肝癌组织ｍｉＲ-１２２的表达及其与细胞周期调控的关系

目的　探讨肝癌组织ｍｉＲ-１２２的表达及其与肝癌细胞周期调控的关系。方法　采用原位杂交法检测２６例肝癌组织ｍｉＲ-１２２的表达。用流式细胞仪检测肝癌细胞周期。结果　肝癌组织ｍｉＲ-１２２阳性表达率为２６.９２％,而癌旁组织为８０.７７％,两组之间差异有统计学意义（Ｐ＜０.０１）。与癌旁组织相比,肝癌细胞Ｓ期比例升高,Ｇ_１-Ｇ_０期比例降低（Ｐ＜０.０５）;与ｍｉＲ １２２阳性组比较,ｍｉＲ-１２２阴性组肝癌细胞Ｓ期比例升高,Ｇ_１-Ｇ_０期细胞比例亦降低（Ｐ＜０.０１）。结论　肝癌细胞ｍｉＲ-１２２的表达下调,促进癌细胞的分裂,使癌细胞具有更强的增殖、侵袭和转移的能力。     

血清miR-122和miR-570联合检测对原发性肝癌的临床诊断价值

目的:检测原发性肝癌(PHC)患者血清中miR-122和miR-570的表达水平及临床应用价值。方法:选择2017年2月至2019年1月我院收治的30例原发性肝癌患者作为研究组,选择我院同期30例健康体检者为对照组。采用实时荧光定量PCR方法检测血清miR-122和miR-570的表达水平,利用受试者工作特征曲线评估血清miR-122和miR-570的诊断效能。结果:miR-122和miR-570在原发性肝癌患者血清的表达水平显著低于健康对照者的表达水平,差异具有统计学意义（均P<0.01）;miR-122表达水平与原发性肝癌TNM分期、病理分级、原发性肝癌远处转移程度呈负相关（P<0.05）,miR-570表达水平与原发性肝癌TNM分期、病理分级、原发性肝癌远处转移程度无相关性;miR-122诊断原发性肝癌的AUC为0.816,敏感度为80.5%,特异度为 90.1%;miR-570诊断原发性肝癌的AUC为0.862,敏感度为83.3%,特异性为90.0%;联合血清miR-122和miR-570诊断原发性肝癌的AUC为0.903,敏感性为90.0%,特异性为83.6%。结论:原发性肝癌患者血清miR-122和miR-570降低,血清miR-122表达水平与原发性肝癌TNM分期、病理分级、原发性肝癌远处转移程度呈负相关,联合检测血清miR-122和miR-570对于原发性肝癌的检出具有较高的参考价值。     

肝癌介入治疗中血清miR-122表达及其临床意义探讨

目的:研究肝癌患者血清miR-122在介入治疗过程中的表达及其临床意义。方法:提取血清中总RNA,利用荧光定量PCR方法检测29例肝癌患者血清中miR-122在肝动脉灌注栓塞(TACE)治疗前、后的表达情况。SPSS 16.0软件进行统计分析。结果:在29例肝癌患者血清中,介入治疗前后两次抽血平均间隔为8d,miR-122的表达水平在介入治疗后较介入治疗前有所降低,为治疗前的0.75倍(0.69～0.80倍),差异具有统计学意义,t=-2.326,P=0.027。29例肝癌患者介入治疗前血清miR-122的表达水平与年龄(t=-2.061,P=0.049)、AFP(t=3.370,P=0.002)和肿瘤直径(t=-2.077,P=0.047)显著相关,而与性别、巴塞罗那分期、Child-Puge分期、复发和多发因素均无关,P>0.05。结论:TACE治疗可引起肝癌患者血清中miR-122的表达降低,且miR-122的表达与患者年龄、血清中AFP的水平和肿瘤直径密切相关。     

肝细胞癌中miR-122的表达及其与血清AFP水平的关系

目的 探讨miR-122在肝细胞癌（肝癌）中的表达水平及其与血清AFP水平的关系。方法 用荧光定量PCR分别检测78例肝癌患者肝癌组织中miR-122的表达水平,电化学发光免疫分析法检测肝癌患者术前血清AFP水平,分析miR-122表达与血清AFP水平的关系。结果78例肝癌患者肿瘤组织miR-122的相对表达量为（23.71±13.33）％,其中高、中分化组织为（26.90±13.64）％,明显高于低分化者的（16.54±9.40）％（P=0.001）。78例肝癌患者血清AFP平均值为（741±382）ng／ml。miR-122表达与性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤大小、血管浸润、分期等无关,miR-122在肝癌和癌旁组织中的表达与血清AFP水平呈负相关（r=-0.863,P＜0.01）。结论 miR-122表达与血清AFP水平呈负相关,在低分化肝癌中表达更低,提示miR-122是肝癌的一个潜在预后因子。     

瑞戈非尼通过miR-122调控人肝癌SMMC-7721细胞的增殖和凋亡

目的:探究瑞戈非尼(regorafenib,Rego)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响及其可能的机制.方法:将SMMC-7721细胞分为对照组及Rego组,分别用0、10 μmol/L Rego处理48 h后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,qPCR检测细胞中miR-122的表达.采用脂质体转染的方法将合成...     

miR-200a在肝癌干细胞中的差异表达及其作用

目的:分离肝癌细胞系MHCC97-H中肝癌干细胞并分析miR-200a在肝癌干细胞和非肝癌干细胞亚群中的表达差异,探讨miR-200a的表达水平与肝癌干细胞之间的关系.方法:利用流式细胞荧光激活分选法从MHCC97-H中分选出肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)和非肝癌干细胞(non-liver canc-er stem cells,non-LCSCs)两个亚群;采用real-time PCR检测miR-200a在两个亚群中的表达差异;在MH-CC97-H中瞬时转染miR-200a-mimic,检测LCSCs亚群比例的变化.结果:LCSCs亚群占总体细胞的百分比为3.56％;LCSCs亚群细胞中miR-200a的表达明显低于non-LCSCs亚群(P＜0.05);上调miR-200a后LCSCs亚群细胞比例为1.24％.结论:miR-200a在LCSCs亚群细胞中明显低表达,上调miR-200a后LCSCs亚群细胞比例明显降低,提示miR-200a能够调控肝癌干细胞的比例.通过调控miR-200a的表达,可以降低LCSCs亚群细胞比例,从而为肝癌的治疗提供新的思路.     

LDR-qPCR法检测miRNA122a的表达及其与乳腺癌雌激素调控的关系

目的建立一种新的基于连接酶依赖性反应的miR-122a实时定量PCR检测方法 (LDR-qPCR);研究乳腺癌细胞MCF-7中miR-122a的表达以及雌激素水平对其的影响。方法以乳腺癌细胞MCF-7为样本、成熟的miR-122a为检测对象,将探针的连接反应和实时荧光定量PCR技术相结合,建立LDR-qPCR法,并开展方法学评价以及不同(有或无激素)培养环境下miR-122a的表达分析。结果 LDR-qPCR法的扩增产物特异,经测序证实为miR-122a;LDR-qPCR法重复性好(cv<10%);检测下限为5pg/μL总RNA,比茎环RT-qPCR法(50pg/μL)敏感10倍。miR-122a在激素饥饿的MCF-7细胞中表达上调,约为常规培养细胞的3.65倍;经5nmol/L雌二醇处理后又出现下调(P=0.040),但未回到常规培养细胞水平。结论 LDR-qPCR法特异、灵敏,检测范围宽;乳腺癌细胞MCF-7可表达miR-122a并受雌激素水平的调节。     

miR-96与miR-103在肝癌组织中的表达及其与预后的关系

目的探讨miR-96与miR-103在肝癌组织中的表达及其与预后的关系。方法选取122例肝细胞癌患者作为本研究对象。聚合酶链式反应检测miR-96和miR-103表达水平,采用单因素和多因素Cox回归模型,探讨肝癌患者中位生存时间的危险因素并建立预测模型。结果肝癌组织中miR-96和miR-103相对表达水平均显著高于癌旁正常组织;肝癌组织中miR-96和miR-103的表达与肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期及分化程度均有关(均P<0.05),而与性别、年龄及合并肝硬化等无关(P>0.05);所有患者随访60月,中位生存时间为37.8月。单因素分析结果显示:肝细胞癌患者中位生存时间与肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期、病理分化程度、miR-96和miR-103表达水平差异均有统计学意义(均P<0.05)。多因素分析结果显示:TNM分期为Ⅲ～Ⅳ、低分化、淋巴结转移、miR-96和miR-103高表达是肝癌患者中位生存时间独立危险因素。结论肝癌组织中miR-96和miR-103的高表达是患者预后差的独立影响因素,可作为原发性肝癌患者预后评估指标。     

miR-888在肝癌细胞中的表达水平及作用机制

目的:检测miR-888在肝癌细胞中的表达情况,并进一步在分子水平研究其相关作用机制。方法:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝癌细胞系中miR-888的表达情况;细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法检测miR-888对Huh7细胞活性的影响;平板克隆形成实验、细胞凋亡实验、Transwell实验检测miR-888对Huh7细胞集落形成、细胞凋亡、迁移和侵袭能力的影响;荧光素酶报告检测miR-888与候选基因RB1的靶向关系,qRT-PCR 和免疫印迹实验（Western blotting）检测RB1 mRNA 和pRB蛋白水平的改变。结果:肝癌细胞中miR-888的表达高于正常肝细胞;CCK-8法显示转染miR-888 inhibitors后Huh7细胞在72 h后增殖能力明显低于miR-NC组（P<0.05）;平板克隆形成实验、Transwell实验（迁移和侵袭）显示转染miR-888 inhibitors后Huh7细胞的克隆形成能力、迁移及侵袭能力明显低于miR-NC组（P<0.05）;细胞凋亡实验显示转染miR-888 inhibitors后Huh7细胞的凋亡能力明显高于miR-NC组（P<0.05）;荧光素酶报告实验证实 miR-888可以抑制含有其结合位点的荧光报告基因的活性,而对突变体质粒没有影响。过表达或抑制 miR-888 对 RB1 mRNA 水平无明显影响,但却对其蛋白水平有负性调节作用。结论:miR-888在肝癌细胞中表达升高,可能通过下调RB1表达促进肝癌细胞侵袭和迁移。     

细胞分裂周期7蛋白在肝癌组织的表达及其对肝癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 检测细胞分裂周期7(CDC7)蛋白在人肝癌组织的表达,探讨CDC7过表达对肝癌细胞增殖和侵袭的影响。方法 实时定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测CDC7 mRNA在肝癌组织和癌旁组织的表达,检测CDC7 mRNA在肝癌细胞系和正常肝脏细胞中的表达。Western blot检测CDC7蛋白在肝癌组织和癌旁组织中的表达,检测CDC7蛋白在肝癌细胞系和正常肝脏细胞中的表达水平。利用慢病毒载体构建稳定过表达CDC7的肝癌HCCLM3和SMMC 7721细胞株。细胞克隆实验和CCK-8法检测CDC7过表达对肝癌细胞增殖的影响。Transwell实验和划痕实验检测CDC7过表达对肝癌细胞侵袭迁移的影响。结果 与癌旁组织相比,CDC7 mRNA和蛋白在肝癌组织中表达水平显著升高(P＜0.001);与正常肝细胞相比,肝癌细胞系的CDC7 mRNA和蛋白表达水平显著增高(P＜0.001);CCK-8法、细胞克隆实验说明CDC7过表达会明显增强肝癌细胞的增殖能力;划痕实验、Transwell实验说明CDC7过表达会明显提高肝癌细胞的侵袭能力。结论 CDC7蛋白在人肝癌组织高表达,其过表达促进肝癌细胞的增殖和侵袭能力。     

MiR-122促进原发性肝细胞癌Huh-7细胞凋亡

目的 探讨miR-122对原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞性状的影响。方法 HepG2细胞、Huh-7细胞分别转染miR-122、anti-miR-122,转染Mock组作为阴性对照,分别于转染后24 h、48 h用流式细胞法、TUNEL法检测细胞凋亡及细胞周期。结果 转染后24 h、48 h,转染miR-122、Mock的HepG2细胞两组间细胞凋亡率均无统计学意义(P＞0.05),而在转染后48 h,与Mock组Huh-7细胞相比,转染anti-miR-122的Huh-7细胞凋亡率明显降低(P＜0.05);转染后24 h、48 h,转染miR-122、Mock的HepG₂细胞,各细胞周期组份均无统计学意义(P＞0.05),但于转染后48 h,转染anti-miR-122的Huh-7细胞可见G₀-G₁期细胞明显多于Mock组,S期、G₂-M期细胞则显著少于Mock组(P＜0.05)。结论 miR-122表达水平的下降能够抑制某些HCC细胞如Huh7细胞凋亡,miR-122可能作为一种内源性凋亡调控因子,在肝脏组织中发挥抗肿瘤作用。     

ACCα在肝细胞癌中的表达及对细胞生长的影响

目的  探讨乙酰辅酶A羧化酶α（acetyl CoA carboxylase alpha，ACCα）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC）中的表达及其在HCC细胞生长中的调控作用。 方法 采用qRT-PCR及Western blot法检测30例HCC患者癌组织及其相应癌旁正常组织中ACCα mRNA与蛋白的表达。采用siRNA下调HCC SNU-368细胞中ACCα的表达后，采用MTS法检测细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡情况。结果 qRT-PCR及Western blot结果显示，HCC组织中ACCα mRNA与蛋白表达水平均显著高于癌旁正常组织（3.26±0.81 vs 1.88±0.64，P=0.021；3.41±0.71 vs 1.74±0.54，P=0.019）。下调ACCα表达后，HCC SNU-368细胞的增殖能力降低（P<0.01），细胞周期进程被抑制（P<0.05），细胞凋亡比例增多（P<0.01）。 结论 HCC细胞SNU-368中ACCα表达显著上调，可能通过诱导细胞周期进程并抑制细胞凋亡促进HCC细胞增殖，ACCα可作为HCC治疗的潜在靶点。     

Evaluation of miR-122-regulated suicide gene therapy for hepatocellular carcinoma in an orthotopic mouse model

Objective： Intratumoral administration of adenoviral vector encoding herpes simplex virus （HSV） thymidine kinase （TK） gene （Ad-TK） followed by systemic ganciclovir （GCV） is an effective approach in treating experimental hepatocellular carcinoma （HCC）. However, hepatotoxicity due to unwanted vector spread and suicide gene expression limited the application of this therapy, miR-122 is an abundant, liver-specific microRNA whose expression is decreased in human primary HCC and HCC-derived cell lines. These different expression profiles provide an opportunity to induce tumor-specific gene expression by miR-122 regulation. Methods： By inserting miR-122 target sequences （miR-122T） in the 3＇ untranslated region （UTR） ofTK gene, we constructed adenovirus （Ad） vectors expressing miR-122-regulated TK （Ad-TK-122T） and report genes. After intratumoral administration of Ad vectors into an orthotopic miR-122-deficient HCC mouse model, we observed the miR-122-regulated transgene expression and assessed the antitumor activity and safety of Ad-TK-122T. Results： Insertion of miR-122T specifically down-regulated transgene expression in vitro and selectively protected the miR-122-positive cells from killing by TK/GCV treatment. Insertion of miR-122T led to significant reduction of tansgene expression in the liver without inhibition of its expression in tumors in vivo, resulting in an 11-fold improvement of tumor-specific transgene expression. Intratumoral injection of Ad vectors mediated TK/GCV system led to a vector dosage-dependent regression of tumor. The insertion of miR-122T does not influence the antitumor effects of suicide gene therapy. Whereas mice administrated with Ad-TK showed severe lethal hepatotoxicity at the effective therapeutic dose, no liver damage was found in Ad-TK-122T group. Conclusions： miR-122-regulated TK expression achieved effective anti-tumor effects and increased the safety of intratumoral delivery of adenovirus-mediated TK/GCV gene therapy for miR-122-deficient HCC.     

miR-31和miR-1322在口腔鳞癌中的表达及与细胞增殖的关系

目的:检测微小RNA-31(microRNA-31,miR-31)和微小RNA-1322(microRNA-1322,miR-1322)在口腔鳞癌中的表达特征,分析其临床意义,探讨其与细胞增殖的关系。方法:选取2013年1月至2013年12月我院收治的75例口腔鳞癌患者为研究对象,选取肿瘤组织作为观察组,选取距肿物边缘>3 cm的正常口腔鳞状上皮组织作为对照组,应用实时荧光定量PCR法检测两组中miR-31和miR-1322的表达,应用免疫组化方法检测肿瘤组织中Ki67表达的增殖指数。结果:观察组中miR-31和miR-1322的表达明显高于对照组,观察组中miR-31和miR-1322的表达在不同分化程度、肿物最大径、淋巴结转移及TNM分期的表达中差异有统计学意义。生存分析显示二者的表达与生存时间相关。相关分析显示观察组中miR-31和miR-1322的表达均与增殖指数呈正相关性。结论:口腔鳞癌中miR-31和miR-1322高表达是肿瘤形成的促进因素。miR-31和miR-1322均对细胞增殖有促进作用,检测组织miR-31和miR-1322的表达对判断预后可能有一定价值。     

Serum microRNA-1 and microRNA-122 are prognostic markers in patients with hepatocellular carcinoma

BackgroundThe identification of new biomarkers to predict the aggressiveness of hepatocellular carcinoma (HCC) and supplement the current set of prognosis and treatment algorithms is an important clinical need. Extracellular microRNAs (miRNAs) circulating in the blood are a new class of highly promising disease markers.AimHere we investigated the prognostic potential of miR-1 and miR-122 in sera from patients with HCC.MethodsRNA was extracted from 195 sera of HCC patients and 54 patients with liver cirrhosis, obtained at the time of study enrolment. miR-1 and miR-122 levels were correlated with overall survival (OS), Cancer of the Liver Italian Program (CLIP) score, Barcelona Clinic Liver Cancer stage, clinical chemistry parameters and tumor specific treatment.ResultsPatients with higher miR-1 and miR-122 serum levels showed longer OS than individuals with lower miR-1 and miR-122 serum concentrations (hazard ratio [HR] 0.440, 95% confidence interval [CI] 0.233–0.831, P = 0.011 for miR-1 and HR 0.493, 95% CI 0.254–0.956, P = 0.036 for miR-122, respectively). Serum miR-1 and miR-122 concentrations did not differ significantly between patients with HCC and liver cirrhosis. An age-, sex-, tumor stage and treatment-adjusted multivariate Cox regression analysis revealed that miR-1 serum levels (HR 0.451, 95% CI 0.228–0.856, P = 0.015) were independently associated with OS, whereas serum miR-122 was not. miR-1 serum levels showed no relevant correlation with clinical chemistry liver parameters, whereas serum miR-122 correlated with clinical chemistry parameters of hepatic necroinflammation, liver function and synthetic capacity.ConclusionOur data indicate that serum miR-1 is a new independent parameter of OS in HCC patients and may therefore improve the predictive value of classical HCC staging scores.     

肝癌细胞系HepG2细胞周期与端粒酶活性及HBV复制的关系

背景与目的:大量研究表明端粒酶活性与肿瘤细胞的发生、发展密切相关,而且乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)复制、端粒酶活性高低与细胞周期亦存在相关性。为进一步证实其内在联系,本实验探讨无血清培养、全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,RA)对HBVDNA转染的人肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响以及细胞周期与端粒酶活性、HBV复制状态的关系。方法:分别用RA、无血清培养处理HepG2细胞并与对照组比较。细胞周期用流式细胞仪测定,端粒酶活性用TRAP-PCR-ELISA定量检测,HBVDNA分别用荧光PCR定量检测及斑点杂交半定量检测,HBsAg和HBeAg用ELISA方法定量检测。结果:RA、无血清培养使HepG2细胞生长受抑制,停滞在G0/G1期(RA组、无血清培养组G0/G1期时相百分比分别为68.3%、65.2%),端粒酶活性明显下降(RA组、无血清培养组代表端粒酶活性的吸光度A值分别为0.32、0.41),与对照组(G0/G1期时相百分比为43.1%,代表端粒酶活性吸光度A值为1.34)相比,两者之间有显著性差异(P<0.01);细胞培养液中HBVDNA、HBsAg和HBeAg含量显著增加(RA组分别为4.4×106copies/ml、3.5、19.8;无血清培养组分别为5.1×106copies/ml、3.7、22.5),与对照组(分别为1.2×106copies/ml、1.3、13.4)相比,两者之间有显著性差异(P<0.01)。结论:端粒