反义寡核苷酸治疗脑胶质瘤的研究进展

本文从癌基因、生长因子及其受体基因、细胞信号传导系统以及细胞周期调节物等几个方面,综述了反义寡核苷酸在治疗人类恶性脑胶质瘤中体外试验和动物模型研究的最新进展。     

MGMT VEGF在脑胶质瘤中的表达及临床意义分析

目的分析MGMT、VEGF在脑胶质瘤中的表达及临床意义。方法 270例脑胶质瘤患者为肿瘤组,行颅脑外伤手术治疗的250例患者为对照组。取肿瘤组患者脑胶质瘤标本及对照组正常脑组织标本,检测MGMT、VEGF的阳性表达率。同时,统计并对比分析肿瘤组患者不同病理分级、肿瘤类型生存质量及预后下MGMT和VEGF的阳性表达率。结果肿瘤组患者MGMT和VEGF的阳性表达率依次为68.52%、77.78%,对照组依次为12%、28%,2组比较差异具有统计学意义(P0.05)。肿瘤组患者在MGMT和VEGF的阳性表达率上,高级别胶质瘤组患者高于低级别胶质瘤组(P0.05);KPS≤70分组患者高于KPS≤70分组(P0.05);术后12个月内死亡组患者高于术后12个月后存活组(P0.05)。而不同类型胶质瘤组患者中,MGMT和VEGF的阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论 MGMT、VEGF的表达与脑胶质瘤的发生、发展密切相关,可作为脑胶质瘤治疗效果评价、病情判断及生存质量、预后评估的重要参考依据。     

肝细胞生长因子受体反义寡核苷酸对胶质瘤细胞的作用

近期的研究认为肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)及其受体c-Met信号通路的激活对肿瘤发生、生长和侵袭起着关键的作用,而选择性地阻滞肿瘤细胞的信号通路,控制肿瘤的增殖和侵袭是当前的研究热点,这也是研究肿瘤信号通     

反义IGF-1基因治疗C6鼠脑胶质瘤的体内实验研究

目的 明确IGF－1在脑肿瘤发生发展中的作用并为基因治疗优选靶的。方法 采用Wistar大鼠C6脑胶质瘤模型进行反义IGF－1基因治疗,通过MRI及病理活检等手段。动态观察,分析各时限治疗组与对照组动物（每组10只）肿瘤的判别,结果（1）颅内种植肿瘤后,反义治疗组肿瘤不断 减小至8周后几乎完全消失,动物生存期超过80天的观察期,对照组均因肿瘤增大在2周期前后死亡;（2）治疗组肿瘤相对于同时限对照组者凋亡细胞,淋巴细胞浸润增加,IGF－1表达,细胞增殖活性有所下降,结论反义IGF－1基因治疗能有效抑制大鼠体内胶质瘤的恶性进展,IGF－1表达减少使用细胞增殖活性下降和免疫系统攻击增强可能是治疗组肿瘤消失的双重原因。     

血管内皮生长因子反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用的研究

目的探讨VEGF反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用。方法用Lipofectamine介导的方法将VEGF反义eDNA转染入C6鼠胶质瘤细胞系,观察其对细胞增殖和凋亡的影响。结果在体外VEGF反义RNA可有效抑制C6鼠胶质瘤细胞内源性VEGFmRNA和VEGF蛋白的产生,但对细胞增殖和凋亡无明显影响。结论采用VEGF反义RNA可能成为抗血管形成肿瘤治疗的新策略之一。     

IGF-IR反义寡核苷酸对胶质瘤细胞增殖的影响

目的 根据胰岛素样生长因子-受体（IGF-IR）基因序列设计了IGF-IR mRNA起始密码子下游的硫代磷酸型反义寡核苷酸和正义寡核苷酸，研究其对C6胶质瘤细胞增殖作用。方法 实验分为反义核酸组、正义核酸组和空白对照组，经细胞计数、MTT法研究反义核苷酸对胶质瘤细胞生长和增殖的抑制作用。并应用免疫细胞化学方法检测胶质瘤细胞IGF-IR和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达。结果 反义寡核苷酸能有效地降低IGF-IR基因的表达，抑制体外培养的胶质瘤细胞的增殖，其抑制作用24h显效，96h仍有作用，反义寡核苷酸的抑制效果与其作用浓度有关。而正义寡核苷酸对其无抑制作用。同时可见反义寡核苷酸抑制增殖作用中，能明显下调PCNA蛋白的表达。结论 IGF-IR介导的IGF-I-IGF-IR的自（旁）分泌环对胶质瘤生长极其重要，通过IGF-IR反义寡核苷酸治疗能较有效地抑制胶质瘤细胞的增殖。     

EphB4反义寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的作用

目的观察EphB4反义寡核苷酸(ASODN)对人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响,探讨EphB4的生物学功能。方法人工合成EphB4 ASODN,脂质体转染U87细胞。分别应用RT-PCR以及免疫组织化学染色方法检测EphB4 mRNA和蛋白质,评估阻抑效应;并应用MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡;采用Boyden侵袭小室法检测细胞迁移和侵袭力。结果(1)由脂质体转染的EphB4 ASODN对U87细胞EphB4 mRNA和蛋白质表达具有不同程度的抑制作用,且呈现一定的时间-剂量依赖性,600nmol/LASODN作用于U87细胞72h,EphB4 mRNA相对表达量为0.30±0.05,EphB4蛋白表达水平亦明显减弱。(2)各实验组EphB4 ASODN对U87细胞增殖均具有抑制作用,呈明显时间-剂量依赖性;以600nmol/LASODN作用72h,U87细胞生长抑制率达到68.70%,而对照组则无明显抑制作用。(3)EphB4 ASODN诱导U87细胞凋亡呈剂量依赖性。(4)EphB4 ASODN组U87细胞的跨膜数为17.82±2.35,与空白对照组及NSODN组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论EphB4在人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭过程中发挥重要作用,可能成为脑胶质瘤基因治疗的一个新靶点。     

VEGF及PCNA表达与脑胶质瘤分级的相关性研究

目的　研究血管内皮细胞生长因子 (VEGF)与增殖性细胞核抗原 (PCNA)蛋白在各级脑胶质瘤中的表达率及与胶质瘤病理分级的关系。方法　利用免疫组化方法检测 4 5例胶质瘤手术标本中VEGF与PCNA蛋白的表达水平 ,并比较二者的相关性。结果　随着胶质瘤病理级别的升高 ,VEGF及PCNA的表达率渐之升高 ,Ⅰ Ⅳ级病理分组中 ,VEGF阳性率分别为 2 2 .2 9± 7.6 4 ,5 3.75± 10 .74 ,70 .2 7± 14 .2 7,PCNA阳性率分别为 15 .86± 4 .5 5 ,32 .4 1± 7.4 4 ,4 7.92± 10 .31,且并各级之间有显著差异 (P <0 .0 5 )。结论　VEGF与PCNA蛋白的表达对判断胶质瘤病理分级及生物学行为有一定意义。     

PDGF B链反义寡核苷酸对脑膜瘤培养细胞生长影响的研究

目的　探讨阻断血小板源生长因子 (PDGF)B链表达对脑膜瘤细胞生长的影响。方法　在体外进行脑膜瘤细胞培养 ,观察转染PDGFB链反义寡核苷酸对脑膜瘤培养细胞生长的影响。结果　PDGFB链反义寡核苷酸能够阻断脑膜瘤培养细胞表达PDGFB链 ,转染后细胞增殖活性减弱 ,细胞生长受到抑制。结论　PDGFB链可作为脑膜瘤基因治疗的靶点     

脑胶质瘤P53,PKC,VEGF的表达及与预后关系

目的 了解脑胶质瘤中Ｐ５３、ＰＫＣ、ＶＥＧＦ阳性表达与脑胶质瘤分级和预后的关系。方法 采用免疫组化ＳＡＢＣ法观察Ｐ５３、ＰＫＣ、ＶＥＧＦ在脑胶质瘤中的表达;同时,随访了解患者生存情况。结果Ｐ５３、ＰＫＣ、ＶＥＧＦ在ＢＧ、ＭＧ、ＨＭＧ三组中都有不同程度的表达,而且,随着病理分级的增加,其表达率也逐渐增加,但各组间缺乏统计学差异,三者表达在脑胶质瘤中的意义有待进一步宗病例的分析。Ｐ５３、ＰＫＣ、ＶＥＧ     

三链形成寡核苷酸对大鼠脑胶质瘤生长和血管生成影响的研究

目的观察原位注射血小板源生长因子(PDGF)B链基因(PDGF-B)的三链形成寡核苷酸(TFO)对大鼠脑胶质瘤生长和血管生成的抑制作用。方法实验大鼠18只均在立体定向导引下行右尾状核区微量灌注1×106C6胶质瘤细胞,其中实验Ⅰ和Ⅱ组在细胞接种后第8d开始分别原位注射TFO1.5mg/20μl和3.0mg/20μl的生理盐水,以后每隔72h原位注射相同剂量的TFO,共注射3次。对照组仅在相同时间原位注射20μl生理盐水。实验3周时处死所有的大鼠,观察肿瘤的生长情况,观察肿瘤PDGF-B的表达、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤核增殖抗原(PCNA)表达。结果实验Ⅰ组的成瘤抑制率为66.0%,实验Ⅱ组为92.2%,两组比较差异有极显著性(P<0.01)。TFO对C6胶质瘤细胞PDGF-B、VEGF、PCNA表达有明显的抑制作用;原位应用TFO能抑制PDGF-B表达,使胶质瘤细胞增殖能力降低,抑制血管生成。结论TFO抑制肿瘤生长与抑制胶质瘤细胞增殖及抑制血管生成有关。     

脑室注射反义寡核苷酸对大鼠Nogo-A mRNA及其蛋白表达的影响

目的研究侧脑室注射NogoA反义寡核苷酸对大鼠大脑皮质NogoAmRNA及其蛋白表达的影响。方法成年Wistar大鼠53只,分为A组(对照组)、B组及C组,后2组分别经侧脑室注射随机序列寡核苷酸及NogoA反义寡核苷酸,在注射后12、24、48及72h用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和免疫组织化学方法分别检测大脑皮质NogoAmRNA及其蛋白表达的变化。结果NogoAmRNA及其蛋白表达在脑室注射NogoA反义寡核苷酸后12h开始下降,24h降至最低,48h开始回升,72h恢复正常。结论脑室注射NogoA反义寡核苷酸能抑制NogoAmRNA及其蛋白的表达,且可能成为中枢神经损伤后再生的新措施。     

包裹反义寡核苷酸的BCA纳米粒抑制C6脑胶质瘤细胞生长的实验研究

目的 优化制备包裹反义寡核苷酸(ASODN)的α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA)纳米粒,观察其C6脑胶质瘤细胞的生长抑制作用.方法 以BCA为载体材料,采用界面聚合法制备包裹ASODN的纳米粒(ASODN in NP),并将其转染至C6脑胶质瘤细胞;倒置显微镜下观察游离ASODN组、ASODN in NP组、吸附ASODN纳米粒组和空白纳米粒组转染C6脑胶质瘤细胞后的细胞生长状态,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期变化,采用CCK-8法测定ASODN in NP对细胞毒性和细胞增殖的影响.结果 与空白对照组相比,除空白纳米粒组外,其他各组转染后的C6脑胶质瘤细胞形态均发生改变,细胞失去原有的贴壁特性,生长密度降低.生长状态变差,其中以ASODN in NP组最为明显,呈时间依赖性;各组细胞周期均发生变化,表现为G1期细胞比例明显增高,S期细胞比例减少,其中ASODN in NP组最为显著(P<0.05);除空白纳米粒组外,各纳米粒组对细胞增殖的抑制效应随ASODN相对终浓度的增加而增加,呈现浓度依赖性特征,其中ASODN in NP组抑制效应显著优于其他各组(P<0.05).结论 ASODN in NP转染C6脑胶质瘤细胞后能有效抑制细胞增殖及改变细胞周期,对胶质瘤细胞生长有明显抑制作用.     

反义/正义VEGF164cDNA真核表达载体的构建及转染C6胶质瘤细胞

血管化是神经胶质瘤微生态系统重构其营养联系的一种表现，其中VEGF具有重要作用．而获得来源于同一细胞系又有不同VEGF表达水平的细胞株，不仅对研究肿瘤血管生成机制具有重要作用，而且也有助于抗肿瘤血管生成药物的开发。     

p16基因对脑胶质瘤细胞生长及放射敏感性的影响

目的探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系.方法将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6,筛选阳性克隆.同时以空载体质粒为对照,免疫组化检测p16基因表达,用MTT法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率.结果转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达,克隆形成率减少,生长速度明显减慢,对辐射的敏感性增强.结论导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,提高胶质瘤细胞对辐射的敏感性.     

VEGF及CTGF的表达与脑胶质瘤分级的相关性研究

目的通过检测脑胶质瘤患者肿瘤组织中血管内皮生长因子和结缔组织生长因子的表达水平,探讨其和肿瘤级别的关系及作用机制。方法应用免疫组化SP法检测49例胶质瘤手术标本中的VEGF和CTGF的表达水平,统计分析表达水平和肿瘤级别之间的关系。结果VEGF和CTGF在胶质瘤高级别组（Ⅲ-Ⅳ级）中的表达均明显高于低级别组（Ⅰ-Ⅱ级）,说明随着肿瘤级别的升高VEGF和CTGF表达也增强。结论VEGF和CTGF在胶质瘤组织中高表达,而且表达水平和恶性程度有密切联系。VEGF和CTGF的检测可作为胶质瘤恶性程度判断的参考,为从基因水平上探讨胶质瘤的生物学行为、预后及治疗提供新的思路。     

表皮生长因子受体反义RNA联合伽玛刀治疗对胶质瘤细胞生长抑制作用的研究

人表皮生长因子受体(vascularendothelial growth factor,EGFR)的扩增、过表达和突变在胶质瘤的发生、发展中起重要作用,是恶性胶质瘤的重要责任基因之一。针对EGFR传导通路的干预治疗及其与放疗联     

c—fos反义寡核苷酸对谷氨酸诱导PC12及海马神经元凋亡的影响

目的：探讨反义寡核苷酸c-fos对谷氨酸诱导培养的海马神经元及PC12凋亡的影响。方法：应用TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labeling)法和免疫细胞学方法检测了c-fos反义寡核苷酸对谷氨酸诱导原代培养的海马神经元及PC12细胞凋亡以及对凋亡蛋白Bax表达的影响。结果：与对照组相比,c-fos反义寡核苷酸谷氨酸谷氨酸诱导原供培养的海马神经元及PC12细胞的凋亡率减少和凋亡蛋白Bax表达量下降,差异有显著意义,结论：c-fos反义寡核苷酸对谷氨酸诱导的细胞凋亡有保护作用。     

细胞周期相关蛋白的表达及其DNA含量分析对脑胶质瘤手术边界的判定意义

一、材料与方法13例脑胶质瘤手术标本,共计39个不同部位(肿瘤中心,边缘及周边组织)应用激光扫描细胞分析仪(LSC)将手术组织标本涂片PI染色后,用于细胞周期和DNA含量分析。术后用同一标本进行免疫组化方法对p53蛋白,细胞周期蛋白的表达进行分析。二、结果1.细胞周期及DNA含量测定,其不同部位的倍体分布和DNA指数不尽相同。2.不同部位的胶质瘤细胞周期相关蛋白,cyclinB1,cyclinD1,p53蛋白表达的阳性率不同。三、讨论Cyclins及其激活的p53在控制细胞周期进程的过程中起重要作用。Cyclins表达水平能够提供肿瘤增值的信息,而Cyclins和p53…     

NUSAP1在脑胶质瘤中的表达以及对胶质瘤细胞LN229功能的影响

目的探讨核仁纺锤体相关蛋白1(NUSAP1)在脑胶质瘤样本的高表达,以及沉默NUSAP1对胶质瘤细胞系LN229细胞功能的影响。方法收集南京医科大学附属脑科医院30例胶质瘤手术标本以及10例癫痫病灶手术样本,采用荧光实时定量(qRT-PCR)和Western blot技术检测40例样本中NUSAP1的表达情况,用lentivirus和siRNA干扰LN229细胞系中NUSAP1表达后,采用CCK-8法、流式细胞仪法检测其对细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。结果 NUSAP1在胶质瘤组表达量明显高于癫痫组(对照)。NUSAP1表达被干扰后。脑胶质细胞LN229功能降低。结论 NUSAP1在脑胶质瘤中高表达,干扰其在LN229细胞株表达后,LN229增殖能力下降,细胞G2/M期停滞。提示NUSAP1可能成为一个新的胶质瘤治疗靶点。