脂质体介导骨保护素基因转染大鼠骨髓基质干细胞及其表达

背景:基因修饰骨组织工程种子细胞,可提高对骨缺损的修复能力.目的:构建含有骨保护素的真核表达载体并检测转染骨髓基质干细胞后的表达.方法:取4周龄SD大鼠胫骨和股骨行骨髓基质干细胞的分离和培养,分为载体组、空载体组、对照组.空载体组转染plRES2-EGFP载体,载体组转染plRES2-EGFP-OPG.结果与结论:转染后激光扫描共聚焦显微镜观察可见骨髓基质干细胞内绿色荧光蛋白表达;RT-PCR检测结果可见质粒载体组在1 200 bp有明显条带,空载体组及对照组未见表达;免疫细胞化学检测骨髓基质干细胞内骨保护素蛋白呈阳性;MTT法检测各组细胞增殖活力无明显改变(P > 0.05).证实应用plRES2-EGFP-骨保护素质粒转染大鼠骨髓基质干细胞,可获得外源性骨保护素的基因及蛋白表达.     

脂质体介导骨保护素基因转染大鼠骨髓基质干细胞及其表达

背景：基因修饰骨组织工程种子细胞,可提高对骨缺损的修复能力。目的：构建含有骨保护素的真核表达载体并检测转染骨髓基质干细胞后的表达。方法：取4周龄SD大鼠胫骨和股骨行骨髓基质干细胞的分离和培养,分为载体组、空载体组、对照组。空载体组转染plRES2-EGFP载体,载体组转染plRES2-EGFP-OPG。结果与结论：转染后激光扫描共聚焦显微镜观察可见骨髓基质干细胞内绿色荧光蛋白表达;RT-PCR检测结果可见质粒载体组在1200bp有明显条带,空载体组及对照组未见表达;免疫细胞化学检测骨髓基质干细胞内骨保护素蛋白呈阳性;MTT法检测各组细胞增殖活力无明显改变（P〉0.05）。证实应用plRES2-EGFP-骨保护素质粒转染大鼠骨髓基质干细胞,可获得外源性骨保护素的基因及蛋白表达。     

骨髓基质细胞的成骨分化

目的 观察兔骨髓基质2细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法 使用密度梯度离心分离兔骨髓基质细胞进行培养，保留贴壁细胞传代，观察在培养液中添加地塞米松，维生素C，β-甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况。结果 骨髓基质细胞呈成纤维细胞增表现，增殖能力强。诱导条件下第2代细胞的碱性磷酸酶活性明显增高，10－12d达到最高峰，并且出现矿化结节。结论 使用本实验方法，获得的骨髓基质细胞可作为骨组织工程的种子细胞。     

骨髓基质细胞的成骨分化

目的观察兔骨髓基质细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法使用密度梯度离心分离兔骨髓基质细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,观察在培养液中添加地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况。结果骨髓基质细胞呈成纤维细胞样表现,增殖能力强。诱导条件下第2代细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,10～12d达到最高峰,并且出现矿化结节。结论使用本实验方法,获得的骨髓基质细胞可作为骨组织工程的种子细胞。     

氯化镧对骨髓基质细胞与支架复合物骨矿化能力的影响

目的:观察氯化镧(LaCl2)干预后的体外培养的骨髓基质细胞(BMSCs)与脱钙冻干骨(MDBM)复合后的异位威骨能力.方法:将经过5.564×102、5.554、5.564×10-2μg/mL 3种浓度La3+干预的第3代BMSCs、空白对照组和骨形成蛋白-2阳性对照组细胞与fdDBM复合后回植入裸鼠皮下,8周后对回植标本做组织学分析、X线密度测定及钙磷含量测定.结果:回植物组织切片显示各组标本均可见新生的骨组织样结构.La3+干预各组的X线密度及钙磷含量均数与空白支架组比较差异均有显著性.但La3+"干预各组组间差异不具统计学意义.结论:5.564×102、5.564、5.564×102μg/mL 3种浓度的La3+均能促进组织工程骨矿化,以5.564 μg/mL的LaCl3促进骨矿化作用较强.     

体外培养人体脂肪基质细胞和骨髓基质细胞的成骨活性对比

背景:目前组织工程骨构建研究中的种子细胞主要来源于骨、骨膜、骨髓及骨外组织,近年来的研究多集中于骨髓基质细胞.而脂肪中基质细胞的发现,有望取代骨髓基质细胞.目的:观察体外培养脂肪基质细胞与骨髓基质细胞的生物学特性,并比较二者成骨诱导后的碱性磷酸酶活性,从成骨活性方面来评价脂肪基质细胞能否取代骨髓基质细胞.方法:手术中收集同一人体的脂肪组织与骨髓组织.脂肪组织经机械切割后以Ⅰ型胶原酶消化获得脂肪基质细胞,骨髓组织以淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓基质细胞;体外培养、传代后以诱导培养液行成骨诱导培养.诱导后第2,3周各检测1次细胞中的碱性磷酸酶活性,并行Von Kossa钙结节染色鉴定成骨细胞.结果与结论:共获得15例患者的脂肪与骨髓组织,其中10例完成实验.与骨髓基质细胞相比,脂肪基质细胞更易培养成活,扩增速度快;二者细胞形态相似,诱导培养后细胞外基质中均有黑色的钙结节形成;碱性磷酸酶活性二者差异无显著性意义(P > 0.05).结果提示脂肪组织来源丰富,脂肪基质细胞成活容易,具有与骨髓基质细胞相似的生物学性能,且易培养、增殖快,二者的成骨活性相似,脂肪基质细胞比骨髓基质细胞更具有优势.     

一种新型米诺环素修饰的骨修复材料对大鼠骨髓基质干细胞增殖和分化能力的影响

目的观察新型骨修复材料—明胶-羟基磷灰石-米诺环素(Gel-HA-M)纳米复合物骨修复材料对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖和分化能力的影响。方法在大鼠骨髓基质干细胞培养时,分别加入含不同浓度(0mg,5 mg)米诺环素的Gel-HA-M纳米复合物。采用CCK-8法检测BMSCs的增殖能力,碱性磷酸酶(ALP)法检测BMSCs的分化情况。结果随着培养时间的延长,BMSCs的增殖能力和分化活性逐渐升高,M-000和M-050组的OD值与对照组相比,均无统计学差异(P0.05);M-000组和M-050组的OD值差异无统计学意义(P0.05)。结论 Gel-HA-M这种新型米诺环素修饰的骨修复材料对大鼠骨髓基质干细胞具有良好的生物相容性,不会影响其增殖和分化能力。     

离心力对兔骨髓基质细胞成骨分化的影响

背景:在骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中,离心力是一种促进因素.目的:探讨离心力是否能促进复合于聚羟基乙酸共聚物材料上的兔骨髓基质细胞向成骨方向分化.方法:全骨髓法分离培养兔骨髓基质细胞,贴壁法纯化,至细胞达80%融合时胰酶-EDTA消化传代,调整细胞浓度为1× 10~9 L~(-1).将聚羟基乙酸共聚物切割成5 mm×5 mm大小,预先浸泡入含血清培养基内24 h,然后将第3代骨髓基质细胞悬液按300 μL/块密度接种于支架材料表面,将复合物置入离心管底,细胞滴加面朝上,加入含抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松的成骨诱导培养基.设立2组:离心力刺激组每间隔12 h将离心培养管置于离心机上,按1 000 r/min离心30 min,相对离心力132 g;对照组培养管中细胞不作离心静态培养.通过光镜观察及检测碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、组织钙含量,评估成骨细胞的分化水平.结果与结论:体外培养第16天,离心力刺激组支架表面被多层细胞和矿化基质所覆盖,而对照组仅支架表层见一薄层细胞.与对照组比较,离心力刺激组培养后第2天碱性磷酸酶活性明显降低(P < 0.05),第4天碱性磷酸酶活性明显升高(P < 0.05).在整个培养期间对照组骨钙素质量浓度一直维持低水平,离心力刺激组第12,16天骨钙素质量浓度明显高于对照组(P < 0.05).培养16 d后离心力刺激组的钙质量浓度明显高于对照组(P < 0.05).提示离心力能促进接种于聚羟基乙酸共聚物的兔骨髓基质细胞成骨分化,并形成矿化产物.     

血清骨桥蛋白和骨保护素与2型糖尿病合并冠心病的相关性分析

目的:探讨血清骨桥蛋白、骨保护素与2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）合并冠心病的关系,并评价T2DM患者血清骨桥蛋白、骨保护素水平与冠状动脉病变严重程度的相关性。方法:连续入选2019年11月至2020年12月于承德医学院附属医院疑诊为稳定性冠心病,并行冠状动脉造影术检查的100例...     

低频振动对骨髓基质细胞成骨能力影响及机制的研究

目的了解低频振动对骨髓基质细胞（BMSCs）成骨能力及其OPG基因、RANKL基因表达的影响。方法分离、培养10周龄雌性SD大鼠BMSCs，随机分为静止培养对照组和振动组，振动组于培养的第11天开始接受振动干预7d；振动结束后对两组BMSCs的增殖、碱性磷酸酶（ALP）、钙化结节及OPG mRNA、RANKL mRNA进行检测。结果振动组BMSCs增殖能力较对照组明显提高（P〈0．05），但ALP活性、钙化结节无明显改变。振动组BMSCs OPG基因表达明显上调（P〈0．05），RANKL基因表达无明显变化。结论低频振动可促进BMSCs的增殖，可能与其促进OPG基因表达上调有关；但未发现能使BMSCs成骨能力出现明显改变。     

烧伤前后大鼠血清对骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的 :观察烧伤前后大鼠血清对体外培养的大鼠骨髓基质细胞 (BMSCs)的生物学行为的影响 ,为BMSCs在创伤修复中的应用奠定实验基础。方法 :取 Wistar大鼠 ,处死 ,分离骨髓 ,原代培养 BMSCs,传代后分别用含有体积分数为 10 %的胎牛血清 (FCS,F组 )、正常大鼠血清 (N组 )、烧伤后 3d大鼠血清 (B1组 )和烧伤后 14 d大鼠血清 (B2组 )的 F 12培养基培养 ,用噻唑蓝 (MTT)法测定其生长曲线 ,碘化丙啶 (PI)染色 ,流式细胞仪分析细胞周期、DNA含量和细胞凋亡率。结果 :用含有 10 %大鼠血清的 F 12培养基传代培养的细胞生长曲线相似 ,但与含有 FCS的 F 12培养基传代培养的明显不同 ,前者倍增时间缩短 ,N组、B1组、B2组细胞群体倍增时间分别为 2 3.7h、18.6 h和 2 0 .2 h,且平台期所能达到的细胞总数明显增加。烧伤后大鼠血清处理的细胞中 G0 /G1期细胞比例明显低于其他两组 (P均 <0 .0 1) ,而 S期细胞的比例则相反 (P<0 .0 1)。大鼠血清处理的细胞中 DNA含量明显高于 FCS培养的细胞 (P<0 .0 5或 P<0 .0 1) ,而烧伤后的大鼠血清处理的细胞中 DNA含量又明显高于正常大鼠血清处理的细胞 (P<0 .0 1)。烧伤后 3d的大鼠血清处理的细胞的凋亡率比其他组细胞明显升高 (P<0 .0 1)。结论 :大鼠血清比胎牛血清能更好地促进大鼠     

模拟失重对大鼠承重骨骨髓基质细胞数量及体外成骨能力的影响

背景:骨组织在特殊物理环境如失重环境下,代谢活动会发生显著的变化,而成骨细胞是骨代谢和骨形成的核心部分,其对重力环境的变化敏感。目的:观察模拟失重条件对大鼠股骨骨髓基质细胞数量体外成骨能力的影响,揭示骨丢失的机制。设计:随机配对,对照实验。单位:解放军第四军医大学航空航天医学系和口腔医学院病理科。材料:选用20只成年健康雄性SD大鼠。实验开始当日按体质量随机分为对照组和悬吊组,每组10只。碱性磷酸酶试剂盒由北京中生生物工程高技术公司生产。方法:实验于1999-11/2000-07在解放军第四军医大学口腔医学院病理科完成。将SD大鼠随机配对分为鼠尾悬吊组和对照组,每组10只。悬吊组大鼠做尾部悬吊28d,大鼠始终保持30°头低位及后肢自由悬垂不负重状态。对照组正常饲养。实验期满,取股骨,将股骨骨髓基质细胞进行原代和传代细胞培养。主要观察指标:采用细胞计数法和噻唑蓝法绘制原代和传代培养细胞的生长曲线,进行碱性磷酸酶活性及体外矿化小结形成量的检测。结果:①碱性磷酸酶活性:原代和传代培养悬吊组低于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。②钙化小结形成数:悬吊组少于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。③细胞生长:原代和传代股骨间充质细胞的生长曲线呈"S"形,悬吊组和对照组细胞倍增时间相近。④股骨骨髓基质细胞数:原代细胞培养系中,悬吊组比对照组约少50%(P<0.05)。结论:模拟失重条件下,大鼠骨髓基质细胞数明显减少,后肢承重骨成骨细胞数减少,体外成骨能力降低。     

骨髓基质细胞移植对大鼠局灶性脑损伤VEGF表达的影响

目的观察骨髓基质细胞(BMSCs)移植对局灶性脑损伤大鼠损伤局部脑组织血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法制备大鼠局灶性脑损伤动物模型,进行BMSCs移植,通过免疫组织化学、荧光定量PCR、ELISA等方法观察移植局部脑组织VEGF以及VEGF mRNA的变化。结果BMSCs移植后,局部VEGF染色阳性细胞数增加;VEGF mRNA含量增高。结论BMSCs移植可促进内源性VEGF的表达,提高损伤局部VEGF的含量。     

骨髓基质细胞成骨诱导影响因子及中医药研究思路探讨

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是位于骨髓中的一种干细胞,因近年来大量研究表明,在体外经适当的培养条件可以向成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、成肌细胞等多种间充质来源的中胚层组织细胞分化,又被称为间充质干细胞(mesenchymal stem cell)。同时具有取材方便、机体损伤小、易于临床应用等优点,是目前最为合适的骨组织工程的种子细胞。在常用的BMSCs定向成骨诱导方法中,多选择地塞米松、VitC和β-甘油磷酸钠作为主要诱导剂,对其诱导过程的机制亦逐渐深入,而有关中医药在此过程中的作用研究相对较少,现将…     

RNA干涉抑制破骨细胞分化因子表达对骨髓基质细胞成骨成脂分化的影响

背景:RNA干涉是目前分子生物学研究领域重要的基因下调技术,护骨素/κB受体活化因子/破骨细胞分化因子偶联系统是目前骨改建平衡研究中的热点。目的:应用RNA干涉特异性抑制大鼠骨髓基质细胞内破骨细胞分化因子基因的表达,研究破骨细胞分化因子表达下调后对骨髓基质细胞成骨成脂分化的影响。方法:获取骨髓基质细胞,转染前24h按5×105/孔接种于6孔培养板中,分为实验组、阴性对照组和空白对照组,前2组细胞分别转染针对破骨细胞分化因子的siRNA或阴性对照siRNA。观察骨髓基质细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性及Real-TimePCR检测成骨成脂基因mRNA的表达。结果与结论:实验组碱性磷酸酶活性降低,RunX-2,骨形态发生蛋白2,4表达降低,而PPAR-γ和C/EBP-α的表达升高(P<0.05)。提示,通过RNA干涉使骨髓基质细胞的破骨细胞分化因子表达下调对骨髓基质细胞成骨分化有抑制作用,而对成脂分化有促进作用。     

RNA干涉抑制破骨细胞分化因子表达对骨髓基质细胞成骨成脂分化的影响

背景：RNA干涉是目前分子生物学研究领域重要的基因下调技术,护骨素/κB受体活化因子/破骨细胞分化因子偶联系统是目前骨改建平衡研究中的热点。目的：应用RNA干涉特异性抑制大鼠骨髓基质细胞内破骨细胞分化因子基因的表达,研究破骨细胞分化因子表达下调后对骨髓基质细胞成骨成脂分化的影响。方法：获取骨髓基质细胞,转染前24h按5×105/孔接种于6孔培养板中,分为实验组、阴性对照组和空白对照组,前2组细胞分别转染针对破骨细胞分化因子的siRNA或阴性对照siRNA。观察骨髓基质细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性及Real-TimePCR检测成骨成脂基因mRNA的表达。结果与结论：实验组碱性磷酸酶活性降低,RunX-2,骨形态发生蛋白2,4表达降低,而PPAR-γ和C/EBP-α的表达升高（P〈0.05）。提示,通过RNA干涉使骨髓基质细胞的破骨细胞分化因子表达下调对骨髓基质细胞成骨分化有抑制作用,而对成脂分化有促进作用。     

奥美沙坦酯对动脉粥样硬化大鼠骨保护素表达的影响

目的探讨奥美沙坦酯对动脉粥样硬化模型大鼠骨保护素、血清炎症因子表达的影响。方法 2015年于江苏省血吸虫病防治研究所收集24只SD大鼠,随机均分为3组。对照组大鼠饲喂普通饲料。模型组大鼠饲喂高脂饲料(普通饲料+0.2%胆酸钠+7×105 IU/(kg·d)维生素D3+2%胆固醇+5%山羊脂肪)。奥美沙坦酯组大鼠饲喂高脂饲料的同时予3mg/(kg·d)奥美沙坦酯灌胃。饲养4周后观察各组大鼠主动脉病理形态学变化,分别检测血清血脂(包括总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、三酰甘油)和血清超敏C反应蛋白水平,免疫组织化学染色和蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测骨保护素在主动脉的表达。结果模型组大鼠血清血脂和超敏C反应蛋白水平明显升高,内膜厚度与内膜/中膜厚度比明显升高,主动脉中骨保护素表达较对照组显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。奥美沙坦酯组与模型组相比,血清高密度脂蛋白明显升高,其他血清血脂和超敏C反应蛋白水平明显下降,主动脉中骨保护素表达减少,内膜厚度、内膜/中膜厚度比明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论奥美沙坦酯可能通过改善血脂、降低动脉骨保护素表达和血清炎症因子水平抑制动脉粥样硬化进展。     

骨髓基质细胞的研究进展

骨髓基质细胞在造血调控、骨损伤修复等基础研究和临床应用中具有重要意义。骨髓基质细胞由多种形态各异的细胞成分组成,其中含少量基质干细胞,其表型独特,并直多向分化的潜能。骨髓基质细胞可分泌多种正负造血调控因子,以维持造血干细胞的增殖、分化和自我更新。基质细胞的成骨作用,缘于成骨前体细胞,并受多种细胞因子和特异性蛋白的调节作用。     

同种异体颗粒骨对骨髓基质细胞影响的实验研究

目的 探讨同种异体颗粒骨对骨髓基质细胞粘附及分化的影响。方法 本实验取同种异体白兔皮质骨造成骨颗粒(直径100μ-500μ)，经低温冷冻(-70℃)一周后，与骨髓基质细胞(第二代)相结合进行体外培养(设为实验组)；另取未复合骨颗粒的骨髓基质细胞行体外培养(设为对照组)。两周后，倒置显微镜观察、光镜、四环素荧光标记、扫描电镜、透射电镜、碱性磷酸酶染色等方法观测骨髓基质细胞的粘附及分化情况。结果 实验：光镜及电镜观察，细胞紧密贴附于骨颗粒表面，细胞体积较大，胞浆丰富，内含丰富的核糖体、粗面内质网、高尔基复合体和线粒体，部分线粒体基质内有致密的颗粒状沉积：四环素荧光染色后，有金黄色荧光结节出现；碱性磷酸酶染色显示，阳性率大于百分之七十。对照组：电镜观察，细胞多呈长梭型，核大，可见核仁，胞浆内有核糖体、线粒体、内质网；四环素染色呈阴性；碱性磷酸酶染色率为百分之四十。结论 同种异体颗粒骨可诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化；同种异体颗粒骨与骨髓基质细胞之间有较强的粘附作用；同种异体颗粒骨可用作骨组织工程细胞外基质替代物。     

慢性淋巴细胞性白血病骨髓基质细胞和正常骨髓基质细胞的比较性分析

本研究旨在对慢性淋巴细胞性白血病原代骨髓基质细胞（CLL-human bone marrow stromal cells,CLL-hBM-SC）和正常原代骨髓基质细胞（normal hBMSC,N-hBMSC）进行比较性分析,为建立CLL-CLL-hBMSC相互作用模型,从而更好地模拟CLL体内环境提供理论依据.从CLL患者和正常供者骨髓中分离单个核细胞,进行原代骨髓基质细胞（hBMSC）培养;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测CLL-hBMSC和N-hBMSC表面粘附分子如血管细胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1）和细胞间粘附分子1（intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1）的mRNA水平;采用real-time PCR和Western blot法分别检测两类不同来源的hBMSC中淋巴毒素β受体（lymphotoxin beta receptor,LTβR）的mRNA和蛋白质表达水平;采用Western blot法检测NF-κB家族成员的表达并分析细胞因子LTα1β2对NF-κB家族成员表达的影响;建立hBMSC和CLL细胞共培养体系,利用碘化丙啶（PI）染色检测细胞死亡情况.结果表明：从CLL患者骨髓中能成功地培养出贴壁的成纤维样hBMSC.与N-hBMSC相似,表面粘附分子VCAM-1和ICAM-1在两类hBMSC中的mRNA表达一致;两类hBMSC中LTβR的mRNA和蛋白表达水平相似;各NF-κB家族成员在两类hBMSC中都有表达,且蛋白水平无显著性差异;细胞因子LTα1β2可诱导hBMSC中经典性和非经典性NF-κB信号通路的活化;体外实验表明,两类hBMSC都能够有效地支持CLL细胞的体外存活.结论：两类hBMSC培养效率以及细胞形态上无明显差异.LTβR-NF-κB信号分子在两类hBMSC的表达以及活化情况相似.