体外诱导间充质干细胞向心肌细胞方向分化的研究

目的证实来源于胎儿肝脏的间充质干细胞(FMSCs)具有向心肌细胞方向分化的潜能。方法取6~9代细胞,用不同浓度的诱导剂组合诱导细胞,分别置于不同的条件下进行培养,包括不同温度、不同氧浓度及不同培养液。结果在使用心肌分化培养液及常规培养条件下(37℃、20%O2),5-氮胞苷(50μmol/L)、维甲酸(10-3μmol/L)、二甲基亚砜(0.8%)的联合应用,诱导了FMSCs发生向心肌方向的分化。分化细胞呈小圆形细胞,具有相互聚集并形成球样细胞团结构的趋势,同时表达结蛋白及心肌肌钙蛋白Ⅰ。结论FMSCs具有向心肌细胞分化的潜能,FMSCs发生向心肌方向的分化所需条件与来源于其他动物种属的间充质干细胞的分化条件不同。     

微环境预处理的骨髓间充质干细胞治疗大鼠心肌梗死

目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSC)或经预处理分化的BMSC(induced BMSC,iBMSC)移植能否改善心肌梗死大鼠的心功能.方法雄性SD大鼠32只(250～300 g),分为假手术组、磷酸缓冲液(PBS)注射组、BMSC移植组和iBMSC移植组共4组,每组8只.将分离的BMSC与心肌细胞(微环境)共培养2周进行预分化,大鼠心肌梗死模型建立1周后,将BMSC或iBMSC细胞悬液注入梗死区的边缘位置.分别于细胞移植后的第1、2和4周,超声心动图检测各组大鼠心脏的左心室射血分数(LVEF),左心室舒张末期内径(LVIDd),左心室收缩末期内径(LVIDs)及短轴缩短率(FS).移植后第4周进行组织学观察,心脏组织石蜡包埋切片后采用免疫荧光技术检测移植细胞的示踪标记物及心肌标志蛋白的表达情况.结果iBMSC组LVEF在第4周时是(77.3±2.6)%,与假手术组(81.8±3.6)%比较差异无统计学意义(P＞0.05),而PBS组及BMSC组的LVEF值均低于假手术组(P均＜0.05).PBS组FS移植前后没明显变化,iBMSC组FS从移植前的(24.1±3.9)%上升到第4周的(45.1±3.1)%.M型超声心电图显示iBMSC治疗组左心室收缩能力较细胞移植前明显改善.免疫荧光分析显示,SPIO标记的移植细胞在体内表达心肌细胞标志蛋白α-辅肌动蛋白和缝隙连接蛋白43.结论经过微环境预处理的BMSC较未处理的干细胞改善心功能效果更好.这一研究为干细胞的改造与细胞移植修复心肌梗死提供了强有力的证据.     

丹参酮ⅡA诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

目的探讨丹参酮ⅡA对骨髓间充质干细胞(BMSC)定向分化为心肌样细胞的影响。方法取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养BMSC,第2代细胞应用终浓度为500ng/ml丹参酮ⅡA定向诱导(诱导组),将不添加任何诱导剂的BMSC设为对照组。应用免疫细胞化学技术检测结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA-actin)和心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达情况。免疫荧光双标染色技术检测α-SCA-actin和cTnT的表达。透射电镜观察2组超微结构的改变。结果免疫细胞化学染色结果显示,与对照组比较,诱导组BMSC中结蛋白(50 279.6±2575.2)vs(1325.6±196.1)、α-SCA-actin(44 738.3±1963.3)vs(1446.3±202.4)、cTnT(27 658.8±2382.2)vs(1369.1±214.2)明显升高(P<0.01)。免疫荧光双标染色法检测诱导组α-SCA-actin阳性为红色,cTnT阳性为绿色,两者重叠部位为黄色,呈现共表达。透射电镜结果显示,诱导组细胞可见平行排列的肌丝并富含线粒体、糖原和核糖体以及丰富的粗面内质网。结论经丹参酮ⅡA诱导的BMSC具有向心肌细胞分化的表型。     

骨髓间充质干细胞心肌样分化的微环境因素

目的:探讨促使骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌样分化的微环境因素。方法:分离大鼠MSCs并传至第6代,随机分为混合培养组、条件组及对照组,分别将MSCs与大鼠心肌细胞共同培养(混合培养组),或将心肌细胞培养上清液加入MSCs培养体系(条件组)。1周后,检测MSCs的心肌特异性蛋白titin、Cx43及MHC表达情况。结果:MSCs能在心肌细胞培养上清液及与心肌细胞共同培养中正常生长;条件组MSCs表达titin、Cx43显著增加,但未观察到肌小节样结构;混合培养组MSCs可表达上述蛋白,且部分细胞中可观察到肌小节样结构,与心肌细胞交界面上有Cx43的聚集。3组MSCs均未检测到MHC表达。结论:心肌细胞自身、源于心肌的体液因素及MSCs分化过程中形成的感应器是MSCs心肌样分化的必要条件。     

人脐血间充质干细胞抑制心肌细胞凋亡的作用与安全性

目的探讨人脐带血来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)诱导后的安全性及其与人心肌细胞共培养下的抗凋亡作用。方法在知情同意的原则下,取得10位供者分娩时的脐带血。脐带血来源的MSCs经5-氮杂胞苷处理后向心肌细胞诱导分化。观察诱导分化的MSCs端粒酶活性,G带显带技术下的染色体组型,裸鼠体内诱导肿瘤形成,RT-PCR以及共培养下对心肌细胞凋亡的抑制作用。结果脐带血来源的MSCs可在体外经5-氮杂胞苷诱导分化为心肌细胞,诱导后的细胞具有端粒酶活性,未观察到异常的染色体组型。p53、cyclinA、Cdk2、β-肌动蛋白、c-fos、h-TERT和c-myc在5-氮杂胞苷处理前后的MSCs中表达相似。注射到裸鼠体内未见肿瘤形成。脐带血来源的MSCs对人心肌细胞凋亡有明显的抑制作用。结论脐带血来源的MSCs是一种安全有效的移植治疗的细胞来源,共培养下能抑制人心肌细胞的凋亡。     

关于骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导剂研究概况

骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化潜能,且在体外容易扩增培养,是一种治疗心梗理想的种子细胞,通过诱导剂将骨髓间充质干细胞诱导为心肌样细胞是心血管领域研究的热门话题.本文就目前常用的诱导剂作一概况.     

人双突变型低氧诱导因子α促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的 探讨人双突变型低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因(HIF-1α-402-564)对与心肌细胞共培养的骨髓间充质干细胞(MSC)向心肌细胞分化的影响.方法 实验分为4组:HIF-1α组(MSC+心肌细胞+Ad-HIF-1α)、LacZ组(MSC+心肌细胞+Ad-Lacz)、Sham组[MSC+心肌细胞+胎牛血清(PBS)]、MSC+HIF-1α组(MSC+Ad-HIF-1α),前三组中MSC与心肌细胞按1:2比例共同培养,各组细胞培养24 h后分别感染不同病毒(MOI=100)或加入PBS液.病毒感染后7 d,免疫细胞化学分析共培养的MSC表达心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT)的情况,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析各组细胞HIF-1α、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad4、NKx2.5、GATA结合蛋白4(GATA-4)的mRNA表达量.结果 HIF-1α组MSc心肌细胞分化率为(32.68±6.52)%,显著高于LacZ组[(8.28±0.09)%]和Sham组[(10.25±2.20)%],P均<0.05,MSC±HIF-1α组仅为(0.32±0.05)%.LacZ组和Sham组间差异无统计学意义.MSC+HIF-1α组与Sham组比较,差异有统计学意义(P<0.05).HIF-1α组TGFβ1及Smad4 mRNA表达水平明显高于其余各组,P均<0.05.HIF-1α组NKx2.5和GATA-4 mRNA表达水平明显高于Sham组,P均<0.05.结论 HIF-1α能够促进与心肌细胞共培养的MSC向心肌细胞分化,TGF-β1/Smad4信号通路参与了该过程.     

心肌细胞裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化作用

目的:用心肌细胞裂解液体外诱导分化骨髓间充质干细胞(SMCs),观察SMCs能否表达脑钠肽(BNP)及β1受体mRNA,是否具有受体后信号转导通路.方法:分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年小鼠长骨骨髓中分离MSCs,并用含有心肌细胞裂解液的培养基培养1周.用逆转录聚合酶链反应方法定性检测MSCs中BNP及β1受体mRNA水平,用放射免疫方法测定MSCs中环磷酸腺苷(cAMP)的含量.结果:诱导组SMCs能表达BNP及β1受体mRNA,对照组不表达BNP和β1受体mRNA.诱导的SMCs经10-8,10-7,10-6,10-5mol/L异丙肾上腺素(ISO)作用2 h后,均能增加细胞内cAMP含量,且具有ISO浓度依赖性(P＜0.05或P＜0.01).诱导的SMCs经不同浓度的美托洛尔(MET)10-6,10-5 mmol/L作用10 min后,和1×10-7mol/L ISO再一起作用110 min后,测定细胞内cAMP含量与空白组比较,差异无统计学意义;与10-7mol/L ISO作用结果比较,差异有统计学意义(P＜0.01),表明MET能完全阻断ISO升高细胞内cAMP作用.结论:心肌细胞裂解液能体外模拟心肌微环境诱导分化SMCs表达β1受体及BNP mRNA,并具有受体后活性的信号转导通路.     

CCN 3对骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的影响

目的：探讨肾母细胞瘤过度表达基因（CCN3）对骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）向内皮细胞分化的影响。方法：以含50ng/ml血管内皮生长因子培养基诱导 BM-MSCs向内皮细胞分化作为阳性对照组,以含100ng/ml重组CCN3蛋白并50ng/ml血管内皮生长因子培养基诱导BM-MSCs向内皮细胞分化作为CCN3组,并以单纯完全培养基培养BM-MSCs为阴性对照组,采用细胞免疫荧光化学法和半定量逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检查诱导16 d后假性血友病因子（vWF）表达以评价内皮细胞分化,以半定量 RT-PCR法检测 BM-MSCs 诱导分化前后Notch1基因mRNA表达。结果：BM-MSCs 诱导分化16d 后,阳性对照组可见部分细胞 vWF 荧光染色阳性, CCN3组阳性染色细胞明显多于阳性对照组,且 vWF mRNA 表达明显强于阳性对照组[吸光度（OD）值比：（0.550±0.090）比（0.358±0.080）,P＜0.01],阴性对照组未见阳性染色细胞;此外,诱导分化前,三组Notch1基因mRNA均呈低表达,组间两两比较无明显差异（P 均＞0.05）,诱导分化16d后阳性对照组和 CCN3组 Notch1基因 mRNA表达明显强于阴性对照组[OD值比：（0.232±0.047）、（0.352±0.029）比（0.132±0.033）,P均＜0.01],但与阳性对照组相比,CCN3组 Notch1基因 mRNA表达明显更高（P＜0.01）。结论：肾母细胞瘤过度表达基因通过激活 Notch1信号通路可增强骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的能力。     

人骨髓间充质干细胞体外心肌样细胞诱导分化中细胞周期与凋亡的分析

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向心肌样细胞分化过程中分化与凋亡的情况,为hMSCs临床移植治疗提供数据。方法采用体外纯化、扩增后的第4代hMSCs,分3组在体外分别经0μmol/L、2.5　μmol/L、5.0μmol/L 5-杂氮胞苷(5-Aza)诱导24 h后继续培养8周,相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测各组细胞周期及凋亡指数,应用RT-PCR技术分析肌球蛋白重链(β-MHC)、肌钙蛋白T(cTNT)、凋亡相关基因(Bcl-2、Bax)的mRNA在分化过程中的动态表达。结果hMSCs诱导后凋亡指数随诱导后培养时间增加,低浓度诱导组低于标准浓度诱导组,组间差异有统计学意义(P<0.05),G_0/G_1期细胞比例诱导后较对照组显著减少(P<0.05);β-MHC和CTNT在诱导后表达开始增强,在第6周时均达到高峰,第8周时表达开始衰减,Bcl-2、Bax基因表达呈时间依赖性变化。结论hMSCs在体外经纯化、扩增和诱导后可表现心肌样细胞的生物学特性,但诱导过程中hMSCs发生细胞凋亡,采用2.5μmol/L 5-Aza低浓度诱导可减少细胞凋亡发生。     

人骨髓间充质干细胞体外分化为肝细胞样细胞

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养及特异性诱导为肝细胞样细胞的能力。方法 骨髓标本来源于健康志愿者的胸骨,年龄2～35岁,采用淋巴细胞分离液(密度1.077)分离人MSCs,并分别采用HGF、FGF4、HGF FGF4以及无生长因子四种处理因素体外诱导第三代人MSC向肝细胞样细胞分化。通过流式细胞术分析鉴定.MSCs的纯度,于诱导培养的0、7、14、21、28天时留取细胞检测CK18、AFP和白蛋白的表达情况,同时进行糖原染色验证细胞功能。结果 用淋巴细胞分离液分离出的人MSCs纯度可达90％,采用HGF、FGF4及HGF FGF4三种处理因素均可在体外诱导人MSCs特异分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的细胞。结论 人MSCs能在体外扩增并定向诱导为肝细胞样细胞。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(hMSC)体外定向诱导可否分化为神经元样细胞。方法 Percoll分离液离心分离hMSC，体外扩增，采用两种方法：①含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24小时，甲氧酚(BHA)和二甲亚枫(DMSO)联合诱导6小时；②2-巯基乙醇(2-ME)预诱导24小时，BHA和DMSO诱导6小时。免疫组化检测神经元样细胞表达神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果 hMSC在体外扩增传至5代后，流式细胞仪显示hMSC表面抗原CD29、CD44、CD90表达阳性率分别为99．5％，97．8％，98．8％。采用两种方法诱导hMSC后，胞体收缩，突起伸出，较密的部分神经元拉成网状；免疫组化显示诱导的神经元样细胞能特异性表达NSE、NF，不表达GFAP。结论 成人骨髓hMSC在体外可以分化为神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞的培养及低氧条件对其影响

目的 骨髓间充质干细胞(BMMSC)的体外培养和低氧对于BMMSC增殖作用的影响.方法 成年雄性SD大鼠断颈处死后于75％酒精中浸泡5 min.用全骨髓贴壁法培养细胞,选取生长状态良好的第3代细胞进行鉴定.以单克隆抗体CD45、CD90行流式细胞术鉴定大鼠BMMSC.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定第3代BMMSC以及低氧处理的第3代BMMSC的增殖情况.结果 用全骨髓贴壁法分离并培养SD大鼠BMMSC;流式细胞仪检测显示:第3代BMMSC表面特异性标志CD90表达率为96.0％,而非BMMSC表面标志CD45仅为2.5％.MTT结果显示低氧条件下的BMMSC比常氧条件下增殖速率高,并且光镜下观察到细胞状态均一,折光性更好.结论 用全骨髓贴壁法可以在体外分离、培养出纯度较高的SD大鼠来源BMMSC,低氧环境可以刺激BMMSC的增殖.     

系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞多向分化能力异常

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者骨髓间充质干细胞(MSCs)多向分化能力是否存在异常. 方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养MSCs,定向诱导骨髓MSCs向脂肪和成骨细胞分化,脂肪细胞经油红O染色鉴定并定量,成骨细胞经茜素红S染色鉴定.将骨髓MSCs与羟基磷灰石共孵育,将共孵育物植于裸鼠皮下,8周后常规苏木素-伊红(HE)染色.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(PPARγ-2)、脂蛋白酶(LPL)、Runx2/CBFA1、降钙素(osteocalcin) mRNA的表达水平.结果 SLE骨髓MSCs分化成脂肪细胞比例低于健康埘照组,油红O染色定量低于健康对照组[(35±7)%与(80±5)%],(0.14±0.04与0.27±0.04),LPL mRNA表达低于健康对照组(0.369±0.020与0.481±0.038),两组PPARγ-2 mRNA表达差异无统计学意义(0.421±0.052与0.441±0.012).SLE骨髓MSCs分化成骨细胞后形成钙结节低于健康对照组[(35±4)%与(45±4)%],Runx2/CBFA1、osteocalcin mRNA表达低于健康对照组(0.371±0.000与0.563±0.069),(0.819±0.023与0.962±0.049);羟基磷灰石与SLE患者骨髓MSCs共孵育后移植裸鼠皮下8周后,成骨细胞形成明显少于健康埘照组. 结论 SLE骨髓MSCs成脂和成骨分化能力存在异常,提示SLE患者骨髓MSCs存在缺陷.     

体外增殖培养的骨髓间充质干细胞移植后在脑梗死大鼠脑内的存活

目的观察应用维生素C（Vc）和碱性成纤维因子（bFGF）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖培养,移植到脑梗死大鼠体内后,在脑内的存活情况。方法①采用密度梯度离心及贴壁法分离大鼠BMSCs。按培养液中加入的不同因子分为4组：对照组、Vc组（50μg/m1）、bFGF组（1μg/L）以及Vc＋bFGF组（50μg/ml Vc和1μg/L bFGF）,在体外对BMSCs进行培养并观察各组细胞的增殖情况。采用MT丁比色法分别于培养第1、2、3、5和7天,测定细胞在450nm波长处的吸光度（A）值;采用流式细胞仪检测培养96h后的细胞周期。②采用线栓法制备20只大鼠右侧大脑中动脉闭塞2h模型,并随机分为2组：联合Vc＋bFGF培养的BMSCs移植组（10只）和对照BMSCs移植组（10只）。将相应组别的BMSCs细胞移植人脑梗死24h后的大鼠体内。分别于移植后第1、2和3周,制备大鼠脑组织切片并行BrdU免疫组化染色。结果①形态学观察显示,Vc＋bFGF组的BMSCs增殖最快,对照组则相对缓慢。②各组细胞的A值于培养第2天开始增加,Vc组和bFGF组在第3天达到高峰（F=728．52和F=197．18,P〈0．05）,Vc＋bFGF组在第5天达到高峰（F=1771．32,P〈0．05）,第7天均有所下降。第2天起,bFGF组、Vc组与bFGF＋Vc组的A值均高于对照组;第3天起,Vc＋bFGF组高于Vc组与bFGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。③Vc组、bFGF组与Vc＋bFGF组细胞处于增殖期（s＋G2＋M期）的百分比均较对照组高,差异有统计学意义（P〈0．05）。④BMSCs移植后第2周,联合Vc＋bFGF培养的BMSCs移植组大鼠脑组织切片中BrdU阳性细胞计数较对照组高;第3周两组阳性细胞计数均有下降,但前者仍较后者高。差异均有统计学意义（P〈0．01）;Brdu阳性细胞主要分布在梗死灶周围。结论Vc与bFGF均可促进大鼠BMSCs的增殖,二者联用较单用其一的效果更好;脑梗死大鼠移植增殖培养后的BMSCs,其在脑组织中的成活能力明显增强。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法获取成年大鼠胫骨干骨髓,采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代,观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。结果大鼠骨髓基质细胞贴壁呈集落生长,5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞。结论骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞,为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。     

细胞间接触诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞

目的体外诱导骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞,探讨已分化成熟的平滑肌细胞及细胞因子对骨髓间质干细胞分化的影响。方法分别用骨髓间质干细胞加平滑肌细胞条件培养液;骨髓间质干细胞与平滑肌细胞分层培养;骨髓间质干细胞EGFP标记后,与平滑肌细胞混合培养。用平滑肌细胞抗体SM-a-Actin、Calponin免疫荧光染色,检测骨髓间质干细胞的分化情况。结果骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养7d后免疫荧光染色,可见EGFP(绿色)和抗SM-a-Actin、Calponin(红色)的双标细胞存在。而加平滑肌细胞条件培养液与分层培养组,骨髓间质干细胞均不表达Calponin。结论细胞间直接接触对诱导骨髓间质干细胞定向分化为平滑肌细胞起决定作用。