左、右归丸含药血清通过p38MAPK信号通路干预BMSCs成骨诱导的研究

目的:基于p38信号通路探讨左、右归丸含药血清对BMSCs成骨诱导的机制。方法:运用全骨髓贴壁法分离和培养大鼠BMSCs;分别以左归丸、右归丸、两方共同药、滋肾阴药、补肾阳药、阳性对照药补佳乐制备的大鼠含药血清加诱导剂(地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠)、诱导剂和空白含药血清组共8组对BMSCs进行干预,采用改良钙钴染色法检测碱性磷酸酶(ALP)表达,采用茜素红染色法检测钙化结节,采用Western blotting法检测核结合因子α1(Cbfα1)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)、p38、p-p38蛋白表达,采用real time PCR法检测Cbfα1、ColⅠmRNA表达。结果:左、右归丸及滋阴药组可以上调ALP表达,促进BMSCs矿化结节形成,增强Cbfα1、ColⅠmRNA和蛋白的表达并且可以促进p38蛋白的磷酸化;给予p38特异性阻滞剂SB203580后,各组BMSCs ALP表达下调,矿化结节形成减少,p38蛋白磷酸化水平降低,并且Cbfα1、ColⅠmRNA和蛋白的表达下降。结论:左、右归丸及其拆方含药血清可能部分通过p38 MAPK信号通路对BMSCs成骨分化产生调控作用的。     

左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨、成脂分化后Caspase-3/Bcl-2的影响

目的观察左、右归丸对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨、成脂分化后凋亡蛋白表达的影响。方法 60只雌性SD大鼠,取40只切除双侧卵巢制备模型,随机均分为模型组(1.0 g/kg蒸馏水)、左归丸组(9.45 g/kg左归丸)、右归丸组(10.26 g/kg右归丸)和补佳乐组(0.09 mg/kg戊酸雌二醇),另取10只作为空白组(1.0 g/kg蒸馏水),10只双侧切除卵巢周围少量脂肪作为假手术组(1.0 g/kg蒸馏水),各组灌胃给药12周后,处死大鼠,取股骨和胫骨体外培养BMSCs,采用MTT法检测细胞增殖,Western blot法观察半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)的蛋白表达。结果 MTT法显示,左、右归丸对BMSCs增殖有促进作用,左归丸效果更佳。成骨分化后,与空白组相比,模型组Caspase-3蛋白表达上调(P0.05,P0.01),Bcl-2蛋白表达下调(P0.01);与模型组相比,左归丸组、右归丸组Caspase-3蛋白表达下调而Bcl-2蛋白上调(P0.05,P0.01)。成脂分化后,与空白组比较,模型组、左归丸组和右归丸组Caspase-3蛋白表达显著上调,Bcl-2蛋白下调(P0.05),成骨、成脂分化后左归丸组与右归丸组比较均有显著性差异(P0.05)。结论左、右归丸均能抑制去卵巢大鼠BMSCs成骨、成脂分化后的凋亡,且左归丸有益于成骨分化,右归丸有益于成脂分化。     

补肾化痰法影响骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的:研究补肾化痰法对BMSCs成骨分化的影响,探讨补肾化痰法治疗骨质疏松症的可能作用机制。方法:运用全骨髓贴壁法分离培养纯化Wsitar大鼠BMSCs,诱导BMSCs成骨分化,观察补肾中药、化痰中药和补肾化痰中药分别对BMSCs成骨分化后茜素红染色及定量、碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)mRNA表达影响。结果:补肾化痰中药能促进BMSCs成骨诱导后细胞体外钙化,提高细胞内ALP活性,上调OCN-mRNA表达。结论:补肾化痰法可以促进BMSCs向成骨细胞分化。     

左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化中TGF-β1 mRNA的影响

目的:研究左、右归丸含药血清对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的作用.方法:将28只大鼠随机分为4组,分别以左归丸(ZGW)、右归丸(YGW)、阳性对照药戊酸雌二醇片(estradiol valerate tablets,EVT)和蒸馏水给大鼠灌胃,各组灌胃剂量分别为18.9,20.52 g·kg-1,0.36 mg· kg-,1.0 mL·kg-1,日2次,于第4天给药2h后,腹主动脉取血,离心,56℃水浴灭活30 min后,大鼠含药血清制备完成.再配制10％各组含药血清的α-MEM分别加入诱导剂(YDJ)(10-7mol· L-1地塞米松、50μmol· L-维生素C、10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠)与单纯诱导剂组共5组对BMSCs(1×105/L)进行干预9d,用Westernblot法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen,COL Ⅰ)蛋白表达,用RT-PCR法检测转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-1)mRNA表达.结果:Control组比较:ZGW+ YDJ组、YGW+ YDJ组、EVT+ YDJ组均可促进BMSCs的ALP,COLⅠ蛋白的表达,上调BMSCs TGF-β1 mRNA表达(P＜0.05);与YDJ组比较:ZGW+ YDJ组、YGW+ YDJ组可促进BMSCs的ALP,COL Ⅰ蛋白的表达,上调BMSCs TGF-β1mRNA表达(P＜0.05);且ZGW+ YDJ组优于YGW+ YDJ组(P＜0.05).结论:左、右归丸含药血清能协同诱导剂促进BMSCs成骨分化,且左归丸组更为有效,表明中医“滋肾阴”对BMSCs的成骨诱导更为有效.     

补肾、健脾和补肾健脾3方对尾部悬吊大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：观察补肾、健脾和补肾健脾3方对尾部悬吊模拟失重大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法：大鼠随机分为正常组、模型组、补肾组、健脾组和补肾健脾组共5组。后4组大鼠头低位-30°尾部悬吊连续21天,补肾、健脾和补肾健脾组大鼠从实验第1天开始分别给予补肾、健脾和补肾健脾方灌胃,其余各组大鼠灌服等容积的生理盐水。实验第22天处死各组大鼠,全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,取第3代细胞进行成骨分化诱导实验,成骨分化诱导第4、7、10天采用p-NPP法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,成骨分化诱导第7、14、21天采用ELISA法检测细胞上清液中骨钙素（OC）含量,成骨分化诱导第21天茜素红染色法检测钙结节形成情况。结果：与正常组比较,模型组大鼠BMSCs经成骨诱导4、7、10天ALP活性均显著降低（P<0.01）,经成骨诱导7、14、21天细胞上清OC含量显著降低（P<0.01）,经成骨诱导21天后钙结节形成显著减少（P<0.01）;与模型组比较,补肾组和补肾健脾组大鼠BMSCs经成骨诱导4、7、10天ALP活性均明显升高（P<0.05或P<0.01）,健脾组大鼠BMSCs经成骨诱导7、10天ALP活性均明显升高（P<0.05）,补肾、健脾和补肾健脾组大鼠BMSCs经成骨诱导7、14、21天细胞上清OC含量明显升高（P<0.05或P<0.01）,经成骨诱导21天后钙结节形成显著增多（P<0.01）;与补肾组比较,健脾组大鼠BMSCs经成骨诱导7天ALP活性降低、经成骨诱导21天细胞上清OC含量明显降低（P<0.05）,而补肾健脾组明显升高（P<0.05）,经成骨诱导21天后补肾健脾组钙结节形成明显增多（P<0.05）。结论：补肾、健脾和补肾健脾3方具有促进尾部悬吊模拟失重大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用,以补肾健脾方作用为优。     

老鹳草素对小鼠骨髓基质干细胞成骨分化相关基因表达的影响

目的:观察老鹳草素对小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响,并对成骨分化过程中相关基因表达进行检测。方法:分离、培养小鼠BMSCs,加入不同浓度老鹳草素(1×10-9,1×10-8,1×10-7mol·L-1)培养,另设空白组,分别于成骨诱导第7,14天采用碱性磷酸酶(ALP),骨钙素(OCN)试剂盒测定ALP活性及OCN含量,并进行ALP染色。于成骨诱导第21天时采用茜素红染色检测成骨分化过程中钙结节形成数量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测BMSCs成骨分化过程中OCN,ALP,骨涎蛋白(BSP),Runt相关转录因子2(Runx2)mRNA和蛋白表达的变化。结果:与空白组比较,成骨诱导后第7,14天时,老鹳草素各剂量组ALP活性,OCN含量及ALP染色强度均明显升高(P0.05),成骨诱导第21天时,老鹳草素各剂量组矿化结节数量及OCN,ALP,BSP,Runx2 mRNA和蛋白表达均明显升高(P0.05)。结论:老鹳草素能够明显促进BMSCs向成骨方向分化,成骨相关基因OCN,ALP,BSP,Runx2均参与这一过程。     

羌活鱼水提物在大鼠骨髓间充质细胞成骨中的作用

目的：探讨羌活鱼水提物含药血清对大鼠骨髓间充质细胞（BMSCs）成骨的作用。方法：取大鼠第三代BMSCs分为4组,待BMSCs接近80%融合时,分别应用生理盐水＋DMEM/F12培养液＋成骨分化诱导液＋5%FBS（生理盐水对照组）、高剂量羌活鱼水提物＋DMEM/F12培养液＋成骨分化诱导液＋5%FBS（羌活鱼水提物高剂量组）、中剂量羌活鱼水提物＋DMEM/F12培养液＋成骨分化诱导液＋5%FBS（羌活鱼水提物中剂量组）、低剂量羌活鱼水提物＋DMEM/F12培养液＋成骨分化诱导液＋5%FBS（羌活鱼水提物低剂量组）培养基培养。应用碱性磷酸酶（ALP）活性、钙盐沉积量及钙化结节数检测成骨分化程度。采用SPSS 16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果：羌活鱼水提物含药血清组较生理盐水对照组表现出高ALP活性、高钙盐沉积量、高骨钙素分泌量。结论：羌活鱼水提物含药血清可提高成骨性诱导液诱导BMSCs成骨分化的能力,表现出高ALP活性及基质矿化能力,在BMSCs成骨分化中可起到重要作用。     

左归丸调控miR34a对BMSCs成骨分化能力的影响

目的:探究左归丸调控miR34a对BMSCs成骨分化能力的影响。方法:培养BMSCs,分别用大鼠高、低剂量左归丸含药血清和对照血清干预BMSCs成骨分化过程。采用CCK8检测左归丸对BMSCs的增殖、毒性作用,AKP活性检测BMSCs成骨分化活性,ALP染色检测细胞成骨分化能力,反转录-实时荧光定量技术(RT-q PCR)检测miR34a、Tgif2、Runx2、PPARγmRNA表达;Western-blotting检测Tgif2、RUNX2蛋白表达。结果:CCK8检测发现:随着时间的增加,从第1天到第7天,BMSCs增殖呈上升趋势,各组间增加程度无统计学差异;7~14 d,BMSCs增殖呈下降趋势。AKP活性检测示,干预BMSCs 3 d后,左高组AKP活性显著高于其余两组(P0.05);7 d时,左低、左高组AKP活性均显著高于对照组(P0.001)。干预3 d时,ALP染色结果示,左高组ALP染色阳性率高于其余两组;干预7 d时,左高、左低组ALP染色阳性率显著高于对照组。干预3 d时,左高、左低组miR34a mRNA表达较对照组上调,Tgif2、PPARγ2 mRNA表达较对照组下调;干预7 d后,左高组miR34a mRNA表达较对照组显著上调(P0.05);左低、左高组Tgif2 mRNA表达均较对照组显著下调(P0.05);左高组PPARγ2 mRNA表达较对照组显著下调(P0.01);干预3 d后,左高组Tgif2蛋白水平较对照组显著降低(P0.01);而左低组Runx2蛋白水平较对照组显著升高(P0.01);干预7 d后,左低、左高组Tgif2蛋白水平较对照组显著降低(P0.001),而左低、左高组Runx2蛋白水平较对照组显著升高(P0.05)。结论:左归丸具有促进BMSCs增殖及成骨分化的作用,其机制可能是通过上调miR34a,抑制其靶基因Tgif2表达,同时下调成脂相关因子PPRAγ和上调成骨核转录因子Runx2。     

左归丸对衰老大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响

目的研究左归丸对衰老大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨与成脂分化的影响。方法通过腹腔注射D-半乳糖建模,制备衰老大鼠模型,分离培养MSCs,并诱导MSCs成骨和成脂分化。通过碱性磷酸酶(ALP)活性检测、ALP染色观察MSCs成骨分化能力,通过甘油三酯(TG)表达量和油红O染色观察MSCs成脂分化能力。结果模型组MSCs ALP染色阳性率明显低于正常组,左归丸组MSCs染色阳性率明显高于模型组(P0.05)。成骨诱导14 d,模型组MSCs ALP活性值明显低于正常组而左归丸组明显高于模型组(P0.05)。油红O染色,模型组MSCs染色阳性率明显高于正常组,左归丸组MSCs染色阳性率明显低于模型组(P0.05)。成脂诱导7 d,模型组MSCs TG表达量明显高于正常组而左归丸组MSCs TG表达量明显低于模型组(P0.05)。结论左归丸可促进衰老大鼠MSCs向成骨细胞分化,同时可抑制其向脂肪细胞分化。     

补肾健脾方对尾部悬吊大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

目的:观察补肾健脾方对尾部悬吊大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化能力的影响。方法:大鼠随机分为正常组、悬吊组、补肾健脾方高、中、低剂量组共5组。除正常组外,其余各组大鼠头低位-30度尾部悬吊连续21 d模拟失重,后3组大鼠从实验第1天开始分别按剂量11.4,5.7,2.8 g·kg-1·d-1给予补肾健脾方ig 21 d,其余各组大鼠ig等容积的生理盐水。全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行成脂分化诱导,油红O染色法检测脂滴形成情况,Real Time PCR法和Western bolt法分别检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)mRNA和蛋白表达,在成脂诱导分化的第7,14,21天分别检测细胞内甘油三酯(TG)含量。结果:较正常组,悬吊组大鼠BMSCs经成脂诱导后7,14,21 d TG含量均明显升高(P0.01),成脂诱导21 d成脂能力,PPARγmRNA和蛋白表达明显增强(P0.01);较悬吊组,补肾健脾高、中、低剂量组大鼠BMSCs经成脂诱导7,14,21 d后TG含量降低(P0.01,P0.05),经成脂诱导21 d后成脂能力均明显减弱(P0.01),PPARγmRNA和蛋白表达减少(P0.01,P0.05);较补肾健脾中剂量组,补肾健脾高剂量组大鼠BMSCs经成脂诱导14,21 d后TG含量降低(P0.05),经成脂诱导21 d后补肾健脾高剂量组成脂能力均减弱(P0.05),PPARγmRNA和蛋白表达均减少(P0.05,P0.01),补肾健脾低剂量组PPARγ蛋白表达增多(P0.05)。结论:补肾健脾方具有抑制尾部悬吊大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的作用,以补肾健脾方高剂量作用为优,其机制可能与下调PPARγ表达有关。     

健骨益痹方含药血清对骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的影响

目的观察健骨益痹含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法分离BMSCs分为空白对照组(A组)、低浓度组(B组)、中浓度组(C组)、高浓度组(D组)、阳性对照组(E组),通过MTT法检测健骨益痹含药血清对BMSCs活性的影响,于干预后的第3、6、9、12天分别测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法染色并观察钙结节密度;RT-PCR法检测ColⅠ、BGP、RUNX2mRNA转录表达。结果与对照组比较,实验组经定向成骨诱导后BMSCs增殖增强,ALP水平升高,钙结节密度显著增大,成骨相关转录因子ColⅠ、BGP、RUNX2的表达量亦增加(P0.05)。结论健骨益痹复方含药血清能促进BMSCs体外增殖并诱导其成骨分化。     

补肾化痰法影响骨髓间充质干细胞成脂分化的实验研究

目的研究补肾法、化痰法、补肾化痰法对BMSCs成脂分化的影响,探讨补肾化痰法治疗骨质疏松症的可能作用机制。方法运用全骨髓贴壁法分离培养纯化Wistar大鼠BMSCs,诱导BMSCs成脂分化,观察补肾中药、化痰中药和补肾化痰中药分别对BMSCs成脂分化后细胞形态学、油红O染色及定量和用RT-PCR检测脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表达的影响。结果化痰中药能使BMSCs诱导形成的脂肪细胞减少,并下调成脂相关基因LPL-mRNA表达。结论化痰法可以抑制BMSCs向脂肪细胞分化。     

左归丸、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导的影响

目的:研究左归丸、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)成脂诱导的影响,并探讨其相关的作用机制。方法:将90只SD雌性大鼠,随机选取10只作为正常组,其余80只再随机选取10只经双侧腰背部切口切除卵巢周围少量脂肪组织作为假手术组,其余70只以相同切口切除双侧卵巢作为模型组,分别以正常组,假手术组,模型组,左归丸组(18.9 g·kg~(-1)),右归丸组(20.52 g·kg~(-1)),共同药组(15.12 g·kg~(-1)),滋阴药组(12.96 g·kg~(-1)),补阳药组(8.1 g·kg~(-1))和戊酸雌二醇片组(0.36 mg·kg~(-1))共9组,对BMSCs进行干预,流式细胞仪鉴定BMSCs,用油红O检测脂滴的形成;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ),脂蛋白脂肪酶(lipoprotein,LPL),脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)mRNA的表达;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ)蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组BMSCs明显向脂肪细胞分化,PPARγ,LPL,FABP4 mRNA表达及C/EBPβ蛋白的表达明显升高(P0.05);与模型组比较,左归丸、右归丸及其拆方均可抑制BMSCs向脂肪细胞分化,其中右归丸组可明显下调PPARγ,LPL,FABP4 mRNA,降低C/EBPβ的蛋白的表达(P0.05)。结论:左归丸、右归丸及其拆方均能抑制BMSCs的成脂分化,且右归丸抑制成脂分化的作用优于左归丸,以及补阳药及二者的共同药组。     

补肾活血汤调控Runx2及Osterix促进BMSCs成骨分化的作用研究

目的:探讨补肾活血汤提高骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal cells,BMSCs)Runx2及Osterix基因表达,促进成骨分化的作用。方法:从双侧股骨和胫骨分离大鼠BMSCs并使用腺病毒载体转染BMSCs细胞,构建过表达Runx2细胞株,Q-PCR法对转染细胞株进行鉴定,CCK8法评价补肾活血汤对BMSCs活性的影响,ALP半定量活性检测法评价补肾活血汤对BMSCs成骨分化的影响,RT-PCR、Western Blot法检测补肾活血汤对成骨相关标志物Runx2和Osterix表达量的影响。结果:成功构建过表达Runx2的BMSCs细胞,补肾活血汤组在25μg/m-200μg/ml之内对细胞活性没有影响,与正常培养组比较补肾活血汤100μg/ml组ALP活性显著提高,与正常培养组比较补肾活血汤50μg/ml、100μg/ml组Runx2和Osterix的mRNA和蛋白相对表达量显著增加。结论:补肾活血汤能提高BMSCs中Runx2和Osterix的表达,促进成骨分化。     

异补骨脂素对体外培养骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化的研究

目的:研究异补骨脂素对体外培养大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)增殖与成骨性分化的影响.方法:取大鼠股骨及胫骨全骨髓,利用全骨髓贴壁培养法培养单核层细胞,培养于含10% FBS的DMEM-F12培养液中,3d后首次换液,9d后成骨性诱导培养并用药物干预.异补骨脂素在培养基中终浓度分别为1×10-4,1×10-5,1×10-6,1×10-7 mol·L-1.增殖分析采用MTT法,于成骨性诱导培养第4,8,12,16天测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量,第15天进行ALP和钙化结节组织化学染色及计数.成骨性诱导后不同时间点提取总RNA,Real-time RT-PCR法检测bFGF,IGF-1,Osterix与Runx-2等成骨性相关的基因表达情况.结果:异补骨脂素剂量依赖性抑制BMSCs增殖,但能促进其成骨性分化,表现为提高BMSCs的ALP活性、促进骨钙素分泌、钙盐沉积量、增加钙化结节数量、提高bFGF,IGF-1,Osterix,Runx-2 mRNA表达水平.结论:终浓度为1×10-5 mol·L-1异补骨脂素能显著促进BMSCs的成骨性分化,证明异补骨脂素是中药补骨脂中抗骨质疏松的有效成分.     

复叶耳蕨总黄酮通过BMP信号通路促进MSC成骨分化

目的:研究复叶耳蕨总黄酮(total flavonoids from Arachniodes exilis,TFA)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的作用及其分子机制。方法:通过茜素红染色、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性考查BMSCs成骨情况;RT-PCR检测Ⅰ型胶原酶α1(collagen typeⅠα1,COL1A1)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopotin,OPN)、BMP2、BMP4、Runx2、Osterix转录水平;ELISA检测骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路相关蛋白BMP2、BMP4、Runx2表达情况。结果:TFA能显著增加BMSCs碱钙结节的形成、ALP活性,上调COL1A1、OCN、OPN的表达,促进BMSCs成骨分化,而Noggin能抑制该作用;TFA能显著上调BMP2、BMP4、Runx2、Osterix的表达。结论:TFA可能通过BMP信号通路促进大鼠BMSCs成骨分化。     

淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化作用的实验研究

目的观察淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化的作用特点。方法 (1)采用机械分离及全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,氨基安替吡啉测酚法检测不同浓度的淫羊藿苷在第3、6、9、12、15、18、21天对细胞上清液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响,采用茜素红染色法检测各浓度组BMSCs矿化情况,观察不同浓度的淫羊藿苷促BMSCs骨向分化的作用。(2)将BMSCs细胞分为空白对照组、成骨诱导组及淫羊藿苷组(0.5μg/m L),在培养第7、14、21天检测各组细胞上清ALP活性,并于第14及21天分别检测各组细胞ALP阳性染色率与矿化结节数,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测3个不同时间点各组细胞中核心结合蛋白因子(Runt-related transcripition factor-2,Runx2)及骨钙素(Osteocalcin)mRNA的表达水平。结果 (1)0.05~5.0μg/m L淫羊藿苷均可明显提高细胞上清液中ALP活性,其中0.2~2.0μg/m L浓度组细胞结节数亦明显增加(P0.01)。(2)淫羊藿苷促BMSCs骨向分化时,Runx2 mRNA表达水平及ALP活性均先升后降;Osteocalcin mRNA表达水平则持续上升(P0.01);与成骨诱导组比较,作用14天后,淫羊藿苷组ALP活性及ALP阳性染色率均明显提高(P0.05,P0.01)。结论淫羊藿苷通过上调Runx2基因的表达,促使BMSCs向成骨细胞分化,并通过增加细胞ALP分泌及Osteocalcin基因的表达,促进细胞矿化的发生,从而促使新生成骨细胞的成熟。     

龟板提取物上调维生素D受体表达促骨髓间充质干细胞向成骨分化

目的 探讨龟板提取物诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向成骨分化和对维生素D受体(VDR)表达的影响.方法 从大鼠骨髓中分离MSCs.体外培养,利用流式细胞术检测MSCs表面抗原CD44细胞标志,体外培养MSCs分成不同的组观察其向成骨分化,在培养基中不加任何处理的作为对照组,培养基中加成骨诱导液诱导MSCs向成骨分化作为阳性对照组,龟板提取物组在培养基中加龟板提取物,诱导7 d后,通过免疫化学染色、Western blotting、原位杂交、RT-PCR等方法观察龟板提取物对原代培养的MSCs向成骨分化的成骨分化标记分子碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)及VDR阳性表达及VDR mRNA的表达情况.结果 免疫组化染色显示,龟板提取物组成骨分化标记分子ALP、OPN和VDR的阳性百分比明显高于对照组,Western blotting结果也显示龟板提取物组的ALP、OPN和VDR的蛋白表达水平高于对照组;同时原位杂交、RT-PCR结果表明.龟板提取物诱导MSCs向成骨分化过程可明显促进VDR mRNA的表达.结论 龟板提取物可促MSCs向成骨分化,其机制可能与VDR的上调有关.     

中药干预骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化及其机制的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是来源于中胚层并具备多向分化潜力的多功能干细胞,是骨髓内成骨细胞和脂肪细胞的共同来源,且在成骨分化与成脂分化间维持着动态平衡。近年来的研究表明大量中药能够通过Wnt/β-catenin信号通路、Runx-2、ALP等相关成骨因子和PPAR-γ途径有效调控BMSCs的成骨分化和成脂分化。本文就中药对BMSCs成骨及成脂分化的影响效应和机制进行简要概括。     

右归丸方含药血清对BMSC增殖、骨向分化的干预作用研究

目的:观察右归丸含药血清对骨髓基质干细胞的骨向分化诱导作用,通过右归丸含药血清对骨髓基质干细胞Akt、mTOR磷酸化水平的影响,探讨右归丸含药血清促骨髓基质干细胞骨向分化的部分作用机制。方法:制备高中低3个剂量的右归丸大鼠含药血清,提取大鼠骨髓基质干细胞,传至第3代,将细胞随机分为5组:空白对照组、空白血清组、低剂量含药血清组、中剂量含药血清组、高剂量含药血清组。分别给予不同浓度血清及PBS干预24 h后,检测各组细胞中碱性磷酸酶活性、骨钙素表达水平及Akt、mTOR磷酸化水平。结果:空白对照组与空白血清组之间比较,ALP、Osteocalcin、p-Akt、p-mTOR表达水平无统计学差异(P>0.05),与空白对照组和空白血清组比较,3个剂量含药血清组细胞中ALP活性及Osteocalcin、p-Akt、p-mTOR表达水平均不同程度提高(P>0.01),但中剂量和高剂量含药血清组ALP活性及Osteocalcin、p-Akt、p-mTOR表达水平均无显著性差异(P>0.05)。结论:右归丸含药血清具有一定的促进骨髓基质干细胞骨向分化的作用,该作用可能是通过提高Akt、mTOR的磷酸化水平而实现的。