热休克蛋白60对小鼠树突状细胞成熟及免疫功能的影响

目的 探讨动脉粥样硬化中重要炎性物质——热休克蛋白60（HSP60）体外对小鼠树突状细胞（mDC）功能的影响。方法 从近交系C57BL/6J小鼠骨髓中提取mDC．体外培养成熟后分别与3、10／μg／ml mHSP60或PBS孵育24h．观察其形态改变；流式细胞仪检测mDC表面标志；混合淋巴细胞反应（MLR）测定mDC刺激功能；ELISA法测定MLR上清液中细胞因子浓度。结果 mHSP60处理组较对照组．mDC突起增加明显；CD80及CD86表型显著增加；淋巴细胞刺激功能明显增强；上清液细胞因子IL-12、IFN-γ增加（P＜0．01）而IL-4增加不明显（P〉0.05）．IFN-γ／IL-4比值升高。以上变化mHSP60高剂量处理组较低剂量处理组更明显。结论 mHSP60体外可以促进mDC功能．且作用呈剂量依赖性。     

gp96多肽复合物对树突状细胞成熟及功能的影响

目的探讨gp96多肽复合物对树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟及功能的影响.方法应用液相层析技术从胃癌组织中提取gp96多肽复合物,用SDS-PAGE和Western blot进行性质鉴定,将提取的gp96多肽复合物加入外周血来源的单个核细胞诱导培养DCs,采用流式细胞技术检测DCs的表型变化,用3H-TdR掺入法检测DCs诱导的混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR).结果从1 g湿重的胃癌组织中可提取gp6多肽复合物30～50μg,用gp96多肽复合物诱导培养的DCs其表面分子的表达明显增高,并具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力.结论从胃癌组织中可以提取出gp96多肽复合物,gp96多肽复合物可促进DCs分化成熟,使其具有更强的抗原提呈能力.     

细胞因子对K562细胞HSP gp96基因及蛋白表达的影响

目的研究细胞因子与K562细胞共孵育时不同浓度与不同时间条件对gp96基因及蛋白的影响。方法分别将浓度为0kU/L、200kU/L、400kU/L、600kU/L、800kU/L、1000kU/L的IFN-α及0μg/L、2μg/L、4μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L的IFN-γ与K562细胞共孵育12h,用Western blot及RT-PCR法分析其中的gp96 mRNA和蛋白。分别将浓度为600kU/L的IFN-α和6μg/L的IFN-γ与K562细胞共孵育0、3、6、9、12、18、24、36h检测gp96 mRNA含量。结果1)不同浓度IFN-α和IFN-γ分别与K562细胞共孵育12h后,hsp gp96基因及其蛋白的表达出现相似的改变,即随着浓度的增加表达量逐步增加,当浓度达IFN-α600kU/L、IFN-γ6μg/L后,表达量逐步下降。2)IFN-α 600k U/L、IFN-γ6μg/L分别与K562细胞共孵育,细胞中hsp gp96 mRNA表达量均先增加后逐步下降,在9h达高峰。结论IFN-α、IFN-γ与K562细胞共同孵育,能通过上调细胞中hsp gp96 mRNA增加HSP GP96蛋白。     

Potent antitumor effect elicited by gp96-peptide complexes pulsed by dendritic cell on mice of H22 liver cancer

Objective： To improve DC-based tumor vaccination, we studied whether dendritic ceils （DCs） which cocultured with H22 liver cancer cells-derived heat shock protein （HSP） glycoprotein 96 （gp96） affect the T cell-activating potential in vitro and the induction of tumor immunity in vivo. Methods： Maturation of murine bone marrow-derived DC was induced by GM-CSF plus IL-4, which mimiced the immunostimulatory effect of DC. Cocultured DC and gp96-peptide complexes were used to vaccine H22 liver cancer cells of mice. Using murine models we compared the immunogenecity of DC modified by gp96-peptides complexes derived from murine liver cancer cells alone or inactive tumor cells. To verify the specificity of the vaccine, in vitro assays were executed. Serum cytokine levels were quantified to explore the supposed pathway of DC modified by gp96 peptide complexes and its effect on antitumor immune response. Results： DC modified by gp96-peptide complexes can activate spleen lymphocyte and the latter can specifically kill H22 cells but not Ehrilich ascites carcinoma cells. Modified DC can induce potent tumor-antigenspecific immune response, augment the proliferation of Thl cells, and inhibit tumor growth. Conclusion： In this study, we have developed a novel DC-mediated tumor vaccine by combing the gp96 antigenic peptides complexes and inducing immune response against specific tumor cells, gp96 can be identified as a potent DC activator.     

人胎盘源间充质干细胞对脐血单核源树突状细胞体外成熟的调节作用

目的探讨人胎盘源间充质干细胞（PMSCs）对单核源树突状细胞（mono-DCs）体外成熟的影响。方法采用密度梯度离心法分离人脐血单核细胞,在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）和人白细胞介素-4（hIL-4）刺激下获得大量未成熟DCs。将DCs和PMSCs共培养4 d,同时加入LPS刺激,分别通过倒置显微镜、流式细胞仪和混合淋巴反应（MLR）检测DCs的成熟。结果共培养DCs呈散在分布,细胞边缘圆滑;与成熟DCs相比,其表面CD80、CD86、CD83、CD40的表达明显较低,而CD14的表达较高;共培养组DCs刺激同种异型淋巴细胞增殖的能力在各个浓度均明显低于对照组（均P〈0.05）。结论 PMSCs可以明显抑制脐血单核源DCs的体外成熟。     

慢性髓性白血病细胞来源的树突状细胞大容量诱导及其功能的实验研究

目的　探索大容量诱导慢性髓性白血病 (CML)细胞来源的树突状细胞 (DCs)的适宜方法 ;研究CML DCs刺激自体T淋巴细胞增殖并分泌γ 干扰素 (IFN γ)的能力。方法　用CS 30 0 0 plus血细胞分离机采集初诊CML病人的外周血单个核细胞 (PBMNCs) ;单采的CML PBMNCS转入组织培养袋 ,加入重组人粒 巨细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)和重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,培养诱导 7d ;在诱导前后 ,用流式细胞仪分别检测细胞表面HLA DR、CD1a、CD80和CD86的表达水平 ;用3 H TdR掺入法检测CML DCs和CML PBMNCs刺激自体和异体T细胞增殖的能力 ;用ELISA法检测在自体混合淋巴细胞培养 (MLR)时T细胞分泌的IFN γ浓度。结果　用血细胞分离机收集的CML PBMNCs ,在组织培养袋内经细胞因子培养诱导 ,HLA DR、CD1a、CD80、CD86的表达均有明显上调 ,细胞形态也表现典型的DC特征 ;CML DCs能显著刺激自体和异体T细胞增殖 ,而CML PBM NCs仅能刺激异体T细胞的增殖 ,刺激自体T细胞增殖的能力很弱 ;刺激自体T细胞增殖时分泌的IFN γ浓度 ,CML DCs组为 (877± 2 14 )pg/mL ;CML BPMNCs组仅为 (14± 1.7) pg/mL。 结论　单采的CML PBMNCs转入组织培养袋 ,加入rhGM CSF和rhIL 4 ,可收获大容量的CML DCs;CML DCs在体外具有显著刺激自体T细胞增殖     

胃癌组织中gp96和增殖细胞核抗原的表达及其临床意义

目的探讨gp96在胃癌组织中的表达及其在胃癌发生、发展中的作用.方法采用免疫组化及原位杂交技术检测50例人胃癌及其癌旁正常组织gp96的表达,免疫组化检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.结果 gp96在癌旁正常组织中存在较低的表达,在胃癌组织中表达比癌旁正常组织显著增高(P＜0.01);而且表达高低与胃癌的临床分期、分化程度及有无淋巴结转移有显著差异(P＜0.05);PCNA的表达与gp96的表达相关,PCNA表达高者gp96的表达也增高,二者呈显著正相关(r=0.744,P=0.021,P＜0.05).结论 gp96、PCNA在胃癌组织中的表达密切相关,可能在胃癌的发生、发展中起重要作用.     

细胞因子诱导不同来源的贴壁细胞分化为树突状细胞的研究

目的：探讨寻树突状态细胞（DC）体外培养的理想来源。方法：通过贴壁的方法分离脐带血、造血动员后的外周血及正常人外周血中DC的前体细胞，体外采用细胞因子诱导，并对其进行形态学的观察和细胞表型检测；同时比较了不同来源的DC的增殖、分泌IL－12的能力及激发同种异体T细胞和脐带血幼雅T细胞（naive Tcells)的作用，结果：经过造血动员后的外周血产生的DC数量和纯度均较高，而且能经体外细胞因子诱导为功能性DC。结论：造血动员后的外周血是较理想的DC来源。     

间充质干细胞株对小鼠骨髓来源树突状细胞分化成熟的影响

目的探讨间充质干细胞株C3H10T1/2对小鼠骨髓来源树突状细胞（dendritic cells,DCs）体外分化、成熟的影响。方法采用密度梯度离心法分离小鼠骨髓细胞,在mGM-CSF和mIL-4刺激下获得大量未成熟DCs。将DCs和C3H10T1/2细胞共培养2d,同时加入LPS刺激,分别通过倒置显微镜、流式细胞仪,混合淋巴反应以及ELISA检测DCs的成熟。结果经C3H10T1/2细胞体外共培养的DCs,形态观察呈散在分布,细胞边缘圆滑,流式细胞仪检测显示其低表达CD11c、MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40;共培养组的DCs刺激同种异型小鼠脾细胞增殖的能力在各个浓度均明显低于对照组（P〈0.05或0.01）;ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-10的浓度也明显低于对照组（P〈0.05或0.01）。结论间充质干细胞株C3H10T1/2可以明显抑制小鼠骨髓来源DCs的体外成熟。     

人外周血中树突状细胞的诱导、培养及其表面标记的初步研究

目的：在人外周血中有效地诱导，培养树突状细胞（dendritic cells,DC)并鉴定其表面分子的表达，方法：采用密度梯度离心的方法分离人外周血中的单个核细胞，在6孔板上贴壁2h，然后吸去悬浮细胞，用粒细胞－巨噬细胞集落群体刺激因子（GM－CSF）、白细胞介素－4（IL－4）、肿瘤坏死因子－α（TNF-α）细胞因子组合，刺激树突状细胞（DC）增殖，分化。用标有荧光素的单抗标记培养细胞，在激光共聚共焦显微镜下拍摄标记有荧光素的细胞，在流式细胞仪上分析所培养的细胞。结果：该细胞直径在10－20μm，培养14天后，CD1a^ 48%,CD83^ 97%,CD40^ 33%，人体主要组织相容性复合物（MHC）Ⅱ^ 95%,CD80^ 98%,CD86^ 93%,CD83是DC的成熟标记。结论：该方法是一种可靠的诱导和培养DC的方法，对于乳腺癌患者还可通过动员等措施进一步提高DC的分离率。     

沙培林诱导脐血树突状细胞的成熟

目的 改进体外诱导脐血树突状细胞（DC）成熟的方案，为后期制备临床使用的抗肿瘤DC疫苗提供新的技术路线。方法 分离脐血单个核细胞（CBMC）并在含10％同源脐血浆、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）的培养体系中诱导培养，部分加入肿瘤冻融抗原和／或沙培林（OK-432）冲击，光镜和电镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测培养前后各组细胞表面抗原CD1a和CD83的表达情况。结果培养过程中，细胞形态发生明显变化，呈现典型的DC形态。收集第9天各组DC，细胞表面均高度表达CD1a和CD83，与贴壁分离的CBMC比较有统计学意义，肿瘤冻融抗原冲击后，DC表面CD1a和CD83的表达上调，沙培林进一步刺激后，CD1a和CD83表达率显著升高。结论 诱导脐带血来源的前体细胞分化为未成熟DC的途径相对简便；沙培林能促进肿瘤冻融抗原冲击后的脐血DC进一步成熟。     

Effect of dendritic cell modified by gp96-peptide complex on antitumor effect in H22 cell

Objective： To investigate the antitumor effect of dendritic cell （DC） modified by gp96-peptide complexes both in vitro and in vivo. Methods：Gp96-peptide complexes were acquired from H22 liver cancer cells in mice. DC were cultured from bone marrow cells and modified by gp96-peptide complexes. Spleen lymphocytes of mice were activated by modified DC and the cytotoxicity were detected by ^51Cr release method. Modified DC, gp96-peptide complexes and inactivated H22 cells were injected into mice bearing H22 liver cancer cells to observe the levels of IL-10, IFN-y in serum and the alteration of proportions of CD8^＋-IFNy^＋ and CD8^＋-IL-10^＋ cells, CD4^＋-IFNy^＋ and CD4^＋-IL-10^＋ cells. Results： DC modified by gp96-peptide complexes can activate spleen lymphocyte and the latter can specifically kill H22 cells but not Ehrilich ascites carcinoma cells. Modified DC can improve the host＇s antitumor immune response and the proportions of Thl cells, inhibiting tumor growth. Conclusion： Gp96-peptide complexes can activate DC effectively, making DC a good vaccine.     

Enhancement of Extracts from Celastrus orbiculatus on Maturation and Function of Dendritic Cells in vitro and in vivo

Objective To examine the immunoregulation of Celastrus orbiculatus extracts (COE), a traditional Chinese medicine, on maturation and function of dendritic cells (DCs) in vitro and in vivo. Methods In vitro, after treated with COE in different nontoxic concentrations (0, 10, 20, 40, 80, and 160 μg/mL) for 5 d, the surface immunological molecules and cytokine secretion of mice bone marrow-derived DCs in response to COE were analyzed by flow cytometric analysis (FACS) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), respectively. In vivo, mouse hepatoma cells (Hepa1-6, 1 × 106) were injected sc and were treated with different dosages of COE (10, 20 or 40 mg/kg/d). Effects on tumor growth were determined by tumor volume and histology analysis after 28 d administration of COE. The relative proportions of mature DCs and CD8+ T cells were measured in mononuclear cells that had been isolated from spleen by FACS. Results COE stimulated IL-2 and IFN-γ secretion of DCs, simultaneously enhanced the maturation of DCs by enhancing immunological molecule (CD40, CD80, CD86, H-2Kb, and I-Ab) expression in a dose-dependent manner. Furthermore, the chemotactic responses of DCs were significantly higher in COE-treated than untreated DCs, in association with higher chemokine receptor 7 expression. Furthermore, COE increased DCs produce IFN-γ and IL-2 in a dose-dependent manner when the concentration of COE less than 40 μg/mL, decreased DCs produce IL-10 and IL-4 also in a dose-dependent manner. In in vivo studies, COE can not only suppress growth of malignant hepatocellular carcinomas but also stimulate maturation of DCs, associated with strongly enhanced CD8+ CTL responses. Conclusion These data provide new insight into the mechanism of action of COE and indicate that the stimulation of maturation and function of DCs by COE contributes to its immunoregulatory effects.     

脂肪基质干细胞对异基因树突状细胞功能的影响及机制探讨

目的 研究脂肪基质干细胞(ASC)对异基因树突状细胞(DC)表型及分泌细胞因子的影响,探讨ASC发挥免疫调节作用的方式和可能机制.方法 分离培养ASC,将ASC上清和ASC分别与异基因树突状细胞进行混合培养.流式细胞术检测DC CD80,CD83和CD86的表达,ELISA法检测DC分泌IL-12的水平,RT-PCR法检测吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)基因的表达.结果 ASC上清与DC共培养后,使Dc表达CD80、CD83和CD86减少[分别为(16.9±5.1)%、(8.4±3.7)%和(25.9±6.5)%],与对照组比较,差异具有统计学意义(均P<0.05);ASC上清与ASC均能使DC分泌IL-12减少[分别为(168.3±51.2)pg/ml和(180.5±56.7)pg/ml].并使IDO基因的表达增高,与对照组比较,差异具有统计学意义(均P<0.05).结论 ASC能通过细胞直接接触和分泌某些细胞因子的方式作用于树突状细胞,发挥免疫负调节作用,并参与诱导机体的免疫耐受.     

胃癌gp96多肽复合物树突状细胞疫苗对Th1/Th2平衡的影响

目的探讨gp96多肽复合物树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗对Th1/Th2平衡的影响.方法从胃癌组织中提取gp96多肽复合物负载从外周血单个核细胞诱导培养的DCs,用gp96多肽复合物DC疫苗诱导同一患者Th0淋巴细胞,ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-10的水平;以胃癌细胞裂解物负载的DC疫苗作对照.结果gp96多肽复合物DC疫苗诱导的T细胞分泌IFN-γ的量为(2 875±177.66)pg/ml,显著高于对照组(1 765±289.07)pg/ml(P＜0.01);分泌IL-10的量为(36±6.72)pg/ml,显著低于对照组(90±11.26)pg/ml(P＜0.05),二者之间存在显著的负相关(r=-0.915,P＜0.01).结论gp96多肽复合物DC疫苗可诱导Th1/Th2平衡向Th1漂移,显示了gp96多肽复合物DC疫苗可显著提高机体的免疫能力,为临床免疫干预治疗奠定基础.     

宫颈癌患者外周血来源的树突状细胞的生物学特性观察

【目的】探讨宫颈癌患者外周血来源的树突状细胞(DC)的生物学特性。【方法】14例Ib期及以上的宫颈癌患者为研究组,24例健康女性为对照组。外周血经密度梯度离心得到单个核细胞,其中附壁成分在含GM-CSF/IL-4的完全淋巴细胞培养液培养。光镜和电镜观察培养细胞的形态变化。培养7d后,计算树突状细胞的产量,流式细胞术分析HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD1a和CD14的表达,同种异体淋巴细胞的混合淋巴反应(MLR)检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力。【结果】经过7d培养,两组均诱导出典型形态和表型的DC。宫颈癌患者单位体积外周血的未成熟DC(ImDC)的产量为67.3×106±33.8×106,较对照组低(P<0.05)。研究组的CD40、CD80和CD1a的平均荧光强度(MFI)分别为18±9,15±6和71±11,均较对照组低(P<0.05);而两组ImDC的HLA-ABC、HLA-DR表达强度相似(P>0.05)。相同PBL/DC比值,研究组ImDC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力下降(P<0.05)。【结论】宫颈癌患者的外周血单个核细胞培养的树突状细胞(ImDC)和健康对照组的ImDC具有免疫学差异,提示在应用树突状细胞进行免疫治疗时应考虑这种差异。     

外周血来源树突状细胞的体外诱导及鉴定

目的 建立人外周血树突状细胞(dendritic cell,DC)的分离方法,观察其形态学和免疫组织化学的特点,为下一步研究提供DC来源.方法 用重组人GM-CSF、IL-4从人外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测所得细胞的纯度,光镜、电镜观察其形态,SP免疫细胞化学方法检测DC的分子表达.结果 此纯化方法所得细胞纯度可达到80%以上,形态学观察可见纯化细胞具有典型的DC特征,该细胞高表达HLA-DR和S-100分子.结论 此种方法可获得较高纯度典型的DC,为进一步研究及临床应用提供了可能.     

MyD88在OK-432诱导树突状细胞成熟中的作用

目的探讨小鼠骨髓树突状细胞（Dcs）髓性分化蛋白88（MyD88）在OK-432诱导DCs成熟中的作用机制。方法分离小鼠骨髓单核细胞（BMMCs）,在含10％胎牛血清、重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素-4（rmIL-4）的培养体系中诱导培养,所得的细胞即为DCs。于培养的第5天,将细胞分为3组：对照组不加OK-432和MyD88siRNAOK-432组加入终浓度为5μg／mL的OK-432;RNA干扰组加入MyD88siRNA12h后,再加入5μg／mLOK-432刺激。半定量RT-PCR法检测DCs中MyD88的表达;ELISA法检测各组DCs分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-12的能力;MTT法检测DCs体外刺激同种混合淋巴细胞增殖的免疫活性。结果OK-432组DCs的MyD88高表达、TNF-α和IL-12释放明显增加并能诱导较强混合淋巴细胞反应,而用MyD88siRNA干扰后以上效应均降低（P〈0．05）。结论靶向MyD88siRNA可明显抑制小鼠DCs中MyD88的表达和OK-432诱导的DCs成熟,表明MyD88介导OK-432诱导的DCs成熟。     

抗CD40单克隆抗体诱导树突状细胞增殖和分化成熟作用研究

目的　探讨CD40分子在树突状细胞和外周血单核细胞表达的意义。方法　将人外周血单核细胞经不同组合的细胞因子共培养获得了树突状细胞 ,经流式细胞仪表型分析、活细胞计数、混合淋巴细胞反应等方法测定抗人CD40单抗对CD40分子的激发作用。结果　激发型抗人CD40单克隆抗体 5C11能促使树突状细胞分化成熟 ,并且激发后的DCs 具有明显的激发T细胞的功能。结论　抗人CD40激发型单抗是一种潜在的免疫激动剂。     

热休克蛋白Hsp 70激活树突状细胞治疗肺癌

目的 利用热休克蛋白Hsp 70作为佐剂增强树突状细胞(DCs)递呈肿瘤抗原的能力并提高细胞毒T淋巴细胞(CTLs)对肺癌细胞的杀伤活性.方法 外周血单个核细胞体外经GM-CSF和IL-4诱导产生树突状细胞,负载A549肺癌细胞裂解物的同时加入Hsp 70,诱导的自体CTLs用细胞毒试验和ELISA测定杀伤活性和细胞因子的分泌.同时建立荷瘤裸鼠模型,不同分组裸鼠一次或多次皮下注射CTLs.结果 A 549冻融抗原 Hsp 70显著增强CTLs的增殖能力,诱导的CTLs对A 549细胞产生特异性杀伤并能抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长.结论 DCs能有效呈递肺癌冻融抗原,诱导产生抗原特异性CTLs.在抗原致敏阶段加入Hsp 70能使CTLs杀伤活性进一步增强,提示Hsp 70在以DCs为基础的肺癌疫苗和过继免疫治疗中具有广阔前景.