二者呈明显量效关系(P<0.05)。(2)硫氮唑酮可抑制UⅡ的诱导作用。结论:UⅡ可诱导HUVEC凋亡,其机制可能与[Ca2+]i升高有关。     

辛伐他汀对脓毒症大鼠血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的初步探讨辛伐他汀对脓毒症大鼠血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法采用改良盲肠结扎穿孔术复制脓毒症模型,收集血清备用。体外培养的人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)分为三组(对照组、脓毒症组、辛伐他汀干预组),培养24 h,MTT法检测细胞活性,AO染色观察细胞凋亡情况,RT-PCR检测细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达。结果 MTT:与脓毒症组相比,辛伐他汀干预组细胞活性明显提高;AO染色:对照组细胞形态基本正常,脓毒症组可见大量凋亡细胞,辛伐他汀干预组可见少量细胞凋亡;RT-PCR:与对照组相比,脓毒症组、辛伐他汀干预组,Bcl-2 mRNA、Bax mRNA高表达(P<0.01);与脓毒症组相比,辛伐他汀干预组Bcl-2 mRNA高表达(P<0.05),Bax mRNA低表达(P<0.01)。结论辛伐他汀可抑制脓毒症大鼠血清诱导的内皮细胞凋亡,上调Bcl-2和下调Bax表达可能是其机制之一。     

RAC1活化介导缺氧的人脐静脉内皮细胞凋亡

背景:目前研究证实,Rac1蛋白能够调控甘油醛-3-磷酸脱氢酶氧化酶的表达,刺激内源性活性氧产生,引起内皮细胞毒性改变.目的:探讨Rac1蛋白在缺氧诱导的人血管内皮细胞凋亡中的作用及其调控机制.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-01/2008-05在解放军沈阳军区总医院医学实验科完成.材料:自备人脐静脉内皮细胞、Phoenix amphotropic 293包装细胞、持续活化型pLNCX-L61Rac1和主导抑制的pLNCX-N17Rac1反转录病毒真核表达载体.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,将细胞以体积分数为1%O2、5%CO2及94%N2缺氧条件下培养72 h.用持续活化型pLNCX-L61Rac1(L61Rac1感染组)和主导抑制型pLNCX-N17Rac1(N17Rac1感染组)反转录病毒真核表达载体转染人脐静脉内皮细胞,并筛选稳定表达的细胞克隆.主要观察指标:①感染后稳定表达阳性克隆筛选.②采用pull-down和Western blot分析感染前后细胞内Rac1的活化.③采用持续缺氧的方法诱导内皮细胞凋亡,用TUNEL染色和Western blot检测缺氧72 h后各实验组细胞中cleave-caspase3表达.④应用免疫荧光和Western blot分析血清反应因子的表达和定位.结果:筛选出稳定表达持续活化型pLNCX-L61Rac1和主导抑制型的pLNCX-N17Rac1的人脐静脉内皮细胞克隆:应用putl down和Western blot证实各组细胞内Rac1的活化改变:与人脐静脉内皮细胞和N17Rac1感染细胞比较.缺氧72 h后L61Rac1细胞发生明显凋亡.进一步应用Western blot分析证实3组细胞中血清反应因子表达无明显改变,但人脐静脉内皮细胞和N17Rac1-HUVECs中血清反应因子为入核表达,而L61Rac1-HUVECs中血清反应因子蛋白在细胞核周大量表达,血清反应因子发生出核转位.结论:Rac1参与了内皮细胞凋亡的调控,机制可能与其调控血清反应因子蛋白核转位有关.     

凋亡相关基因在金黄色葡萄球菌感染人脐静脉内皮细胞的表达

目的研究凋亡相关基因Bcl-2、Bax和caspase-3在金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染人脐静脉内皮细胞株ECV-304内的表达,探讨其对人脐静脉内皮细胞的凋亡作用。方法采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western-blot)法检测S.aureus感染后人脐静脉内皮细胞Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA及蛋白表达水平。结果 S.aureus感染人脐静脉内皮细胞后,其细胞内与抗凋亡相关的细胞因子Bcl-2mRNA水平及蛋白表达量下降,感染12小时差异有统计学意义(P0.01),而促凋亡的细胞因子Bax和caspase-3表达上升,感染6小时差异有统计学意义(P0.01)。结论凋亡相关细胞因子Bcl-2、Bax和caspase-3可能在S.aureus感染所致的脐静脉内皮细胞凋亡中起重要的作用。     

同型半胱氨酸对脐静脉内皮细胞凋亡及活性氧生成的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的损伤作用及机制。方法培养HUVECs,Hcy以不同浓度(0、0.01、0.1、1.0、3.0、5.0 mmol/L)和不同作用时间(3、6、12、24 h)进行干预。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率及活性氧。结果随着Hcy浓度增高或作用时间延长,HUVECs凋亡率、活性氧生成均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 Hcy能诱导内皮细胞凋亡,且其作用呈浓度和时间的依赖性。     

促红细胞生成素预防人脐静脉内皮细胞凋亡的作用

目的 建立氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡模型,探讨促红细胞生成素(EPO)对ox-LDL诱导HUVECs凋亡的影响.方法 取体外培养3～6代的HUVECs用于实验.实验分为两组:一组细胞予以不同浓度(6.25、50、100 kU/L)重组人促红细胞生成素(rhEPO)预处理24 h,再加入100 mg/L ox-LDL孵育48 h;另一组细胞加入反式或顺式LOX-1 mRNA预处理24 h,再加入 100 mg/L 的ox-LDL孵育12 h.采用存活率、凋亡率和Bcl-2/Bax比值评价细胞凋亡情况.结果 与ox-LDL组比较,随rhEPO浓度的递增,细胞存活率增高,细胞凋亡率降低,凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值增高(P均<0.05),呈剂量依赖性.反式LOX-1 mRNA(0.5 μmol/L)预处理组凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值较ox-LDL组明显增高(P<0.05);顺式LOX-1 mRNA(0.5 μmol/L)预处理组Bcl-2/Bax比值与ox-LDL组则无明显差异.结论 ox-LDL可以诱导HUVECs凋亡,并且通过LOX-1 mRNA来调节,rhEPO可增高Bcl-2/Bax比值,抑制ox-LDL诱导的HUVECs凋亡.     

1-甲基色氨酸对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞通透性及凋亡的影响

目的 探讨1-甲基色氨酸(1-methyltryptophan,1-MT)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)通透性及细胞凋亡的影响.方法 将HUVECs分为三组,即磷酸缓冲盐溶液(p...     

高糖对人脐静脉内皮细胞c-Jun表达影响

目的:观察高糖对人脐静脉内皮细胞c-Jun表达的影响.方法:提取、分离人脐静脉内皮细胞,体外培养至第3代,分别用5.5,11.0,22.0,44.0 mmol/L葡萄糖培养液培养内皮细胞,并设22.0 mmol/L 甘露醇培养液培养者为对照组.以22.0 mmol/L葡萄糖分别作用0,0.5,1.0,2.0 h,应用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测c-Jun mRNA和蛋白表达水平.结果:高搪以浓度依赖方式上调人脐静脉内皮细胞c-Jun mRNA的表达,22.0 mmol/L葡萄糖达到最强刺激效应,与5.5 mmol/L 葡萄糖组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01).22.0 mmol/L葡萄糖刺激0.5 h c-JunmRNA表达升高,刺激1.0 h达高峰,2.0 h开始下降.22.0 mmol/L葡萄糖刺激2 h后,人脐静脉内皮c-Jun蛋白表达增加.结论:高糖可上调人脐静脉内皮细胞c-Jun mRNA和蛋白表达.     

内毒素对人脐静脉内皮细胞的内皮素分泌影响

应用体外培养及放免测定法观察Ｅ．Ｃｏｌｉ内毒素对人脐静脉内皮细胞内皮素分泌的影响。结果表明：（１）低浓度内毒素刺激内皮细胞后内皮素值升高不明显，随浓度加大，内皮素值也明显增高，内毒素达１０ｍｇ／Ｌ时，内皮素达到高峰（２７８．１１±２２．１４ｎｇ／Ｌ），继续增加内毒素浓度至２０ｍｇ／Ｌ时，内皮素浓度反而有所下降（２６２．４０±２６．７７ｎｇ／Ｌ）。（２）１０ｍｇ／Ｌ内毒素刺激内皮细胞后，在１０小时、２０小时及３０小时时内皮素水平明显增加。提示内毒素能显著刺激培养细胞内皮素的生成，并呈时间及剂量依赖性关系     

阿托伐他汀钙对人脐静脉内皮细胞adropin表达的影响

目的：探讨阿托伐他汀钙对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）adropin表达的影响。方法不同浓度的阿托伐他汀钙（0.002、0.02、0.2、2和20μmol/L）与HUVEC共培养6、12和24 h。采用MTT法检测HUVEC的增殖情况。半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HUVEC adropin mRNA的表达。ELISA法测定细胞上清液中adropin的浓度。结果阿托伐他汀钙在0.002-20μmol/L范围均能促进HUVEC的增殖,20μmol/L（与对照组比较P＜0.05）和24 h（与6 h时比较P＜0.05）时作用最强。阿托伐他汀钙呈浓度依赖性和时间依赖性增加了adropin mRNA的表达和培养上清液中adropin蛋白的浓度,在20μmol/L（与对照组比较P＜0.01）和24 h（与6 h时比较P＜0.01）作用最强。HUVEC上清液中adropin蛋白浓度与反映细胞增殖的OD值呈明显正相关（12 h,P=0.001;24 h,P＜0.001）。结论阿托伐他汀钙在一定范围内能够促进HUVEC adropin相关基因及蛋白的表达,且呈剂量和时间依赖性。     

烟曲霉提取物对人支气管上皮细胞嗜酸性粒细胞趋化因子浓度的影响

目的 探讨烟曲霉对呼吸道上皮细胞人嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）浓度变化的影响及其可能机制,为研究烟曲霉在变应性支气管肺曲霉病发病机制中的作用奠定基础.方法 分别应用不同浓度（0、8、16、20 mg/L）的烟曲霉提取物（AFE）作用体外培养人支气管上皮细胞（16HBE） 不同的时间（12、24、48、72 h）.应用ELISA法检测细胞上清液Eotaxin浓度.结果 正常未给予AFE刺激培养条件下的对照组细胞表达一定量Eotaxin,而给予不同浓度的AFE作用24 h后,细胞合成和分泌Eotaxin的量明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.01）,并呈明显的时间依赖性.热处理的AFE仍然能刺激16HBE细胞分泌Eotaxin并呈时间依赖性.随着AFE浓度的升高在相同作用时间下AFE刺激16HBE细胞分泌Eotaxin 的浓度并未呈现上升趋势.结论 AFE并非依赖其蛋白酶活性促进呼吸道上皮细胞合成和分泌Eotaxin,一定浓度的AFE刺激16HBE 细胞分泌Eotaxin呈明显的时间依赖性.     

人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离原代培养的方法,并总结对培养的细胞鉴定方法。方法通过胰酶灌注法从人脐带获取内皮细胞进行分离培养,并采用免疫组化法及光镜和透射电镜观察超微结构鉴定所获得的细胞系。结果分离的HUVEC在体外7-10天左右可长成单层,光镜下胞体为单层铺路石状排列。第VⅢ因子相关抗原的检测为阳性。透射电镜下观察培养的内皮细胞胞浆内可见Weibel-Palade小体。结论用胰酶灌注法是获得脐静脉内皮细胞的有效方法。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

原代脐静脉内皮细胞与脐静脉内皮细胞株的培养方法及生物特性的比较

目的建立一套成功率高,细胞污染率少,获得较多的细胞数的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的体外分离方法,并且将原代脐静脉内皮细胞与EA.HY926人脐静脉内皮细胞株生物特性进行对比研究,为细胞培养及相关的医学基础研究提供依据。方法在新鲜(健康剖宫产产妇分娩后立即取新生胎儿脐带,长度15～20 cm,取标本时间≤4h)脐静脉内注0.1%的Ⅱ型胶原酶消化获得内皮细胞,用M199生长液(含25%的内皮细胞生长因子)进行培养,EA.HY926细胞株用M199生长液。比较两组细胞的形态、超微结构、细胞纯度检测CD31抗体表达。结果①形态:原代HUVEC体外生长3～4 d可铺满单层,细胞呈梭形、饱满,漩涡状排列生长,传代后可见管腔样结构;EA.HY926细胞株胞质多颗粒,2～3可铺满单层,可长成复层。②超微结构:透射电镜下,原代HUVEC里可发现较多的横切与纵切的韦伯潘力小体,在EA.HY926细胞株里较少。③细胞纯度检测:CD31抗体的表达率原代HUVEC细胞大于EA.HY926细胞株,两种细胞CD31表达差异有统计学意义(P﹤0.001)。结论脐静脉注Ⅱ型胶原酶消化法配合M199生长液可迅速获取大量内皮细胞,其生物学特性明显优于HUVEC株,而细胞株则以细胞数量多,培养方法简单,成活率高为特点,两者均是组织工程及相关医学基础研究较好的细胞来源。     

Melatonin attenuates homocysteine‐induced injury in human umbilical vein endothelial cells

Homocysteine (Hcy) is a major risk factor for vascular disease and is closely associated with endothelial dysfunction. Melatonin is a neurohormone that is mostly produced by the pineal gland. Studies have reported that melatonin exhibits neuroprotective effects in several neurodegenerative disorders. The aim of the current study was to investigate the possible protective effect of melatonin against Hcy‐induced endothelial cell apoptosis in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and to explore the underlying mechanisms. HUVECs were exposed to Hcy in the presence or absence of melatonin. The effect of melatonin on viability was examined by MTT assay. Intracellular reactive oxygen species (ROS) levels were determined by 2′,7′‐dichlorofluorescein diacetate (DCF‐DA). Further, expression of Bax, Bcl‐2, and caspase‐3 was analyzed by Western blot analysis. Lipid peroxidation (LPO) levels, total antioxidant power (TAP), and total thiol molecules were also evaluated. The results of this study revealed that melatonin significantly prevented Hcy‐induced loss in cell viability in HUVECs. It was found that ROS significantly increased in the presence of Hcy, whereas melatonin reduced ROS production. Melatonin also downregulated Bax, upregulated Bcl‐2, and decreased the expression and activity of caspase‐3. Hcy increased the levels of LPO, and this effect was significantly attenuated by melatonin. Melatonin also increased the levels of TAP and total thiol molecules. It was concluded that melatonin played a protective role against Hcy‐induced endothelium cell apoptosis through inhibition of ROS accumulation and the mitochondrial‐dependent apoptotic pathway.     

机械压力对人脐静脉内皮细胞形态、结构的影响和意义

目的 研究压力对体外培养的人脐静脉内皮细胞ECV-304形态和结构的影响,探讨压力增高对血管内皮细胞形态和结构的影响及在门脉高压症血管内皮病变中的意义。方法 对静态培养及不同压力、不同时间条件下体外培养的人脐静脉内皮细胞ECV-304用倒置显微镜和透射电镜进行形态和结构观察,并用计算机图像分析系统进行形态参数的定量分析。结果施加生理范围和超生理范围的压力干预后,在倒置相差显微镜下可见内皮细胞的形态发生改变,表现为细胞形状梭形化或变为不规则形,部分细胞轮廓不清,胞核增大,大多数细胞胞浆有暗色颗粒,细胞排列紊乱,以40mm Hg 24h组最为明显。形态参数的定量分析结果显示在40mm Hg压力下培养24h后,血管内皮细胞的细胞面积、胞核面积和形状因子与正常组和生理压力组相比均有极显著性改变（P均＜0．01）。透射电镜观察则见加压组有空泡的细胞数明显多于正常组,胞质中空泡的数目也明显增多,且大小不一,细胞内的吞噬溶酶体也明显增多。结论血管内皮细胞对机械压力有一S定的耐受能力,但长时间超生理范围的压力对血管内皮细胞的形态和结构有显著影响。门静脉高压症的血管内皮病变的形成与其内皮细胞长期受高压刺激有关。     

Puerarin protects human umbilical vein endothelial cells against high glucose-induced apoptosis by upregulating heme oxygenase-1 and inhibiting calpain activation

The aim of this study was to investigate whether puerarin protects against high glucose (HG)-induced apoptosis by suppressing calpain activation in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). HUVECs were exposed to normal glucose (NG) (5.5 mm) or HG (33 mm) for 48 h; then, apoptosis and caspase-3 activity were determined. The expression of heme oxygenase-1 (HO-1) mRNA was evaluated by RT-PCR analysis. The activation of calpain and HO activity were also assessed. Compared with the NG group, exposure of HUVECs to HG for 48 h resulted in significant increases in calpain and caspase-3 activity as well as apoptosis, which were prevented by co-incubation with puerarin (1-100 μm) in a concentration-dependent manner. HO-1 mRNA expression and HO activity were decreased in HUVECs treated with HG for 48 h. Compared with the group exposed to HG alone, co-incubation of HUVECs with puerarin and HG induced increases in HO-1 mRNA expression and HO activity. The HO-1 inhibitor protoporphyrin IX zinc (II) abolished the inhibitory effect of puerarin on HG-induced calpain and caspase-3 activation, as well as apoptosis. The data show that puerarin protects against HG-induced endothelial cell apoptosis by a mechanism involving upregulation of HO-1 expression and inhibition of calpain activity.     

线粒体凋亡途经参与热应激后人脐静脉内皮细胞凋亡的研究

目的 观察细胞色素C、caspase-9和caspase-3在热应激后人脐静脉内皮细胞的表达及相互关系,阐明热应激后人脐静脉内皮细胞凋亡的信号转导机制,探讨重症中暑所致血管内皮损害的发病机理.方法 建立人脐静脉内皮细胞热应激模型,对照组将细胞置于标准37℃、5％ CO2细胞培养箱,热应激组将细胞置于39℃、41℃、43℃细胞培养箱中进行热应激2h,热应激后继续在细胞培养箱孵育24h.电子显微镜观察人脐静脉内皮细胞(37℃、43℃)线粒体改变,应用Annexin V-FITC/PI双染色方法检测不同温度热应激后细胞凋亡率、Western blot检测细胞色素C、caspase-9、caspase-3蛋白表达.结果 电镜观察对照组(37℃)HUVEC细胞线粒体结构基本正常.热应激后(43℃)HUVEC细胞线粒体肿胀并出现结构改变;与对照组比较,39℃热应激对内皮细胞凋亡无明显影响(P＞0.05),随着热应激温度的增加人脐静脉内皮细胞凋亡明显增多(41℃17.8％,4 3℃25.6％)并且细胞色素C、caspase-9、caspase-3蛋白表达明显增加(P＜0.05).结论 线粒体通路的激活参与了热应激后人脐静脉内皮细胞凋亡的调控;血管内皮细胞凋亡可能与重症中暑的发病存在相关性.     

"血必净"注射液对内毒素刺激的内皮细胞的影响

目的观察中药"血必净"静脉注射液对内毒素刺激的人脐静脉内皮细胞的影响.方法培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),以内毒素刺激,并以活血化瘀中药"血必净"静脉注射液进行保护.设对照组、中药组和内毒素组,观察各组不同时点内皮细胞培养液中的血管性血友病因子(vWF)及内皮素(ET)浓度.结果中药组与内毒素组比较,细胞培养液中vWF及ET含量明显下降(P＜0.01);中药组与对照组比较观察值无差异(P＞0.05).结论中药"血必净"注射液对内毒素损伤的内皮细胞有保护作用.